固定化谷氨酸脱羧酶转化γ-氨基丁酸的研究

研究卡拉胶制备固定化谷氨酸脱羧酶及转化γ-氨基丁酸(GABA)的最适条件.以本实验室研发的诱导剂对构建的表达谷氨酸脱羧酶(GAD)的基因工程菌进行诱导,并利用卡拉胶对获得的粗酶液进行包埋制备固定化酶,对影响GAD固定化效果和GABA产量的因素进行研究.最佳固定化条件为卡拉胶浓度1.5%,氯化钾浓度3%,硬化时间2 h;转化GABA的最适条件为反应最适pH为3.8～4.3,最适温度为37℃～43℃,将制得的固定化谷氨酸脱羧酶(IGAD)重复使用7次后,催化活力仍保持在最初值的75%;IGAD在最适底物浓度60 mmol/L下反应时间2 h后谷氨酸转化率达99%,利用IGAD进行连续催化反应,最终GABA摩尔转化率为70.98%,晶体得率为91.90%,晶体纯度94.73%.该法具有较好的操作稳定性和较高的底物转化率,为连续化制备γ-氨基丁酸提供参考.     

对固定化大肠杆菌谷氨酸脱羧酶生产γ-氨基丁酸的研究

用海藻酸钠—戊二醛法固定产谷氨酸脱羧酶的大肠杆菌As 1.505细胞,在37℃0.2 MpH 4.0醋酸缓冲液中,能催化L-谷氨酸(glu)裂解为γ-氨基丁酸和二氧化碳(CO_2)。固定化细胞在催化反应过程中由于部分辅酶—磷酸吡哆醛(PLP)的脱落而导致酶活力的下降,因此影响了反复使用。本法将固定化细胞在37℃0.05mM PLP溶液中保温2小时,酶活力便获得100%的恢复。     

层状材料水滑石固定青霉素酰化酶的研究

以层状材料水滑石(LDH)为载体,采用不同酸性氨基酸插层,通过直接吸附和戊二醛交联的方法进行青霉素酰化酶(PGA)的固定.考察了各个因素对固定化酶酶活性的影响,优化了反应条件.制得的固定化酶的表观酶活性达9.67×10-6mol/s,酶活性回收率56.6%.对固定化酶的操作稳定性作了初步探讨.     

固定化粪产碱杆菌青霉素G酰化酶的制备

粪产碱杆菌来源的青霉素G酰化酶通过共价结合在环氧型载体EupergitC上,通过对酶质量浓度、固定化反应时间、pH 值以及反应温度等条件的考察,确定了最优固定化条件：375mg比活力5000U/g的重组粪产碱杆菌青霉素G酰化酶蛋白对应1g载体,最适pH8.0,反应温度30 ℃.反应120h后制得固定化青霉素G酰化酶活力达到220U/g,固定化酶效率为10.7%.该固定化酶可在含饱和乙酸丁酯磷酸缓冲液中彻底水解青霉素G钾盐.经过15批连续水解反应,固定化酶仍保持95%的活力,展现出良好的稳定性.     

磁性壳聚糖微球固定化漆酶的制备及酶学性质研究

以Cerrena sp. HYB07菌株所产漆酶为研究对象,制备磁性Fe_3O_4-壳聚糖固定漆酶.磁性壳聚糖微球固定化漆酶制备的最优条件为:磁性Fe_3O_4纳米颗粒0.4μg·mL~(-1)、戊二醛质量浓度4 mg·mL~(-1)、交联时间12 h、给酶量160 U·mL~(-1)、固定化时间8 h.在此条件下,漆酶固定化率为78.03%,固定化漆酶活力为97.19 U·g~(-1).酶学性质研究表明,固定化漆酶的最适反应pH值为3.0,最适反应温度为45℃.与游离酶相比,固定化漆酶的热稳定性有所提高.固定化漆酶用于蒽醌染料活性亮蓝脱色,具有良好的重复利用性,不仅染料脱色率优于游离酶,且在汞离子存在下也效果显著.     

含5′-磷酸吡哆醛(辅因子)的酶的固定化

辅因子—5′-磷酸吡哆醛(Pyridoxal phosphate简称PLP)在酶促反应中具有重要的作用。Weetall和Ikeda等分别用PLP与琼脂糖联接进行固定化各种含PLP的酶和直接用琼脂糖来固定化含PLP的酶的研究。本文在前文的基础上,把固定化PLP用于谷氨酸脱羧酶及谷丙转氨酶的固定化,并对其结构功能的相互关系进行探讨。     

固定化酵母原生质体的研究

本文在固定酵母细胞的基础上,进一步对固定化酵母原生质体进行了初步研究.结果使产酯能力比固定化完整细跑高0.6倍.固定化原生质体经5次重复利用后其产酯性能仍为起始产酯能力的96％.     

海藻酸钠-聚谷氨酸凝胶树脂对重金属吸附性能的研究

聚谷氨酸是一种含有大量自由羧基的多肽类物质,具有与重金属阳离子配位的能力,理论上可用于含重金属废水的处理.本研究通过固定化技术将聚谷氨酸包埋于海藻酸钠中制得复合凝胶树脂,实现对重金属铅、镉的高效吸附.采用傅立叶红外光谱仪(FT-IR)和扫描电子显微镜(SEM)对复合树脂进行表征:验证了聚谷氨酸的固定,推测了复合树脂的吸附机理.Langmuir热力学模型拟合得到树脂对Pb2+、Cd2+的饱和吸附量分别为243.90和122.34mg·g-1.树脂经稀盐酸洗脱可再生,吸附效率保持良好,具有处理含重金属废水的应用价值.     

甲基丙烯酸-苯乙烯-顺丁烯二酸酐三元共聚物固定葡萄糖淀粉酶

利用自由基沉淀聚合反应合成了不同组成的、具有可逆溶解-沉淀性能的甲基丙烯酸-苯乙烯-顺丁烯二酸酐三元共聚物载体,并测定了其临界pH值(2.47～3.51).利用载体上的酸酐基团固定葡萄糖淀粉酶,得到了具有液相酶和固相酶两者优点的固定化酶.考察了单体组成、固定化反应时间对固定化酶酶活的影响和可回收利用性.固定化酶(湿)酶活可达2 347 u/g,经溶解-沉淀循环3次回收后的固定化酶酶活可保留73%.     

芦笋雌雄性别间同工酶酶谱的比较分析

采用聚丙烯酰胺不连续垂直平板凝胶电泳(PAGE)技术,对芦笋雌雄株叶片中的过氧化物酶(POD)、酯酶(EST)、谷氨酸脱氢酶(GDH)和淀粉酶(AMY)同工酶进行了比较分析.结果表明,芦笋雌株与雄株之间的过氧化物酶及酯酶同工酶酶谱存在显著差异,过氧化物酶在雄株中比在雌株中多了Rf值为0.86的一条酶带;酯酶在雄株中多了Rf值为0.18和0.30的两条酶带.谷氨酸脱氢酶和淀粉酶在雌雄株间具有相同的酶谱带,没有表现出性别差异.     

固定化细胞法生产L—苹果酸

L—苹果酸是人体必需的一种有机酸。其制取方法有:(1)从果汁中提取;(2)化学合成DL—苹果酸,再经拆分制得;(3)发酵法。随着固定化酶技术的发展,日本利用聚丙烯酰胺凝胶包埋含有延胡索酸酶的产氨杆菌,制成固定化细胞,实现了L—苹果酸的连续、高效、廉价的工业化生产。其反应式为:     

抗噬菌体谷氨酸生产菌的选育——细胞融合技术在细菌育种方面的应用

本文利用紫外线诱变的方法获得了抗噬菌体谷氨酸生产菌株.为提高抗噬菌体菌株的产量,作者对谷氨酸生产菌进行了属间融合试验,结果获得了产酸为5.8—6.0％的抗噬菌体谷氨酸生产菌.在适量青霉素存在下可获得99.9％的原生质体。选用最佳条件再生率达20％。在选择培养基上获得融合子,其融合率达1.15×10~(-(?))量级,其中具噬菌体抗性的菌株占22.2％.     

多孔陶瓷和浮石载体固定化重组大肠杆菌表达β-葡聚糖酶

分别以多孔陶瓷和浮石为载体吸附法固定重组大肠杆菌(Escherichia coli JM 109-pLF3)表达β-葡聚糖酶.研究了载体量、转速、温度、pH等条件对固定化细胞产酶的影响.结果表明,以多孔陶瓷和浮石为载体固定化细胞发酵可以大大提高产酶效率,二者均可有效吸附重组大肠杆菌,发酵液的酶活分别达到97 U/mL和73 U/mL,比悬浮液体发酵提高了2~3倍;载体量、转速、温度对产酶的影响较大,多孔陶瓷和浮石的最佳装载量分别为20 g/100 mL培养基和8g/100 mL培养基,最佳转速为200 r/min,最佳培养温度为37℃;发酵液pH值对细胞产酶的影响较小,pH值6.0~8.0之间发酵液的酶活力变化不大.重复批次发酵结果表明,固定化发酵具有良好的重复使用能力,在连续10批次实验中,多孔陶瓷载体和浮石载体固定化发酵的酶活力分别不低于91 U/mL和72 U/mL.     

腐牛乳中产β-半乳糖苷酶酵母菌菌株的分离和筛选以及该酶的提纯与固定化

从腐牛乳中分离筛选出一产β-半乳糖苷酶(E.C.3.2.1.23)酵母菌菌株(No.47).摇瓶发酵获酵母细胞,利用甲笨-自溶法破碎细胞,抽提的β-半乳糖苷酶通过2次丙酮沉淀,DEAE-纤维素(DE52)柱层析、羟基磷灰石柱层析进行纯化。该酶仅以一种分子形式存在。巯基与酶的活性中心有关。此酶对金属离子敏感,能被多种金属离子及SDS、Urea、EDTA等抑制。纯化的酶固定在戊二醛交联的明胶颗粒上,残活力为14%。固定化酶最适pH为6.6,而自然酶最适pH为6.4;固定化酶与自然酶最适温度均为45℃;固定化酶pH稳定范围为6.8-9.2,自然酶为6.4-9.2,自然酶为6.4—8.0;固定化酶热稳定性优于自然酶;以邻硝基苯酚-β-D-吡喃型半乳糖苷(简称ONPG)为底物,固定化酶表观米氏常数为3.4mmol·dm~(-3),自然酶米氏常数为2.5mmol·dm~(-3)。     

低温辐射聚合固定化葡萄糖淀粉酶的研究

研究葡萄糖淀粉酶与α-甲基丙烯酸-β-羟基乙酯单体的低温辐射聚合固定化,观察载体的微孔结构,确定单体浓度(%)在40—60、辐射剂量在5×10~5—1.2×10~6rad、聚合温度在-60—-70℃酶在载体上的担载量在40—70mg/g 之间,所制得的固定化酶的相对活力可达45%以上的最适宜条件,并对工业应用进行了模拟实验.     

鸡溶菌酶和重组大肠杆菌融合蛋白(NADP-GDH)体外分子交联的初步研究

用PCR方法克隆的大肠杆菌NADP特异性谷氨酸脱氢酶 (NADP specificglutamatedehydrogenase ,NADP GDH)基因和其突变基因 ,插入表达载体pTrcHisC构建重组蛋白质表达体系 .经过IPTG诱导表达 ,用Talon固定化金属亲和层析树脂纯化出重组的天然和突变NADP GDH ,将它们和溶菌酶 (Lysozyme)通过热诱导去折叠方法进行体外蛋白质分子交联实验 ,在去折叠反应液中加入还原剂二硫苏糖醇 (DTT)后 ,不但没有分子间二硫键交联形成 ,同时也没有其他分子间共价键 (异肽键 )交联的形成 .另外 ,半胱氨酸残基定点突变后的NADP GDH重组蛋白质 ,无法参与形成分子间二硫键 ,实验证实经过热诱导去折叠后也没有分子间共价键 (异肽键 )交联 .这些结果进一步证明蛋白质分子间二硫键的形成能够促进蛋白质其他分子间共价键 (异肽键 )的形成 .     

微球形固定化α-葡萄糖苷酶的制备

将粉末状壳聚糖制备成微球形多孔载体 ,采用吸附 -交联的方法将TGL固定化 .研究表明 ,制备微球形多孔壳聚糖载体的关键取决于壳聚糖原料的分子量分布、壳聚糖的稀酸溶液浓度以及凝结液的组成等因素 ;当壳聚糖的相对分子质量为 3.0× 10 5左右 ,壳聚糖溶液浓度为 2 .5% ,凝结液组成为 2mol/LNaOH∶4 0 %甲醛 =3∶2 (体积比 )或2mol/LNaOH∶甲醇 =3∶1(体积比 )时 ,可制得微球形多孔壳聚糖载体 .最佳固定化条件研究表明 ,对于脱乙酰度为 88%的壳聚糖载体 ,加酶量为 3× 10 5Unit/g时 ,在 pH 6.0条件下 ,室温吸附 8h ,然后用 2 .0 %的戊二醛在 4 5℃交联 9h ,可得到固定化酶的活力为2 .34 2× 10 5Unit/g ,酶活力回收率为 78.1% ,并具有较好的强度 .     

表面吸附固定化酶及其应用

研究用无机物载体(活性炭、分子筛、硅胶)表面吸附固定植物酶(菠萝酶,木瓜酶)技术,以及固定化酶的活性寿命及其催化效能。将实验制得的固定化酶多次反复应用于催化胶液水解反应中。反应结果证实表面吸附固定酶在技术上是可行的,经济上是合理的。另外还采用“补酶”的方法,使吸附酶趋向平衡,以减少该固定化酶中酶的脱落。初步探讨了用与水不溶支撑体的共价结合法固定酶技术。     

谷氨酸酶电极的研制

将产生谷氨酸脱羧酶(GDC)的大肠杆菌菌株(E,Coli.,AS.505),在37℃培养,所得细胞经抽提得到GDC粗品,将它固定于海藻酸钠上,配合CO_2选择性电极,制得谷氨酸酶电极。它具有下列特性:(1)电极对谷氨酸的线性响应浓度范围是1.0×10~(-3)—0.5tmol/L(8.3—6300mg)谷氨酸/L;(2)电极动态响应时间1分钟,即可达约90%响应值,静态响应时间约10分钟;(3)电极连续测定六十次以上仍有响应;(4)除L-赖氨酸及L-谷氨酰胺外,其余氨基酸均不干扰电极对谷氨酸的测定;(5)电极具较高的重演性。     

大孔疏水载体的制备及其在脂肪酶固定化中的应用

以苯乙烯(St)为功能单体,二乙烯基苯(DVB)为交联剂,采用固液联合致孔的方式,制备了疏水多孔载体。将多孔载体用于脂肪酶Candida sp.99-125的固定化,得780U/g的固定化活力。固定化使酶在30～50℃范围内热稳定性得到了明显的提高,最适反应温度提高了5℃,在pH6.0～9.0范围内酶的相对活力有所提高,最适pH不变仍为8.0。固定化酶单次催化油酸和十六醇的酯化率达98%,其操作稳定性好,连续间歇操作15批,酯化率仍可达到50%。