螺旋霉素的生物合成——Ⅱ.螺旋霉素产生菌的理性化筛选

本文采用强烈因子处理的诱变方法,配合理性化筛选技术,有意识地消除一些分解代谢物的阻遏和产物对螺旋霉素生物合成的反馈抑制。试验结果表明:用紫外线照射30秒,射距30cm或用1%硫酸二乙酯处理40分钟,能获得正变幅度较大的突变株;用诱变剂处理与结构类似物(2-脱氧-D-葡萄糖、甲胺或终产物——螺旋霉素)筛选相结合的理性化方法比常规方法优越,获得一株摇瓶发酵单位达3000u·ml~(-1)以上的高产菌株。静息细胞培养系统中的研究表明,用2-脱氧-D-葡萄糖、甲胺和螺旋霉素定向筛选的抗性突变株,都在不同程度上分别解除了碳、氮分解代谢物和终产物对螺旋霉素生物合成的阻遏,且低浓度的外源螺旋霉素对诱变组的螺旋霉素合成有促进作用。     

利用抗药性选育盐霉素高产菌株

采用紫外线诱变和紫外线复合氯化锂处理盐霉素生产菌株,利用含棕榈油的筛选平板,结合选育脂肪酶活力高的菌株,成功获得产量提高并适应棕榈油发酵的高产菌株Ae-4.棕榈油完全替代豆油摇瓶113 h发酵的产量是豆油发酵的88.7%(出发株为69.6%).进一步通过选育抗药性突变株获得了抗链霉素的高产突变株E4Lt-1(摇瓶发酵产量提高57.4%)和抗利福霉素的高产突变株Rift-1-2(摇瓶发酵产量提高44.9%).     

L—山梨糖发酵中的芽孢杆菌噬菌体及抗噬菌体菌株的选育

从济南制药厂L—山梨糖混合发酵液中分离得到四株芽孢杆菌噬菌体,其中一株来自寄主巨大芽孢杆菌,三株来自腊状芽孢杆菌,这些噬菌体都是有尾的,根据形态可分为二类。通过选育获得了几株抗噬菌体菌株,经摇瓶混合发酵试验,表明抗株不但具有稳定的抗性而且保持了原种的性能。     

D-核糖产生菌的选育及发酵

以枯草芽孢杆菌Ｄ－２为出发菌株,经紫外诱变,得到一株莽草酸缺陷型突变株Ｄ－２０２,摇瓶发酵Ｄ－核糖产量可达到５２．６ｇ／Ｌ。该菌遗传稳定性良好。通过发酵条件的优化,最高产量可达６５ｇ／Ｌ。经２ｔ发酵罐中试,发酵单位达到５０ｇ／Ｌ。     

脱氮假单胞菌发酵生产维生素B12高产菌株的选育

以维生素B12生产菌株脱氮假单胞菌05-04为出发菌株,采用紫外线和5-澳尿嘧啶复合诱变处理,选育到一株抗5-澳尿嘧啶突变株5-BU-3-5,该菌株经摇瓶发酵,发酵单位较出发菌株提高了18.0%.该菌株特性优良,经57m3发酵罐试验,平均发酵单位提高8.9%,是一株性状较稳定可深入开发研究的优良菌株.     

野油菜黄单胞菌X.c—18的选育及发酵条件的研究

通过人工诱变野油菜黄单胞菌，筛选出１株具有良好抗变异性的突变株Ｘ．ｃ－１８。该突变株能很好地利用蔗糖和玉米淀粉为碳源，蛋白胨和黄豆饼粉为氮源。其最佳黄原胶发酵总糖量与总蛋白质量之比为５：０．５，最适ｐＨ值为７．０，温度为２８℃。摇瓶发酵７２ｙ，黄原胶产量每升发酵液一般可在３０ｇ以上，最高产量达３２．６ｇ，对碳源转化率为７１．５４％。     

卡那霉素链霉菌(Streptomyces kanamyceticus)抗噬菌体菌株的筛选

安徽朝阳化工厂在卡那霉素发酵生产中曾多次出现噬菌体感染。1977年春,我们从卡那霉素链霉菌的异常发酵液中分离出了噬菌体。电子显微镜研究说明,这是一种蝌蚪状的噬菌体。应用亚硝基胍或紫外光诱变并结合噬菌体处理,筛选得若干对噬菌体具有抗性的菌株,其中某些抗性菌株的卡那霉素产量在摇瓶发酵中大约比对照高百分之十六。     

利用抗自身代谢物特性进行西索霉素菌种选育

经过诱变处理西索霉素产生菌，利用菌株抗自身代谢物特征，在添加高浓度的西索霉素的分离培养基上选育获得产生西索霉素比出发菌株单位高的突变株ＭＥ９７，经过薄层层析，生物效价测定，该突变株所产抗生素主要组份是西索霉素，总有抗生素效价提高，并且其它发酵特征也发生了改变。     

点青霉高产葡萄糖氧化酶菌株的诱变选育

以产葡萄糖氧化酶的点青霉(Penicilium notatum)No.8312为出发菌株,经紫外线诱变处理,对单菌落进行摇瓶选育,在193个突变株中初筛选定3株.进一步对培养基和发酵条件优化试验,复筛得到了一株(No.T111)高产葡萄糖氧化酶的菌株,连续12次对其传代试验,该突变株遗传性状稳定,摇瓶产酶水平达到55.7U/mL,比出发株(36.2U/mL)提高了53.9%.     

妥布拉霉素发酵放大规律的研究

分析和对比了不同溶氧情况下妥布拉霉素菌株在摇瓶和５Ｌ全自动发酵罐中发酵过程的特征。发现搅拌转速为４５０ｒ／ｍｉｎ时，５Ｌ发酵罐的妥布拉霉素发酵过程与２１０ｒ／ｍｉｎ、９０ｍＬ装量的摇瓶发酵相似，结果达到了摇瓶发酵水平。在此基础上，以相同单位体积功率为基准放大，将妥布拉霉素发酵一步放大到１０ｔ发酵罐，搅拌转速为１００ｒ／ｍｉｎ。     

L—乳酸产生菌的诱变选育

米根霉 R87经紫外线和氯化锂复合诱变处理,获得一株高产、稳产 L-乳酸的变异株R87-91.其在10%初糖和发醇72小时,产酸达8.18%.     

噬菌体展示禽流感病毒抗原变异性基因片段文库的构建

构建T7噬菌体展示禽流感病毒抗原变异性基因片段文库. 首先， 从Gene Bank中查找筛选禽流感病毒抗原变异性基因, 将其截短、 修饰、 简并后得到禽流感病毒抗原变异性基因微阵列. 其次， 将合成的禽流感病毒抗原变异性基因片段文库扩增、 酶切, 链接到双酶切后的T7噬菌体载体基因上, 构成重组噬菌体DNA. 最后， 重组噬菌体DNA经体外包装和扩增, 得到T7噬菌体展示文库, 并进行T7噬菌体展示文库滴度、 重组率和免疫活性测定. 实验结果表明, 从Gene Bank中查找、 筛选、 剪切和修饰共获得96 258条序列构建T7噬菌体展示文库, 原始文库滴度为3.6×107个菌落/mL, 重组率大于90%. 用禽流感病毒H5N1抗体进行捕获, 经聚合酶链式反应(PCR)鉴定, 得到理想目的条带, 证明噬菌体表面展示蛋白具有抗原活性, 可用于禽流感病毒感染患者的快速检测及抗原表位筛选.     

噬菌体展示禽流感病毒抗原变异性基因片段文库的构建

构建T7噬菌体展示禽流感病毒抗原变异性基因片段文库. 首先, 从Gene Bank中查找筛选禽流感病毒抗原变异性基因, 将其截短、 修饰、 简并后得到禽流感病毒抗原变异性基因微阵列. 其次, 将合成的禽流感病毒抗原变异性基因片段文库扩增、 酶切, 链接到双酶切后的T7噬菌体载体基因上, 构成重组噬菌体DNA. 最后, 重组噬菌体DNA经体外包装和扩增, 得到T7噬菌体展示文库, 并进行T7噬菌体展示文库滴度、 重组率和免疫活性测定. 实验结果表明, 从Gene Bank中查找、 筛选、 剪切和修饰共获得96 258条序列构建T7噬菌体展示文库, 原始文库滴度为3.6×107个菌落/mL, 重组率大于90%. 用禽流感病毒H5N1抗体进行捕获, 经聚合酶链式反应(PCR)鉴定, 得到理想目的条带, 证明噬菌体表面展示蛋白具有抗原活性, 可用于禽流感病毒感染患者的快速检测及抗原表位筛选.     

抗蛋氨酸结构类似物突变株的筛选

以北京棒杆菌AS1.299经诱变后获得的高产蛋氨酸突变株N3-10作为出发菌株, 依次采用蛋氨酸结构类似物亮氨酸、 原亮氨酸和乙硫氨酸平板对
诱变后的突变株进行筛选, 得到蛋氨酸高产菌株依次为L3,LN7和E31. 结果表明, 亮氨酸对突变株N3-10的抑制质量浓度为8 g/L, 原亮氨酸对突变株L3的抑制质量浓度为3 g/L, 乙硫氨酸对LN7突变株的抑制质量浓度为3 g/L, 经紫外诱变和3种蛋氨酸结构类似物的筛选, 最终获得蛋氨酸产量最高突变株E31, 产量为1.479 g/L, 比出发菌株N3 10蛋氨酸产量高0.379 g/L. 经5次传代, 产量稳定.     

产谷氨酸菌转导的研究

研究了一株 Brevibacterium tientsinenensT6-13 温和噬菌体φT4的转导。结果表明:φT4能够以10~(-7)左右的频率转导不同的营养缺陷标记;首次发现,L-色氨酸能够有效地提高转导频率,紫外线照射噬菌体对Thr和Cys基因的转导有相似的影响,即随着紫外线照射时间的延长,完全转导子出现的频率先上升而后下降;通过共转导的测定发现了T6-13的一个基因连锁群,基因顺序是 cys-thr-met。     

sFcγRⅡb蛋白结合肽的筛选与鉴定

FcγRⅡb是免疫球蛋白G受体( FcγR)中唯一的抑制型受体,在免疫反应的负性调节方面发挥重要作用.为了筛选sFcγRⅡb的蛋白结合肽,以重组sFcγRⅡb蛋白为靶分子,采用噬菌体肽库展示技术对sFcγRⅡb结合肽进行筛选.利用ELISA鉴定每轮洗脱噬菌体与sFcγRⅡb蛋白亲和力,经过4轮筛选,挑取40个噬菌体克隆进行序列测定,获得28种不同的12肽序列.经ELISA法鉴定噬菌体与sFcγRⅡb蛋白结合活性,得到sFcγRⅡb蛋白高特异性、高亲和力结合肽FHKMPWYMSMYY,为进一步研究FcγRⅡb的作用机制和探索结合肽的功能提供实验基础.     

利用空间诱变选育辅酶Q10高产菌

 以空间搭载为诱变手段,筛选可用于工业化生产的辅酶Q10高产菌株。以类球红细菌（Rhodobacter sphaeroides）为出发菌株进行空间搭载,根据菌落形态进行初筛,摇瓶发酵进行复筛,HPLC检测含量等方法筛选辅酶Q10高产菌株。最终得到名为Shenzhou6的突变株产量比对照菌株提高30％,产量可达（0.8+0.02）g/L,经过优化培养可满足工业生产需要。同时也说明空间诱变因其复杂的空间环境条件,可以作为一种诱变手段进行工业化菌样的筛选。     

抗木材变色高效菌株B26-10的诱变选育

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B26分离自白桦林地土壤,对多种变色菌具有抑制效果。经紫外诱变,筛选得到1株抑菌活性更强的突变菌株B26-10。与菌株B26相比,突变菌株B26-10显著提高了对引起木材变色的绿色木霉7258、甘薯长喙壳8430和交链孢5173的抑菌效果,提高幅度分别为60 ％、46 ％和25 ％。菌株B26-10经传代10次后,抑菌效果稳定。对突变菌株B26-10的上清液、发酵液及高温处理后的发酵液进行抑菌活性测定,结果表明,发酵液的抑菌活性略大于上清液抑菌活性,发酵液经高温处理后无抑菌活性。菌株B26-10的抑菌作用可能与其具有抑菌活性的代谢产物有关,代谢产物可能为蛋白类物质。在白桦木片被变色菌侵染之前,利用菌株B26-10对木片进行生防处理,可以有效地控制白桦变色。     

A novel peptide,selected from phage display library of random peptides,can efficiently target into human breast cancer cell

To develop a targeting vector for breast cancer biotherapy, MDA-MB-231 cell, a human breast cancer cell line, was co-cultured with pC89 （9 aa） phage display library of random peptides. In multiple inde-pendent peptide-presenting phage screening trials, subtilisin was used as a protease to inactivate extra-cellular phages. The internalized phages were collected by cell lysising and amplified in E. coli XLI-Blue. Through five rounds of selection, the pepUde-presenting phages which could be internalized in MDA-MB-231 cells were isolated. A comparison was made between internalization capacities of peptide-presenting phages isolated from MDA-MB-231 cells and RGD-integrin binding phage by coculturing them with other human tumor cell lines and normal cells. The nucleoUde sequences of isolated peptide-presenting phages were then determined by DNA sequencing. To uncover whether phage coat protein or amino acid order was required for the character of the pepUde to MDA-MB-231 cells, three peptides were synthesized. They are CASPSGALRSC, ASPSGALRS and CGVIFDHSVPC （the shifted sequence of CASPSGALRSC）, and after coculturing them with different cell lines, their targeting capacities to MDA-MB-231 cells were detected. These data suggested that the internalization process was highly selective, and capable of capturing a specific peptide from parent peptide variants. Moreover, the targeting internalization event of pepUdes was an amino acid sequence dependent manner. The results demonstrated the feasibility of using phage display library of random peptides to develop new targeting system for intracellular delivery of macromolecules, and the peptide we obtained might be modified as a targeting vector for breast cancer gene therapy.     

苏云金杆菌噬菌体的形态及感染特性

从苏云金杆菌厂发酵裂解液中分离得到一株苏云金杆菌噬菌体ＫＰ－１．电镜观察表明，该噬菌体结构较为复杂，头部呈多面体，衣壳里六角形，在见并具有收缩性尾鞘，尾部末端呈扁平膨大基片．其寄生范围与其它“ＢＴ”噬菌体不同，具有非常广泛的寄主，专一性不明显，同时对噬菌体ＫＰ－１感染敏感菌株１８７的特性作了具体分析．