实验动物常见支原体荧光定量PCR检测方法建立

目的 建立能对实验动物常见支原体进行检测的荧光定量PCR方法。方法 针对多种大、小鼠易感支原体的16 s rRNA基因中较保守的区域设计1对引物和探针,建立荧光定量PCR方法并检测其特异性、灵敏性及重复性。结果 该方法在模板浓度为5×100～5×106 copies/μL之间呈良好的线性关系(R2=0.9972)且扩增效率为98.11%;特异性强,能够区分检测金黄色葡萄球菌等常见的病原菌;灵敏性高,检测下限为5 copies/μL,比常规PCR的检测灵敏性高100倍;重复性好,对不同浓度模板进行组内和组间重复性试验的变异系数均低于2%。用荧光定量PCR和普通PCR方法对不同来源不同类型的120份临床样品进行检测,结果表明小鼠支原体检测阳性率分别为3.33%(2/60)、1.67%(1/60),细胞样品支原体检测阳性率均为5%(3/60)。结论 本研究建立的荧光定量PCR方法快速、特异强、灵敏性高、重复性好,可用于实验动物常见支原体的快速诊断。     

液相芯片技术检测马立克氏病病毒方法的建立

目的 建立检测马立克氏病病毒的双抗夹心液相芯片技术方法。方法 将捕获抗体偶联到19号微球,分别确定捕获抗体的偶联量、检测抗体和SA-PE抗体的工作浓度,用建立的液相芯片方法进行特异性、灵敏度、重复性及临床样品的分析。结果 1×106个荧光编码微球的抗体偶联量为2 μg,最佳的检测抗体与SA-PE的工作浓度分别为2 μg/mL和4 μg/mL。该方法特异性强,只检出马立克氏病病毒,其他病毒未检出;灵敏度为125 pfu/mL;批内批间的变异系数分别为0.85%和2.4%;对58份临床样品检出率为31%。与PCR方法比较,符合率为94.8%。结论 建立的马立克氏病病毒液相芯片检测方法具有特异性好、灵敏度高、重复性好等优点。该方法可用于马立克氏病的监测,也可用于SPF鸡的筛选。     

小鼠巨细胞病毒荧光定量PCR检测方法的建立及应用

目的 建立小鼠巨细胞病毒(Mouse Cytomegalovirus,MCMV)荧光定量PCR方法并对其进行初步应用。方法 选取NCBI发表的MCMV Smith株DNA polymerase基因保守序列设计引物探针,建立MCMV的荧光定量PCR方法,对方法的特异性、敏感性、重复性及稳定性进行验证,并应用该方法检测掺入MCMV的小鼠血液样品及2018年度送检的409份小鼠血液样本。结果 建立的MCMV荧光定量PCR方法标准曲线Slope为-3. 418,R2值为0. 999,扩增效率为96. 137%,可定量检测到的MCMV最低含量为47 copies/μL。以大鼠巨细胞病毒,猴巨细胞病毒,人单纯疱疹病毒,伪狂犬病毒及猫疱疹病毒I型为模板均无扩增曲线,特异性良好。方法组内和组间变异系数分别为0. 39%～0. 68%和0. 48%～1. 01%,重复性和稳定性好。可检测到掺入小鼠血液样品中MCMV病毒的最大稀释度为1∶1000(100. 75 TCID50/0. 1 m L),409份小鼠血液样品经检测均为阴性。结论 建立的小鼠巨细胞病毒荧光定量PCR方法有很好的敏感性、特异性及稳定性,可有效地检测小鼠中MCMV,为实验小鼠MCMV的监测及相关标准的补充完善提供了技术参考。     

牛疱疹病毒Ⅰ型(BHV-1)荧光定量PCR检测方法的建立及应用

目的 建立牛疱疹病毒Ⅰ型(BHV-1)实时荧光定量PCR检测方法,用于牛源性样本中BHV-1的快速检测。方法 根据已发表的BHV-1 gB基因设计特异引物和TaqMan探针,建立BHV-1实时荧光定量PCR方法。并对方法的特异性、敏感性、重复性稳定性等进行测定。用建立的方法对181份牛源性样本进行检测。结果 建立的BHV-1荧光定量PCR检测方法与牛副流感病毒Ⅲ型(BPIV3)、牛病毒性腹泻病毒1型(BVDV1)、猪伪狂犬病毒(PRV)、单纯疱疹病毒Ⅰ型(HSV-1)、猫疱疹病毒1型(FHV-1)均无交叉反应;检测灵敏度可达到1×101copies/μL;批内变异系数均小于5%。应用建立的方法检测181份牛源性样本,有6份样本BHV-1核酸为阳性。结论 建立的BHV-1荧光定量PCR检测方法具有快速、特异、敏感及稳定的特点,可用于牛源性样本中BHV-1污染的检测。     

肝片形吸虫种类鉴定PCR方法的建立

为了建立一种快速鉴定肝片吸虫种类的特异PCR方法,以肝片形吸虫基因组DNA为模板,以前后盘吸虫,胰阔盘吸虫,日本分体吸虫,牛弓首蛔虫、大片吸虫gDNA为对照,用肝片形吸虫特异性引物ITS-1、ITS-2进行PCR扩增,PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳,紫外透射仪观察;用核酸蛋白测定仪测定肝片形吸虫gDNA的浓度,然后将gDNA原液进行不同倍数的稀释,筛选最佳条件,进行敏感性检测.结果显示只有肝片吸虫样品有特异性条带,对照样品均呈阴性;可以检测到的最低DNA浓度分别为1.17 ng/μL、0.59 ng/μL.     

人博卡病毒微滴数字PCR定量方法的建立

为准确、快速地从临床鼻咽拭子样本中筛选出人博卡病毒(HBoV)感染的阳性样本,以HBoV-sh9基因的保守区序列为检测靶标合成引物和探针,建立了微滴数字PCR(dd PCR)检测HBoV的方法.结果表明:HBoV dd PCR方法具有较高的特异性,在(0.5~6.8)×10~3copies/μL HBoV DNA浓度范围内,具有良好的线性和精确度,定量限低至0.5 copies/μL.182份临床样本检测结果显示:HBoV感染的阳性率为8.24%.此建立的HBoV dd PCR方法在定量限、准确性和重复性上较常规PCR优势明显,不受样品基质和扩增效率的影响.     

多房棘球蚴不同方法接种灰仓鼠感染效果观察*

摘要: 目的观察将多房棘球蚴( Echinococcus muhilocularis 简称Em) 接种灰仓鼠腹腔、前肢腋下、心脏和肝脏组织 的感染效果,为探索建立多组织或器官包虫病动物模型提供依据。方法按1000 个头节/只剂量经腹腔和前肢腋 下接种灰仓鼠,经腹膜穿刺肝脏和经胸腔穿刺心脏接种灰仓鼠,按计划解剖检查包囊发育状况和包囊寄生部位,计 算包囊系数( 包囊质量/ 体质量× 100% ) 和感染率。结果100 d 处理腹腔接种29 只,腹腔100% 感染,包囊系数 7. 1%,300 d 处理7 只,除腹腔都有包囊寄生外,包囊浸润肝脏3 只,浸润脾脏和肾脏各2 只,总包囊系数51. 7% 。 前肢腋下接种的分别于116 d 和290 d 处理19 只和5 只,腋下均有包囊寄生,包囊系数分别为3. 27% 和22. 95% 。 100d 处理肝脏接种的17 只,共10 只有包囊,包囊系数7. 1% ,包囊寄生部位为腹腔8 只,肝脏5 只,心脏1 只,肺部 3 只。115 d 处理心脏接种26 只,包囊寄生部位为心脏6 只,肺部9 只,胸腔1 只,其中有两只同时心脏和肺脏寄生 包囊,共13 只寄生包囊,包囊系数2. 91% 。结论腹腔环境适宜Em 生长发育,适合做周期短的动物模型,接种 300 d 包囊有向实体器官浸润的现象。Em 在前肢腋下发育缓慢,适合做Em 保种。由于动物模型中的心脏和肝脏 接种感染率低,接种技术和方法需改进,以便提高感染率． 关键词: 多房棘球蚴( Em) ; 灰仓鼠; 动物模型; 包囊系数; 器官     

寄生蠕虫的调查与群落分析

1992年在福建省龙岩市解剖52只圈养麻鸭,检出寄生蠕虫9种,感染率分别为:鸭对体吸虫3.85%、宫川棘口吸虫3.85％、似椎低颈吸虫1.92％、细背孔吸虫1.92％、分歧单睾绦虫5.77％、美丽膜壳绦虫13.46%、冠双盔绦虫3.85％、鸭瓣口线虫5.77％、裂刺四棱线虫48.08％,总感染率为 61.54％,平均感染强度为11.75条,其中以裂刺四棱线虫最高。该群落中寄生蠕虫分布型有5种为聚集分布,4种为随机分布。优势种为裂刺四棱线虫,辅优势种为美丽膜壳绦虫和分歧单睾绦虫。优势度和感染指数亦以裂刺四棱线虫为最高。群落中的两两种对间显著亲和与正关联的种对有1对(P<0.01),负关联达显著水平的有7对(P<0.05)。     

流感嗜血杆菌、溶血嗜血杆菌和多杀巴斯德杆菌病多重荧光定量PCR检测方法的建立与初步应用

目的建立同时检测实验动物中的流感嗜血杆菌、溶血嗜血杆菌和多杀巴斯德杆菌的多重实时荧光定量PCR(qPCR)检测方法。方法分别根据三种病原菌的Hpd基因和KMT1基因设计特异性引物和Taqman探针,经特异性、敏感性和重复性验证,建立多重qPCR检测方法,并对822份实验动物呼吸道样本进行检测应用。结果所建立的多重qPCR方法与其他29种病原菌间无交叉反应,对三种病原菌的检测限可达到10个拷贝/μL。树鼩样品中溶血嗜血杆菌和多杀巴斯德杆菌的阳性率分别为10%(6/60)和21.7%(13/60),其他实验动物中均未检出上述三种病原菌。结论本研究所建立的多重qPCR检测方法,可快速检测实验动物中的上述三种呼吸道病原菌。     

三重PCR方法对猪、鸡源细菌中四环素类药物耐药基因的检测

针对GenBank上已公开的四环素类耐药基因tetA、tetC、tetM序列进行比对分析,设计特异性扩增引物,建立三重PCR法快速检测方法.结果表明,单重PCR和三重PCR的符合率为100%.应用本检测方法和传统药敏试验方法(药敏纸片法)对412猪、鸡源细菌的四环素耐药基因和表型同时进行检测.PCR检测实验结果显示,在412株待检细菌中,tetA、tetC、tetM的检出率分别为47.57%,38.35%和34.95%.药敏实验结果表明,待测细菌对四环素的耐药率最高,为95%;对多西环素的耐药率次之,为92%;对米诺环素耐药率相对最低,为84%.比较两种方法,发现其检出结果的符合率为88%.说明两种方法具有较高的一致性.本研究建立了一种猪、鸡源细菌四环素类药物耐药基因三重PCR检测方法,并进行了初步应用.     

菌落PCR方法的建立及其与常规PCR方法的比较

为建立一种快速、经济、敏感的PCR检测方法，以直接检测出环境、海产品等中的靶基因，通过PCR扩增已知携带tlh和tdh基因的副溶血弧菌标准菌株，并和常规PCR方法比较，初步建立了菌落PCR技术；再以副溶血弧菌标准菌株为阳性对照，以本实验室自海洋环境中分离得到的数株野生菌株为检测对象，采用新建立的菌落PCR以及常规PCR方法对它们进行扩增比较，进一步证明了菌落PCR技术检测携带相关基因菌株的可靠性．通过比较，发现菌落PCR和常规PCR的结果相当一致，两种方法均能扩增出阳性对照标准菌株中tlh和tdh基因．     

P-C-R模型构建及应用

针对目前预测模型精度低的问题,提出将主成分分析、聚类分析用于RBF神经网络预报建模,从而克服大样本数据提取的困难,使得指标的选取能更全面地反映状况,有效地缩减RBF网络的输入节点数并提高模型的预报精度。利用MATLAB的神经网络工具箱,实现了神经网络训练和仿真验证。仿真结果表明,该模型有较高的预报能力。提出的基于主成分分析和聚类分析的RBF网络预报模型---PCR模型为研究预报提供了一个新的思路和方法,并为其他领域的建模研究开阔了思路,具有一定的理论价值和的应用价值。     

PCR芯片中微腔室高度及加热器结构优化设计

对PCR扩增芯片中微加热器的传热及微腔(DNA反应液腔)室的高度优化问题进行了有限元分析,通过ANSYS软件模拟分析了单蛇形、双蛇形以及双螺旋形等典型结构微加热器的温度场分布,分析了不同腔室高度PCR芯片的温度场分布,重点探讨了不同微加热器结构、不同布线规律对PCR芯片微腔室温度分布均匀性的影响,PCR芯片中DNA反应液厚度与芯片上下表面温差的关系.仿真结果表明:均匀加热器比非均匀加热器温度分布均匀性更好;双螺旋形加热器较单蛇形与双蛇形加热器更能满足实际需要;DNA反应液厚度与芯片上下表面温度差之间具有良好的线性关系.同时根据分析结果得到了所设计的具有电极均匀分布双螺旋微加热器的PCR芯片微腔室最佳高度为340μm,能很好满足片上PCR芯片扩增所需的温度环境条件.     

PCR及其应用

本文汇总近年来国内外有关PCR方面的资料,对PCR的意义、原理、操作、应用及今后展望等方面做了详细全面的介绍.     

同源引物的非等量PCR

为确定引物量对同源引物扩增DNA的影响.将正向引物GFO与同源度为45%、90%、100%、54%、9%的反向引物CR1、CR2、CR3、CR4、CR5分别用于扩增5.9 kb p ET20b-C2-G10-C2模式DNA.等量引物(500 nmol/L)时,CR3和CR4均无法扩增目的条带.而非等量PCR时,将反向引物量降低10倍(50 nmol/L),CR3和CR4均扩增出目的条带,即正向引物量降低10倍时,五对引物均扩增出目的条带.CR3降低100倍、CR4降低10倍扩增DNA最多,经15~20次循环五对引物扩增DNA最多.实验结果表明,非等量PCR通过降低单侧引物量减少引物二聚体形成,从而扩增双链DNA.     

PCR技术简介及其应用

目前，PCR已成为实验室中的一项常规技术，是分子生物学家们不可缺少的工具，本文介绍了PCR的历史、反应原理及这项技术在目的基因的制备、医学诊断、法医学鉴定、古生物学和生态学研究中的广泛应用。     

SHBV的PCR检测方法的建立及其检测

以新分离的猴B病毒毒株为材料,建立了一种PCR快速鉴定SHBV的方法,并通过对PCR产物的限制性酶切分析可与HSV－1相区分,并对这一新分离的B病毒毒株的克隆片段进行了序列分析。     

冷水鱼固着类纤毛虫PCR检测方法探讨及感染因素分析

针对冷水鱼养殖中固着类纤毛虫检测难和污染源不明确、种类鉴定难的问题,对冷水鱼养殖环境中固着类纤毛虫的主要寄生种类及感染因素进行调查分析,在不同季节于河北省内采集冷水鱼和水环境样本。首先,采用形态学方法对鱼体及水环境中的固着类纤毛虫进行初步鉴定;然后,建立PCR方法进行分子水平鉴定,并进行系统发育学分析;最后,对冷水鱼感染寄生虫的原因进行分析。形态学鉴定结果表明,冷水鱼寄生的固着类纤毛虫主要有累枝虫(Epistylis sp.)和钟虫(Vorticella sp.)2类;引物设计、敏感性和特异性试验结果显示,建立的寄生虫PCR检测方法有效,测序比对和系统发育分析结果进一步验证了其形态学结果;运用已建立的PCR方法检测出固着类纤毛虫在水环境中高达94.38%,鱼体广泛寄生,感染率达到了100%;且无季节差异,水体中的虫体可能是造成鱼长期感染的原因之一。研究数据可为冷水鱼病害的科学预测、预防和治疗提供依据,同时为冷水鱼养殖产业的可持续发展提供疫病防治参考。