5’端与3’端间同源长度对质粒构建的影响

5’端/3’端间同源长度对分子内同源重组质粒构建的影响还不明确.本研究以与GFO对应的五种反向引物CR1、CR2、CR3、CR4、CR5,分别扩增5’端/3’端间同源长度有10、20、30、40、50 bp的5.9 kb线性质粒pET20b-C2-GH10-C2作为模式DNA,经重组酶Exnase Ⅱ 37℃体外重组30 min,42℃热激诱导转化BL21(DE3)感受态细胞,比较转化率、质粒位置正确率、接口正确率.结果显示,同源长度30 bp DNA重组后转化子正确质粒最多,正确接口转化率3.4个/ng DNA,其次是同源长度20 bp DNA.电泳检测显示DNA重组后产生nick质粒,是转化子的来源,胞内酶修饰nick可产生基因-载体接口异常.     

同源引物的非等量PCR

为确定引物量对同源引物扩增DNA的影响.将正向引物GFO与同源度为45%、90%、100%、54%、9%的反向引物CR1、CR2、CR3、CR4、CR5分别用于扩增5.9 kb p ET20b-C2-G10-C2模式DNA.等量引物(500 nmol/L)时,CR3和CR4均无法扩增目的条带.而非等量PCR时,将反向引物量降低10倍(50 nmol/L),CR3和CR4均扩增出目的条带,即正向引物量降低10倍时,五对引物均扩增出目的条带.CR3降低100倍、CR4降低10倍扩增DNA最多,经15~20次循环五对引物扩增DNA最多.实验结果表明,非等量PCR通过降低单侧引物量减少引物二聚体形成,从而扩增双链DNA.