一种新颖的阳离子非病毒基因载体 Chitosan-g-PEI-g-PEG-OH 的性能研究

研究了新型阳离子聚合物Chitosan-g-PEI-g-PEG-OH的性能，重点考察其粒度，基因转染效率与细胞毒性，探讨了其作为基因载体的可能性.通过动态光散射仪（DSL）、透射电镜（TEM）观察了Chitosan-g-PEI-g-PEG-OH与DNA自组装形成的颗粒形态及粒径，Chitosan-g-PEI-g-PEG-OH可复合DNA形成粒径160～210 nm的纳米复合物，适合进入细胞.使用MTT比色法分析Chitosan-g-PEI-g-PEG-OH的毒性并与PEI，PEI-g-PEG-OH比较.选用增强型绿色荧光蛋白(EGFP) 转染Hela细胞，应用流式细胞术检测转染效率.新型阳离子多聚物Chitosan-g-PEI-g-PEG-OH在提高基因转染效率的同时降低了其细胞毒性，有望成为基因转移的有效载体.     

一种非病毒载体的组成与体外转基因能力的研究

目的：合成羟丙基β-环糊精偶联小分子量聚乙烯亚胺的共聚物,探讨不同聚乙烯亚胺偶联率的共聚物缩合DNA的能力,探讨不同偶联率的阳离子共聚物组成与转基因效率的关系。方法：通过NMR表征,凝胶阻滞DNA试验考察其缩合DNA能力,以MTT法检测不同偶联率共聚物的细胞毒性。以不同的偶联率共聚物为载体,在不同的N/P比值条件下,将荧光素酶基因导入非洲绿猴肾细胞COS-7,通过荧光素酶的表达检测比较不同偶联率的共聚物转染效率。结果：合成的不同偶联率的共聚物缩合DNA能力不同,转染效率也不同。结论：聚乙烯亚胺偶联率较高的阳离子共聚物缩合DNA的能力较强,转染效率较高。     

阳离子脂质体基因载体的稳定性研究

从阳离子脂质体的形态、平均粒径、粒径分布、Zeta电位及浊度等方面,考察了季铵盐型阳离子脂质体CPA14的稳定性。经透射电子显微镜检测,阳离子脂质体呈球形结构,粒径为100~200 nm。经粒度分析仪检测,阳离子脂质体平均粒径为210~260 nm,颗粒分布均匀,Zeta电位为55~90 mV。脂质体在4 ℃条件下存放3个月,外观无明显变化,脂质体的浊度变化不大。证实季铵盐型阳离子脂质体CPA14稳定性良好,适合用作基因载体进行基因转运。阳离子脂质体与质粒DNA在N:P质量比为3:1时可高效转染人宫颈癌细胞,与商品转染试剂DOTAP转染效率相当。为新型季铵盐型阳离子脂质体基因载体的构建提供了理论依据。     

DPA-Zn金属阳离子脂质的合成及转染活性研究

基于Zn(II)-二甲基吡啶胺(Zn-DPA)合成了含十六烷基醇疏水性尾部的单/双核金属阳离子脂质6a-6b.通过凝胶电泳、溴乙锭置换和粒径电位实验考察了它们与质粒DNA的相互作用.结果表明,两个金属脂质均可将DNA包裹缩合成具有适当粒径大小和zeta电位的纳米颗粒.并且,双核金属脂质6b具有比单核脂质6a更强的DNA结合能力.MTT细胞毒性实验显示金属脂质体/DNA复合物具有较低细胞毒性(细胞存活率大于80%).体外基因转染研究表明,单核金属脂质6a的转染效率优于双核金属脂质6b.     

复合环境离子强度对BDCP/DNA的粒径与转染效率的影响

为了探讨组装环境对基因载体/DN复合物的粒径和转染效果的影响,在三种不同离子浓度溶液体系(PBS, 5% 葡萄糖溶液, H₂O)中测量BDCP（biodegradable cationic polymer,一种生物可降解的阳离子聚合物）/DNA复合物粒径和结合力,进行了体外转染试验和毒性试验.结果显示,PBS最适合组装转染复合物,可取得更好的稳定性、最高的转染效率和较低细胞毒性、低溶血率;在5%葡萄糖溶液和水中组装的BDCP/质粒复合物结合力较弱,转染效率比较低.得出结论,BDCP/DNA粒径、结合力和基因转染效率受组装体系的离子强度影响.     

以芳香亚胺为连接剂的聚乙烯亚胺衍生物的合成及体外活性研究

通过有机合成的方法合成新型聚阳离子载体聚五乙烯六胺对苯二甲醛-1,4-二亚胺(PEHA-TPAI),产物结构经核磁共振氢谱(1H NMR)和傅里叶红外光谱(FT-IR)确定系目标产物。采用琼脂糖凝胶电泳实验观察PEHATPAI包裹小干扰RNA(siRNA)的能力,并用粒度仪和Zeta电位仪对PEHA-TPAI/siRNA复合物进行表征。结果表明:PEHA-TPAI和siRNA复合后可形成稳定且粒径均一的纳米颗粒,在PEHA-TPAI/siRNA复合物质量比为10∶1的条件下,颗粒粒径为(129.90±1.02)nm,Zeta电位为(21.1±0.54)mV。体外细胞毒性实验和转染实验的结果表明:PEHA-TPAI的细胞毒性显著低于商业化转染试剂聚乙烯亚胺(PEI,分子量为25 000)(P0.001)且具有良好的转染效率,有作为低毒性、高转染效率的基因输送载体的潜力。     

磷酸化壳聚糖-季铵化壳聚糖载体提高体内外基因转染功效

本研究通过磷酸化壳聚糖(PC)包被季铵化壳聚糖(TMC)/质粒(pDNA)纳米复合物,制备PC/TMC/pDNA三元复合物(PTC),用于提高体内外基因转染功效.PTC粒径为100~200nm,Zeta电势为-16~-34mV,可有效缩合pDNA,保护pDNA免遭核酶降解.PC降低PTC中pDNA结合力,增加体外释放量.表面荷负电的PTC抗非特异性蛋白吸附能力强,经小窝蛋白介导的细胞内吞途径入胞后逃避溶酶体降解,细胞核内分布比例高.HEK293细胞体外转染试验结果显示,PTC体外转染效率是TMC/pDNA纳米复合物(TC)的1.5~3.1倍;小鼠胫前肌注射给药试验结果表明,PTC可显著提高基因体内转染效率.因此,合适质量比的PTC有望作为功能性基因药物的递送载体,用于基因治疗.     

新一代阳离子聚合物转染试剂(梭华-Sofast) 转染效果研究

采用DNA延滞实验研究新一代阳离子聚合物梭华 Sofast转染试剂与DNA的结合能力,以不同报告基因(绿色荧光蛋白基因、β 半乳糖苷酶基因和荧光素酶基因),分析比较梭华 Sofast与阳离子脂质体Lipofectamine2000和阳离子聚合物JetPEI、Superfect转染HEK293细胞转染效率和细胞毒性,研究梭华 Sofast转染试剂转染效率.实验结果表明梭华 Sofast与DNA有很强的结合能力;以绿色荧光蛋白基因为报告基因,梭华 Sofast转染率最高,约60%左右,而且在单个细胞中表达的GFP量多;转染细胞荧光素酶活性检测结果表明,当梭华 Sofast与DNA质量比为16时,转染率最高,高于109RLU/mg蛋白,分别是JetPEI,Superfect和Lipofectamine2000转染细胞最高活性的1.6,2.3和5倍;梭华 Sofast转染β 半乳糖苷酶的染色结果显示95%以上的阳性细胞转染率;比较基因转染效率最高时的细胞毒性,在最佳转染剂量时,几种试剂的细胞存活率均在83%以上,而梭华 Sofast为94.23%.在目前市场上销售的转染试剂对HUV EC细胞的转染效果均不理想情况下,梭华 Sofast仍具一定的转染效率,阳性细胞约占20%.研究结果表明梭华 Sofast是一种高转染效率,低细胞毒性的转染试剂.     

PLA-PAMAM纳米粒作为非病毒基因载体的研究

采用乳化-分散-蒸发方法制备了表面含有聚酰胺-胺树状大分子的聚乳酸纳米粒,并将DNA与该阳离子纳米粒复合,研究了复合物的理化性质、细胞毒性和转染效率.结果表明在氮/磷比为2以上时,DNA与阳离子纳米粒形成了稳定且带正电的复合物,能保护DNA抵御核酸酶的降解,且复合物的细胞毒性较小.在无血清介质中,阳离子纳米粒可以将DNA有效地转移到细胞内得到表达,转染效率与未纳米化的PAMAM相比有明显的提高,且转染的最佳氮/磷比为2～5.     

基于合成非病毒基因载体的教学实验开发

基因载体构建是生物制药技术课程中的重要内容,也是生物医药领域的前沿技术。常见的基因载体包括病毒载体和非病毒载体。非病毒载体能够有效地包载基因,操作安全简便,但是其转染效率远远不及病毒载体。通过改变非病毒基因载体的结构、尺寸、表面电荷等性质,人们能够有效地提高其转染效率。基于此,本实验设计了常用基因载体支化聚乙烯亚胺(bPEI)与DNA在不同电荷比的复合实验,并对复合物粒子的粒径和电势变化进行表征。该实验不仅可以让学生掌握粒径仪的工作原理和使用方法,通过对实验条件的摸索,还能够加深学生对非病毒基因载体的认识。     

阳离子脂质体递送STAT3 siRNA抑制黑色素肿瘤细胞探究

利用阳离子脂质体作为载体,用其搭载鱼精蛋白与STAT3 siRNA复合物,通过一系列实验证实该复合体系可显著抑制STAT3基因在黑色素瘤细胞B16中的表达,促进肿瘤细胞的凋亡。首先对载体材料进行了一系列表征测定,检测了不同复合比例下载体和siRNA复合物的粒径和电位。利用载体和siRNA的复合物对B16细胞进行转染并测定转染效率,随后对复合材料的毒性进行了检测。此外还进行了细胞凋亡、平板克隆、荧光定量PCR以及Western Blot等一系列实验来进一步确定载体复合物的有效性。实验结果表明,阳离子脂质体搭载复合了鱼精蛋白的STAT3siRNA表现出了良好的靶向治疗性及优秀的递送效率,且复合体系稳定性良好,毒性低。     

高分子聚合物对两种细胞转染效率的研究

比较纳米材料和阳离子多聚物转染试剂携带增强绿色荧光蛋白基因对C2C12细胞和DF-1细胞的转染效率,筛选适合的基因载体。采用Entranster TM-D纳米材料和3种阳离子多聚物(Superfect、Fect、Neofect)转染试剂介导p CDH-EGFP-puro质粒分别转染C2C12细胞和DF-1细胞,24 h后用实时荧光定量核酸扩增检测系统检测转染细胞中增强绿色荧光蛋白基因的mRNA表达水平,48 h后观察并计数阳性细胞率。结果发现4种试剂分别转染的两种细胞中均有增强绿色荧光蛋白基因的表达。C2C12细胞用阳离子多聚物转染的效率略高于纳米材料转染,其中Superfect的转染效率可达到30%;DF-1细胞用纳米材料和阳离子多聚物转染的效率都高,其中Fect的转染效率达到50%。因此,阳离子多聚物Superfect用于C2C12细胞的体外转染,Fect转染试剂用于DF-1细胞的体外转染,都表现出较高效的转染效率     

构建HMGB1/PEI非病毒载体介导高效基因传递的研究

 研究了以聚乙烯亚胺（PEI）为骨架复合高迁移率族蛋白 B1 (HMGB1 )的复合型载体HMGB1/PEI的性能,以期提高非病毒基因载体的转染效率。透射电镜观察pDNA/HMGB1/PEI复合物粒子形态呈球形;动态光散射法测定粒径与表面电位,结果显示复合HMGB1后,复合物粒径降低,且随HMGB1加入量的增大表面电位有增大的趋势;凝胶电泳阻滞试验表明HMGB1可协助PEI与pDNA结合;MTT试验结果显示HMGB1/PEI复合载体的细胞毒性低于PEI;HMGB1/PEI复合载体的转染率较PEI的转染率增大2.9~4.0倍,且HMGB1可以弱化血清对转染的阻碍作用。所以HMGB1被证实能有效提高PEI的体外转染效率。     

环氧开环聚合制备的基因载体研究

缺乏安全高效的基因载体制约了基因治疗的发展。该综合实验通过环氧开环聚合反应设计合成三种阳离子聚合物基因载体。环氧开环反应生成的羟基均匀分布在聚合物骨架上,聚合物骨架中还含有脂肪链或芳香环,用于调节聚合物刚性,并协同羟基共同调节亲水/疏水平衡。采用核磁共振氢谱和凝胶渗透色谱表征聚合物结构,然后研究聚合物与DNA结合能力、细胞毒性、蛋白吸附能力和转染效率,进一步得到环氧开环聚合物作为基因载体的初步构效关系。     

线性与分枝状聚乙烯亚胺介导基因体外转染的比较与研究

聚乙烯亚胺(PEI)是一类新兴的阳离子多聚物非病毒载体,可缩聚DNA分子形成颗粒并转入真核细胞进行表达.本文选用分子量750 ku分枝状PEI与分子量25 ku线性PEI转染增强型绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因于HeLa细胞,并对这两种PEI的转染效率进行比较.利用MTT法检测比较线性PEI与分枝状PEI的细胞毒性.通过凝胶阻滞实验比较两种PEI结合DNA能力.最后利用肝素介导释放实验比较两者在形成PEI/DNA复合物后释放DNA的能力.研究结果表明:线性PEI转染效率优于分枝状PEI,且随PEI/DNA质量比的增加而升高,而分枝状PEI则相反;两种PEI细胞毒性在一定范围内相近;分枝状PEI结合DNA能力略强于线性PEI;但是分枝状PEI释放DNA的能力远小于线性PEI.这可能导致DNA在细胞内无法从PEI/DNA复合体上释放出来,从而影响转录的正常进行,最终导致分枝状PEI转染效率下降.     

纳米谷氨酸壳聚糖制备及其体外质粒转染研究

采用表面修饰方法制备出谷氨酸修饰的壳聚糖纳米基因载体。对样品进行红外分析、粒度分析、zeta电位分析、生物相容性、凝胶阻滞分析、DNA保护性试验、体外细胞转染研究。结果显示所制得的谷氨酸修饰的壳聚糖纳米颗粒平均粒径为170nm,其zeta电位为 4.7mV。红外分析显示谷氨酸已通过酰胺键结合在壳聚糖上。MTT实验结果显示纳米颗粒与细胞有良好的生物相容性。凝胶阻滞分析和DNA保护试验结果表明纳米载体可与DNA通过电性结合作用而结合,并可以有效保护DNA,防止核酸酶对其的降解作用。而体外细胞转染的结果表明,谷氨酸修饰的纳米粒能介导pEGFP-N1质粒转染HepG2细胞并在细胞中表达绿色荧光蛋白。因此,谷氨酸修饰的壳聚糖纳米颗粒可作为一种新型非病毒基因载体介导核酸类生物大分子进入细胞内。     

基于生育酚修饰的低分子量聚乙烯亚胺基因载体

制备了基于生育酚交联的低分子量聚乙烯亚胺(PEI)可降解脂质体聚合物基因载体。凝胶阻滞实验结果表明它能很好地包裹质粒DNA,使其免受核酸酶的降解。通过在体外He La细胞和HEK 293细胞中的绿色荧光蛋白转染实验结果表明,这种生育酚修饰的聚合物材料在无血清存在下表现出比"黄金标准"PEI高的转染效率。因此,推测这种材料具备了作为非病毒基因载体的潜在性。     

新型纳米复合材料作为非病毒基因载体的研究

为了制备理想的非病毒基因载体,合成了甲壳三糖-g-壳聚糖(TCS),并与钙基累托石(REC)插层复合制备纳米复合材料,采用X射线衍射和透射电镜方法对产物进行了表征,考察了其细胞相容性,将REC、TCS和纳米复合材料分别与质粒DNA复合形成复合物,并考察了其体外基因转染效果.结果表明:TCS、REC及纳米复合材料的细胞相容性良好,当N/P比为3时,TCS/DNA复合物粒径大小都在75 nm左右,REC加入后,其粒径不同程度地增大,最大达到191 nm;相对分子质量高的TCS所得DNA复合物较相对分子质量低的TCS所得DNA复合物稳定,而REC的加入降低了TCS/DNA复合物的稳定性;TCS/REC-DNA复合物能介入肝癌细胞中并表达荧光.说明该纳米复合材料可作为潜在的非病毒基因载体.     

靶向多肽功能化阳离子聚合物携载ZNF580质粒对内皮细胞增殖的影响

通过原子转移自由基聚合(ATRP)方法制备了以多面体低聚倍半硅氧烷(POSS)为骨架的POSS-(PDMAEMA)₈(PPD)星型阳离子聚合物,通过巯基-双键化学反应,将特异性靶向EA.hy926内皮细胞的CREDVW多肽键接在PPD阳离子聚合物末端,得到POSS-(PDMAEMA)₈-PPEGMA-CREDVW(PPD-CREDVW)阳离子聚合物.在n(N)/n(P)=5时,PPD-CREDVW阳离子聚合物携载pEGFP-ZNF580(pDNA)质粒自组装形成粒径为125.67±3.31 nm、zeta电位为10.64±1.65 mV的PPD-CREDVW/pDNA基因复合胶束.细胞实验结果显示:与PPD/pDNA基因复合胶束相比,PPD-CREDVW/pDNA基因复合胶束携载基因能力强、细胞毒性低、易被细胞摄取,能够显著提高EA.hy926内皮细胞的转染,促进细胞的增殖.     

O-硬脂酰化壳聚糖作为DNA的递送载体材料

以邻苯二甲酰基预先保护壳聚糖分子中-NH_2,以硬脂酰氯进行可控酯化,制备O-硬脂酰化壳聚糖.通过超声振荡与溶剂结合制备O-硬脂酰化壳聚糖/λDNA复合物,采用动态激光散射及原子力显微镜分析复合物的粒径分布及形态.凝胶电泳考察该载体与λDNA的结合能力.L929细胞培养对O-硬脂酰化壳聚糖进行细胞毒性评估.FT-IR和~1H NMR结果表明,可以成功制备不同酯化度的O-硬脂酰壳聚糖;O-硬脂酰化壳聚糖与λDNA结合可形成不规则球形复合物,平均粒径可达到86 nm,并且对DNase显示高稳定性.同时O-硬脂酰化壳聚糖具有促L929细胞增殖能力,安全性较高,可作为一种新型的非病毒型基因载体.