结核病核酸疫苗纯化过程的初步研究

对结核病核酸疫苗的质粒DNA的制备性纯化过程进行了初步研究。此工艺主要包括以简化的碱裂解法处理大肠杆菌、超滤与离心法除大部分杂质并浓缩样品、Q-Sepharose阴离子交换层析、DNA B ioSepharTMFF亲和层析等步骤,以去除细胞RNA和蛋白等杂质,并对不同分子结构的质粒DNA作分离。结果表明:以碱裂液中质粒DNA为计算基准的得率为56.61%、超螺旋质粒DNA的电泳纯度100%。     

一种高效安全提取质粒DNA方法的建立

在碱裂解法提取质粒DNA的基础上做了改进,将NaOH浓度从0.20 mol/L降低为0.10 mol/L,使得超螺旋DNA的得率进一步提高.采用silica法纯化质粒DNA,避免了使用有毒性和挥发性气味的饱和酚和氯仿,使得操作更安全简单.电泳结果表明,提取的质粒DNA质量好,得率高,并且可以直接进行下一步的酶切、连接及转化等实验.同时,该方法中使用的硅胶可以回收再生进行重复利用,节省了实验费用.     

碱裂解法提取质粒DNA方法的改进

对碱裂解法提取质粒DNA的方法进行了一些改进 ,在室温下裂解菌体和变性DNA ;用NH4 Ac和LiCl同步沉淀除去样品中的蛋白质和RNA ,降低了对超螺旋质粒的剪切作用 ,得到高质量的质粒DNA。     

结核杆菌Ag85B的表达纯化

为构建抗结核病新型疫苗，以结核杆菌标准毒力株H37Rv DNA为模板，用PCR法克隆抗原85B的编码基因，将该基因重组到表达型质粒pQE30中，表达的His6 Tag-Ag85B融合蛋白分子质量约32ku，用亲和层析一步法纯化的重组蛋白纯度好，得率高，为进一步的免疫研究创造了条件。     

重组大肠杆菌发酵生产核酸疫苗的初步研究

初步摸索大肠杆菌DH 5α生产核酸疫苗的发酵条件。通过均匀试验设计确定,当胰蛋白胨与酵母粉的质量比为1∶1.2,并且磷酸盐的加量较大时菌体的质粒产量较高。在菌体生长刚进入对数生长期时采用指数式流加葡萄糖与采用恒速流加葡萄糖,菌体得率相同,而产物收率前者高于后者。在菌体生长进入平稳期时将温度由37°C升高到42°C,在菌体密度没有改变的情况下,质粒产量得到提高,达到75 m g/L。     

HIV-GAG质粒DNA疫苗的纯化工艺

采用中空纤维超滤浓缩、 离子交换介质和复合模式凝胶过滤介质纯化获得了HIV-GAG药用级质粒DNA疫苗, 并对菌体培养、 菌体裂解、 粗提分离和柱层析等环节进行研究. 实验结果表明, 产品基本符合药用级的质粒DNA要求.     

Paenibacillus sp. K1 β-半乳糖苷酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

从鲜牛奶中分离到1株产β-galactosidase的细菌,经16S rDNA序列比对鉴定为类芽孢菌Paenibacillus sp. K1。提取该菌株的染色体DNA,以pUC18（lac-）为载体,构建其DNA文库;在含有X-gal的LB平板上筛选该文库,得到6个蓝色菌落;对阳性克隆中插入的DNA片段序列测定,鉴定出1个编码全长为2028bp并携带有组成型启动子的β-半乳糖苷酶基因。将该基因导入大肠杆菌BL21（DE3）中,实现了β-半乳糖苷酶高效表达,其酶活为25.06U/mL,高于原始菌株的4.55U/mL,并进一步用亲和层析将该酶进行了纯化。     

蓖麻油碱裂解液中酚及碱的回收方法研究

采用气相色谱-质谱联用仪分析了蓖麻油碱裂解料液的化学组成,研究了溶剂种类、用量对碱裂解料中苯酚和NaOH浸出性能的影响.结果表明:甲醇-叔丁醇混合溶剂(体积比为1∶1)对苯酚和NaOH的浸出具有高选择性;当溶剂用量为6 mL/g时,苯酚回收率可达80%,NaOH回收率可达72%.     

橘皮黄酮提取的响应面优化及抗氧化活性研究

以黄酮得率为指标,采用Box-Behnken中心组合实验和响应面分析法,研究了料液比、提取温度和提取时间对橘皮中黄酮类化合物提取的影响;用AB-8型大孔吸附树脂为色谱柱填充料,对橘皮黄酮提取物进行了纯化;以橘皮黄酮对1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基、羟基自由基的清除率为指标,研究了橘皮黄酮的体外抗氧化活性.结果表明：橘皮黄酮的适宜提取工艺是以水为提取溶剂、料液比为1∶38（g/mL）、于99℃浸提2 h,该条件下橘皮黄酮的最大得率为11.028 mg/g;AB-8型大孔吸附树脂对橘皮黄酮类化合物的纯化效果明显,纯化后橘皮黄酮的纯度提高了383.312%;对DPPH自由基、羟基自由基清除率的半抑制浓度（IC50）分别为0.019和0.557 mg/mL,纯化后橘皮黄酮对DPPH和羟基自由基的清除能力分别提高了96.185%和65.122%,表明橘皮黄酮是一种良好的天然抗氧化剂.     

野菊花精油的提取及其在功能性日用品中的应用

以精油质量作为评价指标,用单因素实验法确定野菊花精油的最佳超声提取工艺.结果表明,在250 W超声条件下,按照料液质量体积比（g/mL)1∶8、用80 mL 60%乙醇在30 ℃提取30 min,精油得率为4.3%.由野菊花精油制得的化妆品和洗浴用品不但保留了野菊花的特殊香气,还具有优良的消炎杀菌效果.     

大孔树脂对黑加仑果渣花色苷的纯化研究

确定出X-5大孔树脂为纯化黑加仑果渣花色苷的最佳树脂.最佳纯化条件为径高比1∶20,吸附原液质量浓度34 mg/mL,pH值2.0,吸附体积25 mL,吸附流速1 mL/min,水洗体积 4 BV,解吸液乙醇质量分数60%,乙醇体积6 BV,解吸流速1 mL/min,花色苷的收率为89.80%.纯化后花色苷色价为原来的18.26倍.     

甘蔗渣乙醇化预处理方法比较

用稀硫酸、氢氧化钠及超声波辅助碱法对甘蔗渣进行乙醇化预处理,研究酸、碱的质量分数、温度、时间、质量浓度对甘蔗渣预处理的影响.在硫酸质量分数为0.8%、质量浓度为1∶25（g/mL）、温度为135 ℃ 的条件下反应4 min,经酶水解后糖质量分数为17.81%（g/g）;在氢氧化钠质量分数为9%、质量浓度为1∶8（g/mL）、温度为40 ℃的条件下反应15 min,经酶水解后糖质量分数为14.50%（g/g）;超声波能够强化甘蔗渣碱预处理,处理液经酶水解后的糖质量分数达18.65%（g/g）.     

耐盐细菌质粒的研究

本实验以1株耐盐细菌My23（耐18％NaCl）作为研究对象,采用碱裂解法对其进行质粒提取,结果表明可以提取得大小2个不同质粒;改变常规提取方法中的部分环节,如加入STE清洗菌体的培养基成分,溶菌酶的使用,以及加入碱裂解液Ⅰ后静置20min,对该耐盐菌质粒的提取有较好的作用。经SDS法将小质粒消除后的菌株与野生型菌株的耐盐功能比较,发现提取出的小质粒与耐盐无关。将大肠杆菌DH5α制备成感受态细胞,将耐盐菌的质粒进行转化,结果进一步表明耐盐性状与质粒没有关系。     

微波辅助预处理对玉米秸秆酶解的影响

研究了微波辅助硫酸、氢氧化钠预处理对玉米秸秆酶解糖得率的影响,并对温度、酸碱添加量、预处理时间、液固比4个因素进行了单因素试验分析。结果表明预处理的最佳条件为：微波-硫酸预处理时,温度190℃,硫酸质量浓度为10 g/L,预处理时间3 min,液固比20(硫酸体积(mL)与玉米秸秆质量(g)之比)条件下,预处理得糖率及酶解得糖率分别为44.6%和30.3%;微波-氢氧化钠预处理时,温度130℃,氢氧化钠质量浓度15 g/L,预处理时间7 min,液固比30(氢氧化钠溶液体积(mL)与玉米秸秆质量(g)之比)条件下,预处理得糖率及酶解得糖率分别为1.5%和80.0%。     

用锌离子从人尿中分离尿激酶

用低浓度锌离子从人尿中沉淀尿激酶（ＵＫ）,锌离子浓度为３ｍｍｏｌ／Ｌ时,沉淀回收率为８７％～９３％,用ｐＨ１０～１０．５的２０ｇ／Ｌ硫酸铵按１∶４（ｇ∶ｍｌ）溶解ＵＫ沉淀物,ＵＫ溶解得率为９７％。溶解液用７０％饱和度的硫酸铵盐析,ＵＫ盐析收率为９１％,粗品纯度为４．０８×１０５ＩＵ／ｇ,固体效价为３．６×１０４ＩＵ／ｇ,总收率在７７％～８２％之间。每吨尿（５．００×１０６ＩＵ计）可得ＵＫ粗品（３．８～４．１）×１０６ＩＵ。该粗品可用离子交换层析或亲和层析进一步纯化。     

KGM的乙醇沉淀法提取及体外抑菌活性

以魔芋粉为原料,研究其葡甘露聚糖(KGM)的乙醇沉淀法提取条件与抑菌活性.采用单因素实验探讨魔芋粉料液比、调浆温度、乙醇(沉淀剂)体积分数和洗涤次数对KGM得率的影响,通过正交试验得出最佳提取条件.用试管二倍梯度稀释法分析KGM的体外抑菌活性.结果表明,提取KGM的最优条件为料液比1∶175(g∶mL)、调浆温度60℃、乙醇体积分数50%、洗涤2次,得率高达65.7%.KGM提取物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌表现出一定的抑菌效果,可广泛应用于医药与食品工业.     

雪莲果叶中黄酮的提取工艺优化

为优化雪莲果叶黄酮的提取工艺条件，采用正交实验法，研究溶剂浓度、料液比、浸提温度和浸提时间4个因素对雪莲果叶黄酮提取量的影响。确定了雪莲果叶黄酮提取的最优条件为用体积浓度40%的乙醇，在料液比为1∶30（g/mL）的溶剂条件下在70℃提取1.5 h，提取2次，在此条件下黄酮含量提取量达到53.41 mg/g。通过工艺优化，雪莲果叶黄酮得率高，稳定性好。     

质粒DNA纯化及内毒素去除策略研究进展

质粒DNA(plasmid DNA)是最常用的基因工程和基因疫苗载体,近年来在生物医学和环境科学等领域得到了广泛应用。质粒DNA纯化是分子生物学研究中常用的实验技术,纳米磁性粒子等固相载体技术和色谱技术优化了DNA纯化方法。对大肠杆菌质粒DNA常用纯化方法、内毒素去除策略以及自动化纯化设备进行综述,为质粒DNA的应用研究提供支持。     

噬夏孢欧文氏菌类crtB基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

噬夏孢欧文氏菌类胡萝卜素合成相关基因crtB,编码八氢番茄红素合成酶。利用PCR技术扩增出crtB基因,克隆进表达载体,构建表达质粒pET-15bcrtB。重组质粒转化大肠杆菌,构建工程菌株。经IPTG诱导,工程菌高效表达了重组八氢番茄红素合成酶,表达量占菌体总蛋白的40%。重组蛋白以包含体形式存在,包含体经洗涤、尿素溶解、复性并经镍离子树脂亲和层析、Superdex 75凝胶层析柱纯化,得到了电泳纯的重组八氢番茄红素合成酶,带有His-tag的该蛋白分子量为35 kDa,pI值为7.3。     

质粒pcDNA3.1-IL-24的制备和纯化

探索基因治疗用质粒pcDNA3.1-IL-24的规模化制备和纯化工艺。碱性裂解提取质粒后,以异丙醇和LiCl沉淀法去除大分子RNA。然后,使用DEAE Sepharose FF离子交换层析去除染色体DNA、小分子RNA、蛋白质等杂质。经本工艺纯化的质粒pcDNA3.1-IL-24浓度为727μg/mL,纯度为1.87,蛋白质含量为0.007μg/mL质粒DNA,未检测到RNA、抗生素残留。此工艺避免使用动物源性酶类及有毒试剂,有效去除质粒DNA制备过程中产生的杂质,可实现药剂水平质粒DNA的规模制备。