乳腺癌自身抗体标志物的筛选和鉴定

目的:应用自身抗体技术从乳腺癌cDNA T7噬菌体展示文库筛选乳腺肿瘤相关抗原。方法:运用生物淘洗富集技术、噬菌斑转印分析和免疫化学检测方法,用正常人和乳腺癌病人血清从一个乳腺癌cDNA T7噬菌体文库中筛选肿瘤相关噬菌体克隆。通过PCR和测序的方法分析开放阅读框架内的序列,BLAST比对识别出这些噬菌体表达蛋白。然后用酶联免疫吸附(ELISA)的方法对87个乳腺癌病人和87个正常人血清样品,检测每一个开放阅读框架内的噬菌体表达蛋白的自身抗体。用逻辑回归模型和留一交叉验证评估单个标志物和多标志物联合诊断的准确率。结果:筛选得到3个开放阅读框架之内的噬菌体克隆ASB-9,SERAC-1和RELT。用87份乳腺癌病人血清和87份正常人血清对这3个噬菌体表达蛋白进行验证,逻辑回归模型联合检测的敏感性达到80%,特异性达到100%;留一交叉验证3者联合的预测值敏感性和特异性分别达到76.5%和82.4%。ROC曲线分析和留一法都表明多个标志物联合检测的价值要高于单标志物,预示着多标志物联合在诊断中的重要性。结论:对乳腺癌来说,血清自身抗体是其早期检测和诊断的一种有效方法,而且多抗体联合应用可实现更高的诊断准确率。     

HPV-58型E7蛋白抗原模拟表位的筛选及分析

利用该实验室成熟的噬菌体随机十二肽库筛选平台,对HPV-58型E7蛋白单克隆抗体株4C4a、6C7a进行3轮亲和筛选,得到2组、各8个阳性噬菌体克隆.阳性噬菌体氨基酸序列用以模拟单抗(靶蛋白)特异性识别的HPV-58型E7蛋白的抗原表位.将测得的阳性噬菌体多肽序列及HPV-58型E7蛋白氨基酸序列进行生物信息学分析后,进行线性序列比对及构象性表位预测及分析.构象性表位的预测借力于EpiSearch Server和Pepitope Server,对构象性表位匹配及簇的寻找提供有力支持,也为早期诊断及研制多肽疫苗提供参考.     

抗癌胚抗原纳米抗体展示文库的构建与筛选

利用噬菌体展示技术进行纳米抗体库的构建和筛选,获得抗癌胚抗原(CEACAM5)的高亲和力、强特异性纳米抗体,为相关癌症诊断及靶向治疗的应用奠定基础。使用重组CEACAM5抗原免疫羊驼,分离免疫后羊驼的外周血淋巴细胞,提取总RNA后通过RT-PCR技术扩增羊驼重链抗体可变区(VHH)片段,构建纳米抗体文库。采用噬菌体展示技术和固相淘选方法,筛选得到强阳性克隆,经大肠杆菌表达和镍离子亲和层析获得纳米抗体,最终利用Biacore分析其亲和力和特异性。通过3轮的淘选,获得一株纳米抗体亲和力达到2.6×10-10mol·L-1,对同源性蛋白CEACAM-1、-3、-6、-8及肿瘤蛋白AFP均无交叉反应性。利用噬菌体展示技术成功获得了抗癌胚抗原(CEACAM5)的高亲和力、强特异性纳米抗体,可用于后续相关癌症诊断和靶向治疗。     

噬菌体展示技术筛选布鲁氏菌OMP25特异性结合肽

利用噬菌体展示技术和ELISA筛选与布鲁氏菌外膜蛋白OMP25结合的七肽分子.将纯化的OMP25-32a包被于聚乙烯板上,对随机噬菌体七肽库进行4轮筛选后挑取噬菌体克隆,ELISA鉴定噬菌体克隆对OMP25-32a的亲和力和特异性.并将阳性噬菌体克隆扩增、测序、获得多肽氨基酸序列,生物信息分析筛选出特异的环形七肽分子.结果从噬菌体七肽库中筛选出42个噬菌体阳性克隆,测序翻译得到对应的42个环形七肽分子;ELISA结果表明,42个噬菌体中9#、11#、35#、38#和41#与融合蛋白OMP25-32a具有较强的亲和性;生物信息学分析42个环形七肽分子中11#环形七肽与锌指蛋白ZNF446有高度同源性.筛选获得了与布鲁氏菌外膜蛋白OMP25相互作用的环形七肽分子LT-7C,为进一步研究抗布鲁氏菌病的药物治疗提供科学依据.     

应用毛细管电泳表征噬菌体与丹酚酸B的相互作用

基于Hummel-Dreyer毛细管电泳方法研究经噬菌体展示库生物淘洗亲和筛选出的噬菌体和丹酚酸B之间的结合作用,结合系数由PRISM软件中Scatchard方程曲线拟合计算得出.实验结果表明,筛选出的该噬菌体克隆的表面蛋白和丹酚酸B具有特异性的结合作用,也说明利用毛细管电泳测定噬菌体和丹酚酸B的结合系数是可行的.     

肺癌肿瘤标志物蛋白芯片检测系统对乳腺癌的诊断价值

目的:研究肺癌肿瘤标志物蛋白芯片检测系统对乳腺癌的诊断价值。方法:利用双荧光标记的肺癌肿瘤标志物蛋白芯片诊断系统对15份乳腺癌患者和15份正常对照人群血清样品进行检测,然后从系统中寻找可用于乳腺癌检测的肺癌肿瘤标志物,并根据ROC曲线评估其诊断价值。结果:在肺癌肿瘤标志物检测系统中,除了3E7噬菌体蛋白(P=0.0526,AUC=0.712),没有发现更多与乳腺癌相关的肿瘤标志物。结论:绝大多数的肺癌肿瘤标志物都不适宜作为乳腺癌的检测指标,但是3E7有可能是特异性标志物,对于诊断有一定的诊断价值,有待进一步研究。     

sFcγRⅡb蛋白结合肽的筛选与鉴定

FcγRⅡb是免疫球蛋白G受体( FcγR)中唯一的抑制型受体,在免疫反应的负性调节方面发挥重要作用.为了筛选sFcγRⅡb的蛋白结合肽,以重组sFcγRⅡb蛋白为靶分子,采用噬菌体肽库展示技术对sFcγRⅡb结合肽进行筛选.利用ELISA鉴定每轮洗脱噬菌体与sFcγRⅡb蛋白亲和力,经过4轮筛选,挑取40个噬菌体克隆进行序列测定,获得28种不同的12肽序列.经ELISA法鉴定噬菌体与sFcγRⅡb蛋白结合活性,得到sFcγRⅡb蛋白高特异性、高亲和力结合肽FHKMPWYMSMYY,为进一步研究FcγRⅡb的作用机制和探索结合肽的功能提供实验基础.     

基于蛋白质组学技术筛查维吾尔族妇女宫颈癌前病变患者血浆蛋白预警标志物

 依托蛋白质二维液相色谱和质谱技术,寻找与新疆维吾尔族妇女宫颈癌癌前病变高度宫颈鳞状上皮内瘤样变(HSIL)相关的血浆预警蛋白标志物,旨在对宫颈癌做到早期预防和诊断。收集维吾尔族HSIL(21例)和宫颈炎(22例)患者血浆标本并制备血浆低丰度蛋白质组样品,通过对蛋白质二维液相色谱系统的分离与鉴别分析,筛选出差异表达的组分,并运用质谱和生物信息学技术进行鉴定和功能识别分析。确定了宫颈炎和HSIL患者的基于蛋白质等电点和疏水性特征的血浆低丰度蛋白质组图谱,筛选出10个差异表达蛋白组分。结果表明,在HSIL患者血浆中3个低丰度蛋白组分含量明显上升,1个组分含量下降;而通过质谱技术鉴定出31种蛋白质,其中4种蛋白质与肿瘤进程密切相关,分别是代谢相关蛋白(APOA1)、信号转导相关蛋白(mTOR、EphA3)和免疫功能相关蛋白(HLA-DQB1)。本文针对维吾尔族妇女这一宫颈癌高发人群,展开癌前病变患者血浆低丰度蛋白组表达水平的研究,鉴定出多种差异表达血浆蛋白预警标志物,为本区宫颈癌的预防和早期鉴别诊断及癌变机制研究提供了依据。     

胃癌细胞及临床标本特异结合的多肽的筛选与鉴定

从噬菌体随机十二肽库筛选出两个与人胃腺癌细胞SGC-7901表面特异结合的阳性噬菌体克隆,用细胞免疫荧光法鉴定这些克隆与SGC-7901结合的特异性,据亲和力确定克隆GSP5为最佳克隆,进一步以免疫细胞/组织化学等方法鉴定此克隆与胃癌细胞和临床组织的特异性/敏感性.结果显示,噬菌体克隆GSP5对SGC-7901细胞及胃癌临床组织具有较好的结合特异性/敏感性.该多肽有望成为胃癌分子影像诊断与靶向治疗的候选多肽导向分子.     

肺癌高危患者不同标本液基细胞学检查的临床意义

探讨液基细胞学检查(LCT)技术在痰、胸水、纤维支气管镜毛刷标本的肺癌检测方面较传统细胞涂片(CS)的优势,评估LCT是否有助于肺癌的早期诊断。选择359例肺癌高危患者为研究对象,将痰、胸水、纤维支气管镜毛刷标本分为LCT组、CS组。采用3级分类诊断法诊断LCT组和CS组,将细胞学检查结果分为阴性、阳性(可疑恶性和恶性)。采用筛检、诊断试验分析方法,计算灵敏度、特异度、假阳性率(误诊率)、假阴性率(漏诊率)、一致率及约登指数。不同组别采用Riddit分析方法进行比较;并分析两种方法的涂片质量和检出的癌细胞的形态结构。两种不同方法筛查三种来源标本肺癌细胞结果的比较如下:(1)灵敏度:LCT组灵敏度均高于CS组(P0.01),差异有统计学意义。(2)特异度:LCT组与CS组差异无统计学意义(P=0.325)。(3)一致率:LCT组明显高于CS组(P0.01),差异有统计学意义。(4)假阴性率:痰、胸水、纤支镜毛刷标本LCT组筛查肺癌的假阴性率低于CS组。(5)假阳性率:痰、纤支镜毛刷标本LCT组筛查肺癌的假阳性率低于CS组,胸水LCT组筛查肺癌的假阳性率高于CS组。(6)LCT组在涂片质量、癌细胞形态学判断方面较CS组好。说明液基细胞学检测技术对肺癌的诊断价值高于传统细胞学检测,可降低肺癌的误诊率及漏诊率,具有重要的临床应用价值。     

肺癌高危患者不同标本液基细胞学检查的临床意义的研究

探讨液基细胞学检查(LCT)技术在痰、胸水、纤维支气管镜毛刷标本的肺癌检测方面较传统细胞涂片(CS)的优势,评估LCT是否有助于肺癌的早期诊断。选择359例肺癌高危患者为研究对象,将痰、胸水、纤维支气管镜毛刷标本分为LCT组、CS组。采用3级分类诊断法诊断LCT组和CS组,将细胞学检查结果分为阴性、阳性(可疑恶性和恶性)。采用筛检、诊断试验分析方法,计算灵敏度、特异度、假阳性率(误诊率)、假阴性率(漏诊率)、一致率及约登指数。不同组别采用Riddit分析方法进行比较;并分析两种方法的涂片质量和检出的癌细胞的形态结构。两种不同方法筛查三种来源标本肺癌细胞结果的比较如下:(1)灵敏度:LCT组灵敏度均高于CS组(P0.01),差异有统计学意义。(2)特异度:LCT组与CS组差异无统计学意义(P=0.325)。(3)一致率:LCT组明显高于CS组(P0.01),差异有统计学意义。(4)假阴性率:痰、胸水、纤支镜毛刷标本LCT组筛查肺癌的假阴性率低于CS组。(5)假阳性率:痰、纤支镜毛刷标本LCT组筛查肺癌的假阳性率低于CS组,胸水LCT组筛查肺癌的假阳性率高于CS组。(6)LCT组在涂片质量、癌细胞形态学判断方面较CS组好。说明液基细胞学检测技术对肺癌的诊断价值高于传统细胞学检测,可降低肺癌的误诊率及漏诊率,具有重要的临床应用价值。     

抗口蹄疫病毒phage-scFv及可溶性scFv的构建

利用重组DNA技术在抗口蹄疫病毒单克隆抗体1C 7 VH基因和VL基因之间导入一段连接肽[(G ly4Ser)3],采用重叠延伸拼接法,经聚合酶链反应(PCR)扩增获得scF v基因。将scF v基因克隆至噬菌粒pCANTAB 5E载体,转化E.coli TG 1,构建噬菌体抗体文库。用M 13KO 7辅助噬菌体挽救及固相口蹄疫病毒(FMDV)抗原对噬菌体抗体文库的三轮“吸附-洗脱-扩增”的淘洗,筛选出scFv阳性克隆。将阳性克隆转化E.coli BH 2151,通过异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导可溶性scFv蛋白的表达。酶联免疫吸附实验(EL ISA)检测表明:scFv克隆表达的phage-scFv及可溶性scFv与FMDV亲和力高,特异性强。     

高分辨胸部CT对肺部磨玻璃结节及早期肺癌的筛查的临床意义探究

探究高分辨胸部CT对肺部磨玻璃结节及早期肺癌的筛查的临床意义。对(兰州市肺科医院2014-2017年体检者胸部CT的影像资料搜集整理,并对发现的肺部磨玻璃结节(GGN)进行连续随访,记录其直径、密度、数量和位置。结果:80例胸部高分辨率CT扫描体检者中(男56例,女性24例);其中3例男性有肺部磨玻璃结节,有1例为单发肺部磨玻璃结节,其余2例肺内为多发肺部磨玻璃结节;2例女性有肺部磨玻璃结节,并且均为多发肺部磨玻璃结节;总检出率为6.25%,到2017年为止,2例女性肺部磨玻璃结节的在随访过程中增大。3例男性的肺部磨玻璃结节进行手术切除,其病理都是早期腺癌。结论:高分辨胸部CT可以帮助筛查老年人群的早期肺癌,在临床上应该广泛使用该检查方法。     

血小板参数在肺部常见疾病患者中的变化及临床意义分析

目的探究血小板相关参数在肺部常见疾病(肺部感染、肺癌、慢性阻塞性肺疾病(COPD))患者变化的临床意义。方法选择安徽医科大学第一附属医院2016年10月至2018年9月收入院的肺部感染、肺癌、COPD的住院患者各50例,以性别、年龄相匹配的该院同期健康体检者50例作为对照组,采用Sysmex XE-2100血细胞分析仪检测血小板相关参数:血小板计数(PLT)、血小板压积(PCT)、血小板分布宽度(PDW)、平均血小板体积(MPV)和大血小板比率(P-LCR)。结果将肺部感染、肺癌以及COPD归类为疾病组,疾病组PLT、PCT明显高于对照组(P0.05),而PDW、MPV、P-LCR两组间无统计学意义(P0.05)。肺部感染组和肺癌组PLT、PCT均高于对照组与COPD组(P0.05),而肺部感染组PDW、MPV、P-LCR均低于其他3组(P0.05)。PLT和PCT的ROC曲线面积AUC均大于0.5,提示PLT和PCT具有诊断疾病的价值。结论血小板参数的测定尤其PLT和PCT的测定对肺部感染、肺癌和COPD可进行辅助鉴别诊断,对病情评估具有一定临床诊断价值。     

尿激酶短肽抑制剂的初步研究

以尿激酶为目标蛋白, 在噬菌体表面展示六肽库中对尿激酶的短肽类抑制剂进行了三轮特异性筛选. 提高噬菌体与尿激酶的比例及缩短作用时间从而提高筛选压力后, 与尿激酶亲和结合的噬菌体得到富集. 通过对第三轮筛选到的重组噬菌体的DNA序列分析, 获得一组相对保守的肽序列. 相应的合成短肽 NEPKAN 和VSPKVL 对尿激酶的抑制常数分别为32.5 μmol/L和88.6 μmol/L.     

抗克伦特罗噬菌体单链抗体库的构建、筛选及鉴定

利用噬菌体展示技术构建克伦特罗(CBL)单链抗体(scFv)库,从中筛选CBL特异性噬菌体scFv,从而成功扩增出抗CBL的VL,VH基因片段并采用重叠延伸PCR拼接为全长的scFv基因片段,抗体库库容约为1.6×104,经4轮吸附—洗脱—扩增的富集,采用酶联免疫吸附测定(ELISA)法筛选到6个具有CBL结合活性的噬菌体scFv,为进一步大量表达CBL单链抗体奠定了基础.     

展示p53蛋白表位噬菌体phage-SD的制备及应用

[目的]利用噬菌体展示技术制备一种可用于检测血清p53抗体的噬菌体.[方法]利用基因工程手段将编码p53蛋白N端20～31位的多肽SD的基因克隆到丝状噬菌体载体fADL-le的pIII蛋白基因中，制备展示该外源肽的噬菌体phage-SD并进行了Western blot鉴定.在此基础上，分别以phage-SD和重组p53蛋白为检测抗原，利用ELISA方法对乳腺癌患者血清p53抗体进行检测.[结果]成功制备出能特异性识别血清p53抗体的噬菌体phage-SD.ELISA检测结果表明，60例乳腺癌患者中phage-SD检测到13例p53抗体阳性患者，检出率为21.67%,与重组p53蛋白检测效率(21.67%)一致.[结论]成功制备一种灵敏度高、特异性强的可用于血清p53抗体检测的噬菌体phage-SD,为新型血清p53抗体检测试剂的开发及临床应用奠定基础.     

肿瘤靶向多肽生物淘选技术研究进展

生物淘选肿瘤或癌细胞的各种特异性靶向多肽是探索肿瘤早期诊断和治疗方法的有效途径.特异性靶向多肽既可用于探测肿瘤细胞表型特征,又可将其与抗癌药物结合进行靶向治疗,同时还可作为体内肿瘤的成像制剂,用于肿瘤及肿瘤细胞微转移的早期探测.噬菌体展示肽库技术能够有效地进行生物淘选或识别出与癌或肿瘤细胞某一靶点连结的,具有特异性、高亲和性的多肽.近年来,利用体内或体外噬菌体展示肽库技术已成功地淘选或识别出一些癌细胞的靶向多肽.本文就这些方面的研究进展进行了简要阐述,重点介绍了癌或肿瘤细胞靶向多肽的体外和体内生物淘选最新技术和临床应用.     

利用噬菌体肽库筛选小肽免疫抑制剂

利用MT-2细胞系特异性表达白细胞介素2受体α(IL-2R α)在细胞表面,作为靶蛋白在噬菌体六肽库中筛选,经过4轮筛选得到能特异性结合IL-2R α的配体,挑选出与IL-2R α亲和性高的21个噬菌体克隆,经过DNA测序,得到3组肽序列,其中2组序列分别与白细胞介素2(IL-2)的N端17-24(LLLDLQMI)序列和C端114-121(IVEFLNRW)序列相似,另外一组与IL-2R β和γ有共同的保守序列(WSXWS)相似.因此推测这些筛选到的序列可能模拟IL-2与受体α相互作用的位点和IL-2R β,γ与α结合的位点.根据筛选结果,进一步合成了一个九肽AIVEFLNRW,以ConA诱导的淋巴细胞转化实验为模型,观察到这个肽在终浓度≥31.3μg/mL时抑制效果明显.     

SARS-CoV刺突蛋白受体结合区的表达及高潜在中和性人源抗体的制备

为表达SARS-CoV刺突蛋白S(Spike)受体结合区(RBD)并从中筛选高潜在中和性人源抗体,我们用原核表达并纯化的SARS-CoVSRBD进行抗体库的筛选。从多个曾患SARS的健康人血中获得淋巴细胞,PCR扩增全部抗体基因,插入Pcomb3x载体中,构建抗SARS病毒人源噬菌体抗体库。利用噬菌体表面呈现技术,从中筛选结合SARS-CoVSRBD的人源抗体并用ELISA及Westernblot鉴定阳性克隆,竞争ELISA检测人源抗体阻断SARS-CoVSRBD与其受体ACE2的结合情况。结果为构建了库容量6.2×107的免疫Fab噬菌体抗体库,重组率为75%,从中筛选获得9株特异抗SARS-CoVSRBD的人源Fab抗体,ELISA及Westernblot检测均为阳性。其中有一株能阻断SARS-CoVSRBD与其受体ACE2的结合。本实验结果表明:人源抗SARS-CoVSRBD基因工程抗体的获得,一方面将对SARS疾病的特异性预防,治疗和诊断提供新的途径,同时也提示SARS-CoV亚单位疫苗可以用于SARS疾病的预防。