核移植方法和活化方法对小鼠体细胞克隆胚胎发育的影响

用卵丘细胞为核供体进行小鼠体细胞克隆, 成功获得了一批成年体细胞克隆小鼠. 为探讨不同核移植方法和重构胚活化方法对小鼠克隆胚发育的影响, 用B6D2F1小鼠的卵丘细胞和卵母细胞作为供、受体进行核移植实验, 采用电融合和细胞质内直接显微注射的方法进行核移植, 并采用电脉冲、乙醇处理、氯化锶处理和电脉冲联合氯化锶4种不同方法对重构胚进行活化, 对克隆胚胎的体外及体内发育进行研究. 结果显示, 利用显微注射法获得重构胚胎的工作效率(90.7%)显著高于融合法获得重构胚胎的工作效率(49.7%). 乙醇、电脉冲和氯化锶3种激活方法都可以诱导孤雌胚发育到囊胚, 但前二者处理的胚胎的囊胚发育率(52.4%, 54.2%)显著低于后者(76.9%). 10 mmol/L氯化锶处理6 h活化效果最好. 融合法获得的重构胚经氯化锶或者电脉冲联合氯化锶激活后, 囊胚发育率(9.5%, 8.6%)显著高于单纯电脉冲激活(2.6%), 而乙醇活化的重构胚没有发育到囊胚阶段. 用显微注射法经氯化锶激活获得的重构胚的囊胚发育率最高(16.6%). 注射法和融合法获得的重构胚胎经氯化锶激活后进行胚胎移植, 都获得了发育到期的体细胞克隆小鼠, 发育到期率分别为 2.5%和1.4%. 结果表明, 两种核移植方法对B6D2F1 小鼠重构胚胎的早期发育能力有一定影响, 用这两种方法都可以获得体细胞克隆小鼠; 不同活化方法对重构胚胎的体外发育能力有显著影响, 在上述4种激活方式中, 氯化锶处理对克隆胚的激活效果最好.     

体细胞克隆法生产绵羊转基因囊胚

pEGFP－N1质粒分别转染5只绵羊卵巢原代颗粒细胞,G418筛选后,各取1株阳性转基因细胞作供体,进行绵羊的体细胞核移植（克隆）,共352枚体外成熟的去核卵母细胞与转基因的颗粒细胞进行电融合,得到的329枚核移植胚胎（93．5％）,用Ionomycin／6－DMAP激活,SOFaaBSA液滴体外培养7d,结果显示,312枚核移植胚胎发生卵裂（94．8％）,其中63枚发育至囊胚阶段（19．1％）,随机抽检发现,克隆胚胎在早期发育的各个阶段均表达GFP基因,4株0．5％FCS饥饿细胞克隆胚胎的囊胚率为19．6％（55／280）,胎在早期发育的各个阶段均表达GFP基因,4株0．5％FCS饥饿细胞克隆胚胎的囊胚率为19．6％（55／280）,与另外1株未饥饿细胞克隆胚胎的囊胚率（16．3％,8／49）没有显著差异（P＞0．05）,结果表明,体细胞基因转移和克隆技术的结合,可以有效地生产绵羊的转基因囊胚。     

发育重演律

个体的发育是由受精卵通过一系列细胞分化形成的,第一次细胞分化的结果是囊胚的形成。囊胚由外胚滋养层和内细胞团构成,外胚滋养层负责胚胎与外界的物质交换,以支持内细胞团的进一步分化。随后的细胞分化则导致一系列“类囊胚”的形成。“类囊胚”由外围的“类外胚滋养层”和内部的“类内细胞团”构成,“类内细胞团”为干细胞。每个“类囊胚”均由上一级“类囊胚”的“类内细胞团”形成,“类内细胞团”的分化潜能随 “类囊胚”的层级增多而逐次降低。最后一级“类囊胚”的“类内细胞团”不再形成“类囊胚”,只能形成特定的功能细胞。“类外胚滋养层”的主要作用是为其内的“类内细胞团”提供合适的微环境,以支持其发育。“类外胚滋养层”形成的组织一般为结缔组织或上皮组织。个体的发育实际上是“类囊胚”不断形成和演化的过程,该过程是生物发育普遍遵循的共同规律。     

以胚胎干细胞为核供体能促进异种重构胚的体外发育

体细胞在异种成熟的去核卵母细胞中能够去分化和重编程,并能发育到囊胚,甚至能全程发育正常出生。为了评价胚胎干细胞作为供核细胞在异种动物克隆中的意义,以小鼠胚胎干细胞（ES）为核供体,兔成熟的去核卵母细胞为受体构建异种重构胚,分析其在体外的发育能力,并以小鼠胚胎成纤维细胞和成年小鼠外耳皮肤的成纤维细胞为对照。通过核移植的方法分别把3种细胞移入成熟的兔去核卵母细胞透明带下,经电融合和激活后,在体外培养,胚胎干细胞作为供核细胞所构建的异种重构胚在体外发育到囊胚的比例为16.1％,明显高于用成年小鼠外耳皮肤成纤维细胞（0％～3.1％,P<0.05）和小鼠胚胎成纤维细胞（2.1％～3.7％,P<0.05）所构建的异种重构胚的体外囊胚发育率.重构囊胚细胞经染色体分析,证实其染色体来源于小鼠胚胎干细胞。以上结果显示,用胚胎干细胞作为供核细胞,比体细胞作为供核细胞所构建的异种重构胚更容易进行重编程,并且胚胎干细胞指导异种克隆胚胎正常发育的能力强于体细胞。     

中国红系冀南黄牛的克隆及其繁殖性能

以濒临灭绝的中国红系冀南黄牛的颗粒细胞为核供体进行了体细胞克隆研究. 共操作卵母细胞211枚, 去核166枚(79%), 构建重构胚112枚(67.4%), 其中分裂的重构胚为94枚(83%), 第7天发育成囊胚数为48枚(43%). 共移植荷斯坦奶牛受体6头, 妊娠2头(33%), 其中1头流产, 另1头产出一头健康牛犊. 比较了不同融合液(甘露醇和Zimmerman融合液)对克隆胚胎融合率和囊胚发育率的影响以及不同激活方法(钙离子载体(A23187)+6-DMAP和放线菌酮+CB)对克隆胚胎囊胚发育率的影响. 结果表明: (ⅰ) 在电场强度为2.5 kV/cm, 脉冲时间为10 ms, 脉冲次数为2的条件下, 克隆胚胎在甘露醇融合液中的电融合率比在Zimmerman融合液中的电融合率高(71% vs 61%, P＜0.05), 且囊胚发育率差异不显著(36% vs 39%, P＞0.05 ); (ⅱ) 以钙离子载体(A23187)+6-DMAP激活组与放线菌酮+CB激活组处理的克隆胚胎囊胚发育率无明显差别(42% vs 46%, P＞0.05). 依据牛的28个微卫星位点对供体牛、克隆牛和代孕母牛进行微卫星分析, 结果表明, 克隆牛与供体牛的遗传物质完全相同, 而与代孕母牛在遗传上无任何相关. 目前, 该克隆冀南黄牛已经产犊, 克隆冀南黄牛的各项繁殖性能指标均与正常冀南牛犊相符, 所产牛犊的生长发育正常.     

人类胚胎干细胞研究的有关资料

胚胎干细胞研究的突破胚胎干细胞 (ｅｍｂｒｙｏｎｉｃｓｔｅｍｃｅｌｌｓ,ＥＳ)是在胚胎发育早期———囊胚 (受精后约 5～ 7天 )中未分化的细胞。囊胚含有约 1 40个细胞 ,外表是一层扁平细胞 ,称“滋养层 (ｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔ)” ,可发育成胚胎的支持组织如胎盘等。中心的腔称“囊胚腔” ,腔内一侧的细胞群称“内细胞群 (ｉｎｎｅｒｃｅｌｌｍａｓｓ)” ,这是一群具有全部分化能力的细胞 ,它们在胚胎发育的过程中 ,可以进一步分裂、分化 ,发育成个体。内细胞群在形成内、中、外三个胚层时开始分化。每个胚层将分别分化形成人体的各种…     

小鼠囊胚内细胞团置换

运用显微操作和免疫手术法, 对昆明鼠和C₅₇BL/6鼠的囊胚进行内细胞团置换. 以切除内细胞团的昆明鼠胚胎滋养层为受体, 注射免疫手术得到的昆明鼠或C₅₇BL/6鼠的内细胞团, 获得两种重构胚. 一种是由不同昆明鼠个体的滋养层和内细胞团构建的同品系异体重构胚, 共构建192枚. 移植入17只昆明鼠受体后, 生下2只昆明小鼠. 另一种重构胚是由切除内细胞团的昆明鼠胚胎滋养层与C₅₇BL/6鼠胚胎内细胞团构建的异品系重构胚. 对此重构胚的成活率、细胞骨架和细胞数目进行了分析, 说明至少从这3个方面来说, 这种重构胚具有一定的发育潜能. 但将115枚异品系重构胚移植入昆明鼠受体后, 目前还没有后代出生. 说明来自不同个体胚胎的同品系滋养层和内细胞团重组后能够建立细胞连接, 进行信息传递并发育为正常个体, 而异品系重构胚发育能力较低. 这项研究有可能为解决动物克隆中着床率低和胎盘异常等问题提供参考方法.     

两性小鼠核移植胚胎干细胞系的建立及其在胚胎干细胞多能性评估中的研究

治疗性克隆的安全性与风险性是阻碍治疗性克隆发展的关键环节之一. 由于受到社会伦理问题的限制, 人胚胎干细胞的多能性检测只能通过畸胎瘤的方式鉴定, 与传统的小鼠生殖系嵌合鉴定方式不同. 但是两种多能性检测方式之间的区别还不清楚. 本研究利用遗传突变两性小鼠心肌成纤维细胞作为核移植供体细胞, 构建核移植胚胎, 经过体外培养获得克隆囊胚, 建立核移植胚胎干细胞系. 对胚胎干细胞系的鉴定结果表明, 两性小鼠核移植胚胎干细胞系表达所有小鼠胚胎干细胞系多能性及特异的分子标记, 如碱性磷酸酶活性, Oct4, Nanog, SSEA-1等, 干细胞注射到免疫缺陷小鼠(SCID)体内能够形成含有三胚层分化附属物的畸胎瘤组织, 证明两性小鼠核移植胚胎干细胞系具有多能性. 但通过囊胚注射的方式获得的二倍体嵌合小鼠经过交配不能获得生殖系嵌合的小鼠, 因而两性小鼠核移植胚胎干细胞系并不具有全能性, 说明体内形成三胚层分化附属物的畸胎瘤组织并不能替代传统的生殖系嵌合, 提示在人治疗性克隆胚胎干细胞系多能性鉴定中, 仍然需要更多、更严格的标准, 进而最大程度地降低治疗性克隆临床应用的风险性.     

不同类型核受体对小鼠体细胞重构胚胎发育能力的影响

为探讨昆明白小鼠不同类型的卵胞质对小鼠体细胞核移植胚胎发育的影响, 采用C57BL/6小鼠耳成纤维细胞为核供体, 昆明白小鼠卵母细胞为核受体进行单次核移植, 同时采用将重构胚类合子核移入去核合子、重构胚2-细胞卵裂球细胞核移入去核MⅡ期卵的方法进行连续核移植, 通过将重构胚2-细胞卵裂球与正常昆明白小鼠2-细胞胚胎卵裂球交换融合得到四倍体胚胎. 对所得胚胎进行体外培养, 结果发现, 以去核的昆明白小鼠MⅡ期卵母细胞为核受体进行单次核移植所得到的重构胚胎发育率很低, 且只能发育到8-细胞阶段. 两种连续核移植重构胚发育率均有所提高, 但仅重构胚类合子核移入去核合子时有囊胚出现, 囊胚发育率为1.9%. 重构四倍体胚胎囊胚发育率却很高(62.3%), 染色体分析表明其中51.5%为真正的四倍体. 结果表明, 昆明白小鼠不同类型核受体对重构胚胎的发育能力有显著影响, 其去核卵母细胞胞质对体细胞核重编程的能力较弱, 而当其与正常受精卵胞质共同作用时可较好地对体细胞核重编程.     

核质比对家兔胚胎发育的影响

通过显微操作和电融合方法人为改变原核期胚胎的核质比,比较异常核质比胚胎发育与正常胚胎发育的异同。结果表明：改变（增加或减少）原核期胚胎的核质比会使胚胎发育出现异常;虽然发育到囊胚的比例与正常胚胎无显著差异（Ｐ〉０．０５）,而且囊胚形成的时间相似,但具有异常核质比的胚胎发育到囊胚时的细胞数较正常胚胎的细胞数少。     

家蚕胚胎和幼虫时期滞育激素的组织学定位、表达和分泌路径

利用原位杂交和免疫组化方法对家蚕滞育激素(DH)基因在胚胎时期神经系统中的分布、转录水平和翻译水平的表达进行了研究. 免疫组化结果表明, 胚胎的整个中枢神经系统中, 包括脑、咽下神经节和胸神经节(TG), 都有明显的阳性细胞; 心侧体和末端腹神经节(TAG)很可能是DH的释放位点; 以地高辛标记的DH cRNA为探针的原位杂交结果表明, DH mRNA在胚胎咽下神经节的上颚、下颚和上唇3簇细胞中表达. 此外, 发现胚胎的咽下神经节的一对侧边细胞和TG的一对腹中线细胞也表达DH mRNA. 原位杂交和RT-PCR的结果表明5龄幼虫期的DH mRNA的表达定位与胚胎期基本一致.     

利用体细胞核移植技术生产转基因牛

通过电穿孔的方法, 将含有新霉素抗性(Neo^r)基因和增强绿色荧光蛋白(EGFP)基因的双标记选择载体导入胎牛输卵管上皮细胞, 获得了转基因细胞株. 以转基因细胞为核供体, 进行了牛的体细胞核移植. 重构胚胎424枚, 其中208枚体外发育至囊胚, 囊胚发育率为49.1%. 选择第7天转基因囊胚17枚移入17头同期发情的受体牛子宫角内, 共有5头受体牛妊娠, 妊娠率为29.4%. 经过正常的体内发育, 有3头转基因克隆牛出生, 产犊率为17.6%. PCR和Southern检测结果表明, 3头转基因克隆牛的基因组中都整合有外源目标基因. 并且, 绿色荧光蛋白在转基因克隆牛的耳部皮肤组织以及从耳部皮肤组织分离出的成纤维细胞中均有表达. 上述结果显示, 通过体细胞核移植技术可以有效生产转基因牛; 所构建的双标记选择载体可以有效筛选出转基因细胞和转基因克隆胚胎, 应用于转基因克隆动物的生产, 确保所培育的克隆动物均为转基因动物.     

貉早期胚胎核仁分化的研究

研究哺乳动物的早期胚胎发育对于体外受精和胚胎移植等技术的应用具有重要意义.早期胚胎发育中核仁的分化,是胚胎细胞基因活动的重要标志.最早期的哺乳动物胚胎发育是受母本的mRNA和蛋白控制的,而胚胎发育到一定阶段才开始表达自身的基因.因而,胚胎的早期发育就是一个从母本基因向胚胎基因控制转变的过程,也即基因差次表达的过程.不同种动物胚胎基因起动的时间是不一致的,如小鼠发生在2细胞期,牛为8细胞期,绵羊为16细胞期,而人为8—16细胞阶段.在貉早期发育胚胎基因表达的时间,尚不清楚.     

金黄地鼠与小鼠科间妊娠及CD57, CD68分子的表达

不同种属动物之间的妊娠是进行异种克隆的关键步骤之一. 异种动物的克隆胚胎已经构建成功, 但胚胎却不能在受体内完全发育至出生. 为揭示此现象的机理, 对金黄地鼠(Mesocricetus auratus)-小鼠(Mus musculus)科间妊娠做了研究. 体外共培养结果显示, 金黄地鼠囊胚在小鼠子宫上皮细胞单层上12, 24, 48, 72 h的黏附率和48, 72 h的扩展率均显著低于小鼠囊胚(P < 0.01 ). 经胚胎移植, 金黄地鼠的囊胚可以在不同科的动物小鼠子宫内植入并发育至D11(胚胎移植后7 d). 但与小鼠胚胎移植小鼠子宫相比, 科间胚胎移植成功率低, 并且胎儿体积明显要小. 科间妊娠D8与同种妊娠相比, 远侧蜕膜部组织疏松. 妊娠D8时, 无论科间妊娠还是同种妊娠, CD57, CD68分子的表达在远侧蜕膜部均高于次级蜕膜部. 科间妊娠CD57, CD68分子的表达丰度都小于同种妊娠. 这些结果表明, 金黄地鼠-小鼠之间可以建立科间妊娠, 但科间妊娠的胎儿发育较同种妊娠迟缓, 妊娠在一定阶段终止. CD57, CD68分子在科间、同种妊娠之间表达的差异提示, 二者免疫反应的不同可能是引起科间妊娠终止的原因之一.     

人类体细胞克隆胚的构建

人类体细胞克隆胚的构建是治疗性克隆的基础和前提. 将供体细胞核注射到成熟卵母细胞, 然后用钙离子载体(A23187)和6-甲基氨基嘌呤(6-DMAP)激活卵母细胞. 在卵母细胞活化并出现原核样核(2PN)后, 去掉雌原核而保留供体细胞核, 避免了去核时对卵母细胞进行DNA荧光染色和紫外线照射, 同时也避免了去除过多的细胞质. 经体外培养后, 有少量核移植胚发育到囊胚阶段.     

膜基质金属蛋白酶和金属蛋白酶抑制因子-1在早期胎盘中的表达及其功能的研究

用原位杂交方法研究了人早期胎盘中膜型金属蛋白酶(MT-MMP-1)和金属蛋白酶抑制因子-1(TIMP-1)的分布. 结果表明: (1) 在绒毛滋养层细胞和与其邻近的蜕膜细胞中MT-MMP-1和TIMP-1的表达量相对较高; (2) 在基底盘,Rohrs和Nitabuch纹间的外绒毛膜滋养层细胞, 滋养层和蜕膜的腺体细胞表达最高; (3) 胎膜分离层和绒毛干的少量细胞滋养层细胞以及蜕膜和绒毛干的血管壁上有明显的MT-MMP-1和TIMP-1的表达. 结果提示, 胎盘不同细胞MT-MMP与其抑制因子TIMP-1的协同表达在早期胎盘滋养层浸入和血管发生中发挥重要作用; 同时, 两者可能对在临产时在母体与胎儿的分离机制中也起某种作用.     

非休眠期成年牛耳成纤维细胞用于核移植

哺乳动物的自然生殖方式是有性生殖 ,需要精子和卵子进行受精作用 .核移植技术为哺乳动物无性生殖提供手段 .以前 ,人们多采用未分化或分化不完全的胚胎细胞作为供核细胞 .自Wilmut等人应用成年绵羊体细胞作为供核细胞进行核移植获得全程发育以来 ,体细胞核移植已在多种动物上获得成功 .Wilmut等人认为 ,应用G0 期成年体细胞作为供核细胞是核移植成功的关键 (“G0 期假定”) .为了验证“G0 期假定” ,我们用非休眠期成年牛耳成纤维细胞作为供体 ,以去核牛卵母细胞 (体外成熟 )作为受体进行核移植 .实验中核移植后电融合率达5 1 .6 % ,融合后重组卵卵裂率达 5 4.5 % ,并且有 9.1 %发育到 32细胞期 .这些结果表明 :处于非休眠期的成年牛供核体细胞移植到去核卵母细胞至少能进行早期发育     

体细胞克隆中核的重编程

尽管体细胞克隆在绵羊、牛、小鼠、猪、山羊、兔、猫、大鼠和骡子等物种中都获得了成功, 但却未能得到狗和猕猴的克隆个体, 而且克隆效率非常低. 克隆效率低使体细胞克隆技术在科研和生物技术等方面的应用受到限制. 供体核移入去核的卵细胞后, 必须经过表观遗传修饰的重编程, 回到胚胎开始发育的全能状态. 目前认为: 供体核的不完全重编程是导致克隆效率低的主要原因. 本文从DNA甲基化、组蛋白乙酰化、X染色体失活、端粒、印记基因以及其他发育相关基因的表达几个方面来探讨影响克隆效率的因素.     

LIF, VEGF, CD57和CD68在大鼠胚胎移入小鼠子宫后的表达

种间妊娠失败是异种克隆的主要障碍. 为探讨种间妊娠失败的原因, 将大鼠囊胚移入假孕第3天的小鼠子宫内. 以前的研究显示, 大鼠胚胎只能在小鼠子宫内发育到第9天. 本实验结果表明, 异种胚胎移植后母胎界面CD57和CD68分子表达较同种移植的增强. 免疫组织化学和免疫印迹研究均显示, 异种胚胎移植后白血病抑制因子(LIF)表达增强, 但血管内皮生长因子(VEGF)表达下降. 在体外共培养系统中, 大鼠外胎盘锥在小鼠子宫蜕膜细胞上黏附率、扩展率和扩展面积较同种的显著降低. 这些结果提示, 大、小鼠种间妊娠中免疫排斥反应增强, 异种胚胎侵入能力降低, 可能是导致大、小鼠种间妊娠失败的重要原因.     

不同品系间斑马鱼的细胞核移植

以斑马鱼AB品系囊胚晚期胚胎细胞为细胞核供体，以斑马鱼长鳍品系未受精的去核卵为受体，进行不同品系间斑马鱼的细胞核移植，采用显微注射法，操作胚胎1119枚，获得克隆鱼14尾，RAPD分析显示，克隆鱼与细胞核供体鱼的DNA扩增带纹一致而与受体鱼不同，表明克隆鱼的遗传物质来源于供体细胞核，模式动物斑马鱼的细胞核移植技术的建立，有望在研究动物发育过程的基因功能、细胞核的发育潜能及核质关系等重要问题上发挥作用。