连续核移植对异种克隆大熊猫胚胎发育的影响

异种体细胞核移植为拯求濒危动物提供了一条新的途径，已有的异种核移植报道证明，经休眠处理的体细胞核在异种胞质中能完成早期发育，用处于活跃分裂的大勇猛体细胞作为供核细胞移入去核的兔卵母细胞中，经电融合（融合率为71.6%）及电活化后，体外培养获得了4.2%的囊发育率，为了改善重构胚的发育率，采用连续核移植的方法，即用处于活跃分裂的来源于大熊猫－兔异种重松胚的卵裂球作为供核细胞移入去核兔卵母细胞透明带下，共进行3次连续核移植，核移植融合率分别为79.5%，84.1%和78.0%，与体细胞核移植组无显著差异；经电活化后，体外培养的异种重构胚胎获得了显著高于体细胞核移植组的胚胎发育率，囊胚发育率分别为19.4%,13.5%和10.3%（P＜0.05）。这些结果表明，未经休眠的体细胞核也能支持异种重构胚的早期发育，连续核移植可以提高异种克隆大熊猫重构胚的发育率。     

不同类型核受体对小鼠体细胞重构胚胎发育能力的影响

为探讨昆明白小鼠不同类型的卵胞质对小鼠体细胞核移植胚胎发育的影响, 采用C57BL/6小鼠耳成纤维细胞为核供体, 昆明白小鼠卵母细胞为核受体进行单次核移植, 同时采用将重构胚类合子核移入去核合子、重构胚2-细胞卵裂球细胞核移入去核MⅡ期卵的方法进行连续核移植, 通过将重构胚2-细胞卵裂球与正常昆明白小鼠2-细胞胚胎卵裂球交换融合得到四倍体胚胎. 对所得胚胎进行体外培养, 结果发现, 以去核的昆明白小鼠MⅡ期卵母细胞为核受体进行单次核移植所得到的重构胚胎发育率很低, 且只能发育到8-细胞阶段. 两种连续核移植重构胚发育率均有所提高, 但仅重构胚类合子核移入去核合子时有囊胚出现, 囊胚发育率为1.9%. 重构四倍体胚胎囊胚发育率却很高(62.3%), 染色体分析表明其中51.5%为真正的四倍体. 结果表明, 昆明白小鼠不同类型核受体对重构胚胎的发育能力有显著影响, 其去核卵母细胞胞质对体细胞核重编程的能力较弱, 而当其与正常受精卵胞质共同作用时可较好地对体细胞核重编程.     

非休眠期成年牛耳成纤维细胞用于核移植

哺乳动物的自然生殖方式是有性生殖 ,需要精子和卵子进行受精作用 .核移植技术为哺乳动物无性生殖提供手段 .以前 ,人们多采用未分化或分化不完全的胚胎细胞作为供核细胞 .自Wilmut等人应用成年绵羊体细胞作为供核细胞进行核移植获得全程发育以来 ,体细胞核移植已在多种动物上获得成功 .Wilmut等人认为 ,应用G0 期成年体细胞作为供核细胞是核移植成功的关键 (“G0 期假定”) .为了验证“G0 期假定” ,我们用非休眠期成年牛耳成纤维细胞作为供体 ,以去核牛卵母细胞 (体外成熟 )作为受体进行核移植 .实验中核移植后电融合率达5 1 .6 % ,融合后重组卵卵裂率达 5 4.5 % ,并且有 9.1 %发育到 32细胞期 .这些结果表明 :处于非休眠期的成年牛供核体细胞移植到去核卵母细胞至少能进行早期发育     

核移植方法和活化方法对小鼠体细胞克隆胚胎发育的影响

用卵丘细胞为核供体进行小鼠体细胞克隆, 成功获得了一批成年体细胞克隆小鼠. 为探讨不同核移植方法和重构胚活化方法对小鼠克隆胚发育的影响, 用B6D2F1小鼠的卵丘细胞和卵母细胞作为供、受体进行核移植实验, 采用电融合和细胞质内直接显微注射的方法进行核移植, 并采用电脉冲、乙醇处理、氯化锶处理和电脉冲联合氯化锶4种不同方法对重构胚进行活化, 对克隆胚胎的体外及体内发育进行研究. 结果显示, 利用显微注射法获得重构胚胎的工作效率(90.7%)显著高于融合法获得重构胚胎的工作效率(49.7%). 乙醇、电脉冲和氯化锶3种激活方法都可以诱导孤雌胚发育到囊胚, 但前二者处理的胚胎的囊胚发育率(52.4%, 54.2%)显著低于后者(76.9%). 10 mmol/L氯化锶处理6 h活化效果最好. 融合法获得的重构胚经氯化锶或者电脉冲联合氯化锶激活后, 囊胚发育率(9.5%, 8.6%)显著高于单纯电脉冲激活(2.6%), 而乙醇活化的重构胚没有发育到囊胚阶段. 用显微注射法经氯化锶激活获得的重构胚的囊胚发育率最高(16.6%). 注射法和融合法获得的重构胚胎经氯化锶激活后进行胚胎移植, 都获得了发育到期的体细胞克隆小鼠, 发育到期率分别为 2.5%和1.4%. 结果表明, 两种核移植方法对B6D2F1 小鼠重构胚胎的早期发育能力有一定影响, 用这两种方法都可以获得体细胞克隆小鼠; 不同活化方法对重构胚胎的体外发育能力有显著影响, 在上述4种激活方式中, 氯化锶处理对克隆胚的激活效果最好.     

体细胞核移植生产绿色荧光蛋白转基因猪

体细胞核移植转基因动物制作路线是目前生产转基因家畜的最佳方法. 绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)转基因猪研究可以为转基因家猪育种、人类疾病模型和人类异种器官移植研究奠定良好的基础. 本研究对脂质体转染猪胎儿成纤维细胞的技术程序进行了筛选, 以绿色荧光蛋白基因转染后的阳性细胞作为体细胞核移植的核供体, 以体外成熟卵母细胞为核受体, 构建了绿色荧光蛋白转基因克隆猪胚胎, 并对重构胚在体外和体内发育情况以及绿色荧光蛋白表达情况进行了跟踪研究. 结果显示, 采用4.0 μL/mL脂质体转染试剂, 1.6 μg/mL质粒DNA, 转染6 h可以获得最佳的转染效果, 转染效率达3.61%; GFP转基因体细胞重构胚体外囊胚发育率为10%, GFP阳性胚胎率为48%; 重构胚移植于10头受体后, 有5头妊娠, 3头受体发育到期, 共出生克隆猪6头, 其中4头为GFP阳性, 经DNA检测确认为GFP转基因猪; 转基因克隆胚胎移植出生率为1.0%, 阳性个体出生率为0.7%. 结果表明, 脂质体转染试剂可以高效转染猪胎儿成纤维细胞, 获得的阳性细胞具有支持猪全程发育的潜能. 本研究对我国体细胞克隆转基因猪的研究具有重要的参考价值.     

人类体细胞克隆胚的构建

人类体细胞克隆胚的构建是治疗性克隆的基础和前提. 将供体细胞核注射到成熟卵母细胞, 然后用钙离子载体(A23187)和6-甲基氨基嘌呤(6-DMAP)激活卵母细胞. 在卵母细胞活化并出现原核样核(2PN)后, 去掉雌原核而保留供体细胞核, 避免了去核时对卵母细胞进行DNA荧光染色和紫外线照射, 同时也避免了去除过多的细胞质. 经体外培养后, 有少量核移植胚发育到囊胚阶段.     

体细胞克隆牛: 供体细胞和受体的影响

利用体外培养的成年母牛(GN)和公牛(GLV)的外耳成纤维细胞作为核供体, 进行了规模较大的克隆牛研究, 并成功地获得了一批成年体细胞克隆牛犊. 经核移植构建的重构胚的囊胚发育率分别为23.98%(GN, 123/513)和29.55%(GLV, 138/467). 然而, 雌性重构胚(GN)发育满期的比例却明显高于雄性重构胚(GLV), 分别为8.02%和1.82%. 比较了鲁西黄牛、青年Holstein奶牛及经产Holstein奶牛3种不同受体牛的移植效果. 在移植GN重构胚时, 3种受体牛的妊娠率无显著差异, 但黄牛的流产率高达85.71%, 显著高于青年奶牛及经产奶牛的流产率(分别为14.29%和0%, P < 0.05). 黄牛受体生产的克隆牛犊占移植胚胎总数的1.54%, 显著低于青年Holstein奶牛及经产Holstein奶牛(分别是10.39%及20.0%, P < 0.05). 而移植GLV重构胚时, 3种受体牛的妊娠率、流产率及产犊比率均无显著差异.     

微卫星DNA分析证明异种克隆大熊猫重构胚的核来自大熊猫供体

建立了一种从早期囊胚中提取ＤＮＡ以进行核内和核外ＤＮＡ分析的方法，用这种方法从异种克隆大熊猫重构重构胚中提取总ＤＮＡ，以大熊猫特异的微卫星ＤＮＡ引物成功地扩增出了微卫星座位ｇ＾０１０，ＰＣＲ产物双向测序表明，２个重构胚与大熊猫供体对照序列完全一致。结果证明该异种大熊猫重构胚的核的确来自大熊猫供体细胞核。     

低氧培养早期胚胎克隆小型猪(Sus Scrofa)

猪的体细胞克隆在人类的异种器官移植方面有着巨大的应用前景. 以中国实验用小型猪胎儿成纤维细胞为核供体, 从屠宰场采集初情期前母猪的卵巢, 卵母细胞体外成熟后去核构建克隆胚胎, 重构卵电融合并激活, 在7% O₂, 5% CO₂及88% N₂的气相条件下NCSU-23或PZM-3培养基培养. 给3头代孕母猪移植230枚克隆胚胎, 其中一头妊娠足月并产下3头仔猪, 生产克隆猪的效率达到1.3%; 其中一头健康状况良好, 存活至今, 毛色及DNA微卫星遗传分析证实为克隆个体. 以上结果表明, 利用初情期前母猪的卵母细胞, 克隆胚胎培养在低氧条件下, 是生产克隆猪的一条有效途径.     

体细胞克隆法生产绵羊转基因囊胚

pEGFP－N1质粒分别转染5只绵羊卵巢原代颗粒细胞，G418筛选后，各取1株阳性转基因细胞作供体，进行绵羊的体细胞核移植（克隆），共352枚体外成熟的去核卵母细胞与转基因的颗粒细胞进行电融合，得到的329枚核移植胚胎（93．5％），用Ionomycin／6－DMAP激活，SOFaaBSA液滴体外培养7d，结果显示，312枚核移植胚胎发生卵裂（94．8％），其中63枚发育至囊胚阶段（19．1％），随机抽检发现，克隆胚胎在早期发育的各个阶段均表达GFP基因，4株0．5％FCS饥饿细胞克隆胚胎的囊胚率为19．6％（55／280），胎在早期发育的各个阶段均表达GFP基因，4株0．5％FCS饥饿细胞克隆胚胎的囊胚率为19．6％（55／280），与另外1株未饥饿细胞克隆胚胎的囊胚率（16．3％，8／49）没有显著差异（P＞0．05），结果表明，体细胞基因转移和克隆技术的结合，可以有效地生产绵羊的转基因囊胚。     

小鼠囊胚内细胞团置换

运用显微操作和免疫手术法, 对昆明鼠和C₅₇BL/6鼠的囊胚进行内细胞团置换. 以切除内细胞团的昆明鼠胚胎滋养层为受体, 注射免疫手术得到的昆明鼠或C₅₇BL/6鼠的内细胞团, 获得两种重构胚. 一种是由不同昆明鼠个体的滋养层和内细胞团构建的同品系异体重构胚, 共构建192枚. 移植入17只昆明鼠受体后, 生下2只昆明小鼠. 另一种重构胚是由切除内细胞团的昆明鼠胚胎滋养层与C₅₇BL/6鼠胚胎内细胞团构建的异品系重构胚. 对此重构胚的成活率、细胞骨架和细胞数目进行了分析, 说明至少从这3个方面来说, 这种重构胚具有一定的发育潜能. 但将115枚异品系重构胚移植入昆明鼠受体后, 目前还没有后代出生. 说明来自不同个体胚胎的同品系滋养层和内细胞团重组后能够建立细胞连接, 进行信息传递并发育为正常个体, 而异品系重构胚发育能力较低. 这项研究有可能为解决动物克隆中着床率低和胎盘异常等问题提供参考方法.     

来源于哺乳动物胚胎细胞和成体细胞的成活后代

哺乳动物卵母细胞受精后随之开始连续的分裂和分化，先是形成早期胚胎．然后形成构成成年动物的各种类型的细胞。将处于发育到某一特定阶段的单个细胞的核转入已去核的未受精的卵母细胞，这为观察细胞分化至该阶段是否涉及不可逆的遗传修饰提供了一个机会。首例由诱导进入静止期的已分化的胚胎细胞核移植发育而成的后代已经诞生。用同样的方法，我们在此报道来源于成体乳腺、胎羔和胚胎建立的三种新细胞群的成活羔羊的诞生。羔羊来源于成体细胞这一年实证实了，这种细胞的分化并未涉及发育所需的遗传物质的不可逆修饰、来源于已分化的胎羔细…     

两性小鼠核移植胚胎干细胞系的建立及其在胚胎干细胞多能性评估中的研究

治疗性克隆的安全性与风险性是阻碍治疗性克隆发展的关键环节之一. 由于受到社会伦理问题的限制, 人胚胎干细胞的多能性检测只能通过畸胎瘤的方式鉴定, 与传统的小鼠生殖系嵌合鉴定方式不同. 但是两种多能性检测方式之间的区别还不清楚. 本研究利用遗传突变两性小鼠心肌成纤维细胞作为核移植供体细胞, 构建核移植胚胎, 经过体外培养获得克隆囊胚, 建立核移植胚胎干细胞系. 对胚胎干细胞系的鉴定结果表明, 两性小鼠核移植胚胎干细胞系表达所有小鼠胚胎干细胞系多能性及特异的分子标记, 如碱性磷酸酶活性, Oct4, Nanog, SSEA-1等, 干细胞注射到免疫缺陷小鼠(SCID)体内能够形成含有三胚层分化附属物的畸胎瘤组织, 证明两性小鼠核移植胚胎干细胞系具有多能性. 但通过囊胚注射的方式获得的二倍体嵌合小鼠经过交配不能获得生殖系嵌合的小鼠, 因而两性小鼠核移植胚胎干细胞系并不具有全能性, 说明体内形成三胚层分化附属物的畸胎瘤组织并不能替代传统的生殖系嵌合, 提示在人治疗性克隆胚胎干细胞系多能性鉴定中, 仍然需要更多、更严格的标准, 进而最大程度地降低治疗性克隆临床应用的风险性.     

由胎儿成纤维细胞而来的克隆山羊(Capra hircus)

哺乳动物的克隆是国内外科学研究的热问题。用体外培养的胎儿成纤维细胞作供体细胞不仅可以研究发育生物学中发育与分化的理论问题，而且与早期胚胎细胞作供体细胞相比，大大增加了供体细胞的数量。     

中国红系冀南黄牛的克隆及其繁殖性能

以濒临灭绝的中国红系冀南黄牛的颗粒细胞为核供体进行了体细胞克隆研究. 共操作卵母细胞211枚, 去核166枚(79%), 构建重构胚112枚(67.4%), 其中分裂的重构胚为94枚(83%), 第7天发育成囊胚数为48枚(43%). 共移植荷斯坦奶牛受体6头, 妊娠2头(33%), 其中1头流产, 另1头产出一头健康牛犊. 比较了不同融合液(甘露醇和Zimmerman融合液)对克隆胚胎融合率和囊胚发育率的影响以及不同激活方法(钙离子载体(A23187)+6-DMAP和放线菌酮+CB)对克隆胚胎囊胚发育率的影响. 结果表明: (ⅰ) 在电场强度为2.5 kV/cm, 脉冲时间为10 ms, 脉冲次数为2的条件下, 克隆胚胎在甘露醇融合液中的电融合率比在Zimmerman融合液中的电融合率高(71% vs 61%, P＜0.05), 且囊胚发育率差异不显著(36% vs 39%, P＞0.05 ); (ⅱ) 以钙离子载体(A23187)+6-DMAP激活组与放线菌酮+CB激活组处理的克隆胚胎囊胚发育率无明显差别(42% vs 46%, P＞0.05). 依据牛的28个微卫星位点对供体牛、克隆牛和代孕母牛进行微卫星分析, 结果表明, 克隆牛与供体牛的遗传物质完全相同, 而与代孕母牛在遗传上无任何相关. 目前, 该克隆冀南黄牛已经产犊, 克隆冀南黄牛的各项繁殖性能指标均与正常冀南牛犊相符, 所产牛犊的生长发育正常.     

人类成纤维细胞作为人胚胎干细胞饲养层细胞的初步研究

为了避免将来应用时，人类胚胎干细胞接触到小鼠细胞和小鼠可能存在的病理原体，利用人类自身的成纤维细胞作为体外培养人胚胎干细胞的饲养层一直是其将来应用中需要解决的问题，用流产胎儿和成体包皮细胞分离的成纤维细胞作为饲养层，成功地将人类胚胎干细胞传代，传代过程中的人ES细胞在人的成纤维细胞层上保持不分化的特征。     

胚胎干细胞的研究与利用

小鼠胚胎干细胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ，ＥＳ ｃｅｌｌ）由小鼠囊胚期内细胞团（ｉｎｎｅｒ ｃｅｌｌ ｍａｓｓ）分离得到，具有在体外保持不分我限增殖能力；在胎鼠或成鼠体内胚胎干细胞可以分化形成各种细胞类型；在合适的增减条件下，胚胎干细胞可以定向诱经形成多种细胞类型。人们利用胚胎干细胞建立了多种细胞、组织的体外分化模型，发现并确定了一系列新的生物海性因子，并用于研究哺乳动物早期发育中细     

2-细胞小鼠胚胎电融合后的体外发育

细胞融合是研究细胞调节机理和多倍体对发育作用的技术。研究多倍体胚胎常用的手段是采用灭活的仙苔病毒(ISV)融合法、聚乙二醇(PEG)诱导融合法、细胞松弛素B(CB)介导法和电融合(EF)法。国外学者采用这4种方法均获得小鼠、大鼠和兔融合胚胎,分别研究了融合胚胎在体内或体外的发育。目前国内对小鼠多倍体胚胎研究的报道很少。黄少华等报道的小鼠电融合胚胎在体外培养时分裂率很低,未能从核型证明融合胚胎为四倍体,因为只有个别分裂胚胎在体外发育到8-细胞阶段。本实验采用电融合法研究2-细胞小鼠胚胎融合后的体外分裂及发育,并利用细胞遗传学方法分析融合后胚胎体外发育而成的附植前胚胎的染色体分裂相和分裂球数目,证明胚胎的多倍性及分裂率;通过与正常1-细胞和2-细胞小鼠胚胎体外发育结果进行比较,揭示电融合胚胎在体外分裂与发育的规律,为进一步研究多倍体胚胎发育机制提供参考。     

小鼠早期受精胚细胞核诱导成熟卵母细胞Ca2+释放活性的研究

在受精过程中，哺乳动物卵子细胞内的钙离子浓度呈现连续性反复升高，有证据表明；将受精的1-和2-细胞期的胚胎细胞核移植到未受精卵中能导致卵子产生钙升高并使该重构胚激活，然而，尚不清楚胚胎细胞核这种诱导卵子内钙升高的能力是如何获得的，是否处于不同发育阶段的早期胚胎细胞核都具有这种能力，利用细胞核移植技术，将小鼠受精早期胚胎细胞核移植到成熟卵母细胞中，并测定该重构胚细胞内钙含量变化，结果表明，受精1-和2-细胞期的细胞核具有诱导成熟卵子钙释放活性的功能，而4-和8-细胞期细胞核，融合的2或3个4-细胞期的细胞核及乙醇孤雌活化的原核均不具有这种能力，结果说明，胚胎细胞核诱导卵子细胞内钙升高的能力是受精过程中产生的，是受精胚特有的，它存在于早期受精胚的特殊发育阶段，这暗示早期受精胚这一特有的能力对胚胎的正常发育具有重要意义。     

iPS研究急待“涅槃重生”

<正>2006年,以山中伸弥教授为首的日本京都大学研究小组通过实验,成功地将小鼠的皮肤细胞——确切地说是成纤维细胞——转化成了干细胞。这是科学家首次获得诱导性多能干细胞,即iPS细胞。iPS细胞的发现有着不同寻常的意义。首先,它更新了人们的观念,从此之后人们不再认为细胞的命运不可逆转。普通体细胞不仅可以逆转为干细胞,而且还可以实现不同组织间的转分化。其次,它绕过了胚胎干细胞的伦理困境,让很多实验室都可以重复这个简单的实验,开展多能干细胞的研究。最后,iPS细胞还具有很多胚胎干细胞所不具备的优势。诸如,将患者自身的i PS细胞在体外操作后重新植入体内,会大大减少排斥反应。