绵羊体细胞克隆胚胎的异常DNA甲基化模式

以体外受精胚胎作为对照, 利用抗5-甲基胞嘧啶抗体免疫荧光法对绵羊体细胞克隆胚胎的基因组甲基化模式进行了分析. 实验结果表明: (ⅰ) 在着床前发育过程中, 体细胞克隆胚胎呈现出与体外受精胚胎类似的去甲基化趋势, 即在8-细胞期甲基化水平降到最低点, 紧接着在桑椹胚时又升高, 但是克隆胚胎的甲基化水平明显高于同一时期的体外受精胚胎, 特别在8-细胞期及其以后时期; (ⅱ) 克隆囊胚的甲基化模式与体外受精囊胚不同, 克隆囊胚的内细胞团(inner cell mass, ICM)和滋养层(trophectoderm cells, TE)甲基化水平相当, 而体外受精囊胚的内细胞甲基化水平低于滋养层. 研究结果表明, 与体外受精胚胎相比, 克隆胚胎的DNA甲基化重编程存在异常, 它可能是导致克隆胚胎发育失败的原因之一.     

体细胞克隆法生产绵羊转基因囊胚

pEGFP－N1质粒分别转染5只绵羊卵巢原代颗粒细胞,G418筛选后,各取1株阳性转基因细胞作供体,进行绵羊的体细胞核移植（克隆）,共352枚体外成熟的去核卵母细胞与转基因的颗粒细胞进行电融合,得到的329枚核移植胚胎（93．5％）,用Ionomycin／6－DMAP激活,SOFaaBSA液滴体外培养7d,结果显示,312枚核移植胚胎发生卵裂（94．8％）,其中63枚发育至囊胚阶段（19．1％）,随机抽检发现,克隆胚胎在早期发育的各个阶段均表达GFP基因,4株0．5％FCS饥饿细胞克隆胚胎的囊胚率为19．6％（55／280）,胎在早期发育的各个阶段均表达GFP基因,4株0．5％FCS饥饿细胞克隆胚胎的囊胚率为19．6％（55／280）,与另外1株未饥饿细胞克隆胚胎的囊胚率（16．3％,8／49）没有显著差异（P＞0．05）,结果表明,体细胞基因转移和克隆技术的结合,可以有效地生产绵羊的转基因囊胚。     

高效率基因打靶载体的构建及受体成肌细胞的制备

通过建立高效率“双无”（无启动子、 无polyA）打靶载体MSTN-GFP和MSTN neo及新生绵羊和胎儿成肌细胞的培养和鉴定, 优化了培养条件, 改善了细胞状态, 为提高打靶效率及体细胞克隆提供了稳定的核移植供体； 同时无启动子打靶载体的构建也有利于打靶后阳性细胞克隆的分子鉴定.