P15INK4b/MTS2对人肝癌细胞增殖的影响及其机理的初步分析

利用自行构建的稳定高表达Ｐ１５ＩＮＫ４Ｂ的人肝癌细胞,研究了抑癌基因Ｐ１５在细胞增殖中的作用．首先将抑癌基因 Ｐ１５的 ｃＤＮＡ构建到高效真核表达的质粒载体 ｐＸＪ４１－ｎｅｏ中的 ＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩ位点,构建成 Ｐ１５真核表达质粒 ｐＸＪＰ１５．通过脂质体法将 ｐＸＪＰ１５质粒转染人肝癌细胞ＳＭＭＣ－７７２１,进一步用 Ｇ－４１８筛选,获得了稳定高表达Ｐ１５的人肝癌细胞模型ＳＨＴ及相应的表达空载体的对照细胞模型ＳＶＸＪ．通过Ｎｏｒｔｈｅｒｎ,Ｗｅｓｔｅｒｎ分子杂交分析,表明ＳＨＴ细胞中Ｐ１５基因表达和蛋白水平都明显高于对照组细胞,证实成功地建立了Ｐ１５高表达的人肝癌细胞模型,与对照组相比,Ｐ１５高表达的ＳＨＴ１细胞的增殖受到抑制,流式细胞光度术和ＭＩ值测定表明Ｐ１５阻抑细胞由Ｇ１期向Ｓ期和由Ｇ２期向Ｍ期的转换．Ｗｅｓｔｅｒｎ免疫印迹分析结果表明,癌基因ｃ－ｍｙｃ,ｃ－ｆｏｓ的蛋白水平表达下降可能是Ｐ１５抑制细胞增殖的分子机理之一。     

P15INK4b/MTS2对人肝癌细胞增殖的影响及其机理的初步分析

利用自行构建的稳定高表达P15INK4B 的人肝癌细胞, 研究了抑癌基因P15 在细胞增殖中的作用. 首先将抑癌基因P15 的cDNA 构建到高效真核表达的质粒载体pXJ41-neo 中的EcoR / Xho 位点, 构建成P15 真核表达质粒pXJP15. 通过脂质体法将pXJP15 质粒转染人肝癌细胞 SMMC-7721, 进一步用G-418 筛选, 获得了稳定高表达P15 的人肝癌细胞模型SHT 及相应的表达空载体的对照细胞模型SVXJ. 通过Northern, Western 分子杂交分析, 表明SHT 细胞中P15 基因表达和蛋白水平都明显高于对照组细胞, 证实成功地建立了P15 高表达的人肝癌细胞模型. 与对照组相比, P15 高表达的SHT1 细胞的增殖受到抑制, 流式细胞光度术和MI 值测定表明P15 阻抑细胞由G₁ 期向S 期和由G₂ 期向M 期的转换. Western 免疫印迹分析结果表明, 癌基因c-myc, c-fos 的蛋白水平表达下降可能是P15 抑制细胞增殖的分子机理之一.     

用dhfr非缺陷型细胞高效表达EPO基因的研究

用我们所克隆的促红细胞生成素基因组基因，构建了表达载体ｐＲＳＶ／ＥＰＯ。用脂质体法转染ＣＨＯ－Ｋ１２细胞，在４００μｇ／ｍＬ的Ｇ４１８浓度下筛选到了稳定表达ＥＰＯ的细胞株，表达量约为每天每１０＾６细胞１６０ＩＵ，在此基础上又构建了带有潮霉素Ｂ抗性的二氢叶酸还原酶基因表达载体ｐＨＹ／ｄｈｆｒ，再次这一表达载体用脂质体方法导入Ｃ１０细胞中，经２００μｇ／ｍＬ的潮霉素Ｂ筛选，获得了部分潮霉素Ｂ抗性的细胞     

CⅡTA反义RNA对HLAⅡ类分子表达的抑制作用

为研究ＭＨＣⅡ类基因转录活化因子对人类白细胞抗原Ⅱ类分子表达的影响,用ＲＴ－ＰＣＲ方法从Ｒａｊｉ细胞中克隆到ＣⅡＴＡ基因ｃＤＮＡ５’端片段,构建成ＣⅡＴＡ反义ＲＮＡ真核表达载体ｐｃＤＮＡ－Ⅱ,基因转移ＨＬＡⅡ类分子诱导型表达的ＨｅＬａ细胞,ＩＦＮ－γ诱导,发现稳定转染ｐｃＤＮＡ－Ⅱ的细胞中ＨＬＡ－ＤＲ,ＤＰ和ＤＱ的表达均较转ｐｃＤＮＡ３空载体的细胞有显著下降,而ＨＬＡ Ｉ类分子的表达不受影响。实验     

CⅡTA反义RNA对HLAⅡ类分子表达的仰制作用

为研究ＭＨＣⅡ类基因转录活化因子（ＣⅡＴＡ）对人类白细胞抗原（ＨＬＡ）Ⅱ类分子表达的影响,用ＲＴ－ＰＣＲ方法从Ｒａｊｉ细胞中克隆到Ｃ Ⅱ ＴＡ基因ｃＤＮＡ ５＇端片段,构建成ＣⅡＴＡ反义ＲＮＡ真核表达载体 ｐｃＤＮＡ－Ⅱ,基因转移 ＨＬＡ Ⅱ类分子诱导型表达的 ＨｅＬａ细胞．经 ＩＦＮ－γ诱导,发现稳定转染ｐｃＤＮＡ－Ⅱ的细胞中ＨＬＡ－ＤＲ,ＤＰ和ＤＱ的表达均较转ｐｃＤＮＡ３空载体的细胞有显著下降,而 ＨＬＡⅠ类分子的表达不受影响．实验证明 ＣⅡ ＴＡ反义 ＲＮＡ对 ＨＬＡ Ⅱ类分子表达具有显著的抑制作用,为进一步开展低免疫原性的细胞移植提供了依据．     

锌指核酸酶介导的高效多位点基因打靶

该研究旨在建立锌指核酸酶介导的多位点基因打靶技术,为获得稳定遗传的转基因动物或基因治疗临床应用解决技术难题.首先利用OPEN平台设计、构建能识别人基因组内rDNA基因间隔序列的锌指蛋白基因序列,与FokⅠ的切割结构域连接、表达后获得锌指核酸酶基因,再构建锌指核酸酶真核表达载体.另外,构建含有2条同源重组引导序列和绿色荧光蛋白基因(EGFP)的多位点基因打靶载体.将锌指核酸酶真核表达载体和多位点基因打靶载体共转染HEK293细胞,内参对照PCR-灰度分析法检测外源基因定点整合效率,结果显示单独转染多位点基因打靶载体的定点整合效率为6.8%;而由于锌指核酸酶在染色质DNA上切割rDNA基因的间隔序列,诱导高效同源重组,锌指核酸酶载体、多位点基因打靶载体共转染的定点整合效率为24.2%,较常规基因打靶定点整合率(10-6～10-5)提高了24000多倍.共转染的HEK293细胞在无任何筛选的条件下持续培养2个月,经过20次传代之后,子代细胞能够持续表达EGFP,提示表达稳定.本研究建立了锌指核酸酶介导的高效多位点基因打靶技术,不仅大大提高了外源基因的定点整合效率,而且兼顾了基因表达的稳定性和安全性,为动物定点转基因和人类基因治疗提供了重要的技术平台,具有广泛的应用前景.     

利用正义和反义技术研究着丝粒/动粒复合体蛋白CENP-B在细胞周期调控中的作用

为研究着丝粒/动粒复合体蛋白(centromere/kinetochore complex protein-B, CENP-B)高表达和低表达在细胞周期调控中的作用, 将全长CENP-B cDNA基因(cenpb)构建到pBI-EGFP真核表达载体上, 获得正义和反义cenpb真核表达重组质粒, 并转染HeLa-Tet-Off细胞. 结果表明, 正义质粒转染导致细胞产生巨型着丝粒/动粒复合体, 细胞分裂几次后发生凋亡; 转染反义质粒至HeLa-Tet-Off细胞, 克隆筛选获得稳定表达反义cenpb的细胞株HACPB. HACPB细胞着丝粒/动粒复合体小、数量多, CENP-B表达量低; 细胞周期延长, 恶性表型降低, 裸鼠致瘤能力降低, G2/M期向下一周期的G1期过渡发生延迟. 细胞周期蛋白相关激酶(cyclin-dependent kinases, CDKs)、细胞周期蛋白、细胞周期蛋白相关激酶抑制剂(CDK inhibitors, CKIs)等的表达在某时相发生特异的变化. 这些结果说明, CENP-B是维持着丝粒/动粒复合体正常结构和功能的必需组分, 并参与细胞周期调控.     

高抗马铃薯纺锤形块茎类病毒的转基因马铃薯细胞内核酶转录产物的分布

以对马铃薯纺锤形块茎类病毒（ＰＳＴＶｄ）有高度抗性的表达核酶的转基因马铃薯为材料。研究了核酶转录产物在植株根细胞中的亚细胞分布。首先通过往返式凝胶电泳和Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交选择出表达核酶并对ＰＳＴＶｄ高抗的，即检测不出ＰＳＴＶｄ存在的马铃薯系。用其根细胞进行原位杂交，结果表明核酶转录产物主要分布在转基因马铃薯细胞的细胞核中。这一结果支持我们提出的核酶对在核内复制的类病毒更为有效的假说。     

特异性核糖体基因区打靶载体介导CDUPRT治疗肝癌的体内外研究

核糖体基因区打靶载体pHrn是本室构建的人源基因载体之一, 为探讨其在肝癌基因治疗的作用, 本研究构建了pHr-CeTpCDUPRT/GFP质粒载体并进行了肝癌的体内外治疗实验研究. 该质粒载体以pHrn载体为骨架, CMV+hTERT启动子作为转录调控元件, CDUPRT/GFP自杀融合基因为目的基因. 体外转染肝癌细胞BEL7402后, 流式细胞仪检测转染效率为30%~50%; RT-PCR和Western blotting结果表明, 有CDUPRT表达; HPLC检测5-FC可转化为5-FU, 给药后12 h 5-FU浓度达60.15 μg/mL; 四唑盐(Methylthiazolyl tetrazolium, MTT)分析结果显示, 200~800 μg/mL 5-FC使BEL7402的平均存活率为60%~35%. 同时, 对裸鼠肝癌模型进行瘤内转染, 结果显示, 当持续注射质粒和前体药物治疗时, 裸鼠肿瘤生长明显被抑制, 甚至体积稍有缩小; RT-PCR检测结果表明, 瘤内有CDUPRT表达; HPLC检测裸鼠血清中的5-FU浓度为7.694 μg/mL; 肿瘤组织病理切片显示, 大量肿瘤细胞坏死. 这些结果为实际应用此载体进行肝癌基因治疗提供了重要的实验依据.     

人可溶性肿瘤坏死因子受体Ⅰ型基因在黑曲霉中的表达

将人可溶性肿瘤坏死因子受体Ⅰ（sTNFRI)基因插入黑曲霉（A.niger)融合蛋白基因的表达质粒pIGF中,融合之处设计类胰蛋白酶（KEX2）加工位点,构建融合表达载体pHBC。以pHBC转化黑曲霉胞外蛋白酶缺失株A.niger3.795-1-23,通过Southern杂交鉴定阳性克隆。A.niger3.795-1-23重组菌株的蛋白电泳显示有特异表达带,Western blotting证实该分泌蛋白具有sTNFRI的免疫活性。     

结核分枝杆菌多价核酸疫苗的构建及免疫原性

将编码结核分枝杆菌MPT-64，Ag85B和ESAT-6分泌蛋白的结构基因或包括信号肽的全基因序列定向克隆到真核表达载体pJW4303中，转化到TOP10大肠杆菌，提取质粒DNA，经限制性核酸内切酶鉴定及序列分析证实含有正确的上述3种分泌蛋白的结构基因（包括信号肽）全序列，用脂质体介导法将重组表达质粒导入COS7细胞内并进行瞬时表达，收集表达细胞或浓缩上清液，12%或15%的SDS-PAGE电泳分离，用结核杆菌特异性抗体进行免疫印迹杂交，证明上述3种重组质粒能在哺乳动物细胞中表达出特异蛋白，3种重组表达质粒同时肌注免疫小鼠21d后，Ag85B抗体的平均滴度即达到1：3200，第2次免疫21d达到1：102400，MPT-64抗体的平均滴度在首免21d后为1：50，第2次免疫21d后为1：200，两次免疫21d后均未检测到ESAT-6的特异性抗体，三免21d后Ag85B的特异性细胞因子γ-干扰素的浓度为110pg/mL；面MPT-64和ESAT-6的γ-干扰素浓度未检测到，实验在国内首次用结核杆菌多价DNA疫苗对小鼠进行了免疫实验，二免后的抗体水平已达到或超过国内外已报道的单价苗最高抗体水平，表明多价核酸疫苗和分泌型蛋白载体有利于增强疫苗的保护性应答。     

大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶基因克隆及其原核表达载体构建、表达

通过ＰＣＲ方法克隆出大肠杆菌株Ｈ－３０的胞嘧啶脱氨酶基因，并将其起始密码子ＧＴＧ突变为ＡＴＧ，构建了ＣＤ基因的原核重组表达载体ＰＢＶ２２０－ＣＤ，通过测定胞嘧啶脱氨酶活性筛选出ＣＤ高表达活性克隆Ｈ－３０ＣＤ－１１５－氟胸嘧啶对ＣＤ活性克隆有杀灭毒性，ＤＮＡ序列分析显示ＣＤ高表达活性克隆Ｈ－３０－ＣＤ－１１较基因文库中所报道的ＣＤ基因存在１６个位点碱基改变，引起肽链中氨基酸改变的位点有５人。     

PP4低表达对人乳腺癌细胞MCF7增殖的影响

蛋白磷酸酶4 (protein phosphatase 4, PP4)在果蝇、线虫及哺乳动物细胞中都可定位于中心体上, 且在果蝇和线虫中参与了中心体成熟. 为探讨PP4在哺乳动物细胞中的功能, 通过RT-PCR的方法扩增得到PP4基因全长序列, 构建pEGFP-C1-PP4融合蛋白表达质粒. 将该质粒转染MCF7细胞, 用间接免疫荧光技术确认PP4在MCF7细胞中的中心体定位. 将PP4蛋白中非磷酸酶保守区序列作为反义抑制作用的靶序列, 构建真核表达重组质粒pXJ41-as-PP4并转染MCF7细胞, G418筛选获得稳定的PP4表达受抑制的细胞株MCF7pXJ41-as-PP4. 对此细胞株进行细胞形态、骨架结构、生长特性及有丝分裂过程观察分析, 发现其生长速率明显减慢, 血清依赖性增强, TdR双阻断进行周期同步化结合流式细胞术以及有丝分裂指数分析发现细胞进入M期受阻. 间接免疫荧光检测发现, 细胞中微管组织紊乱, 细胞核物质增加, 细胞群体中多核细胞比例增加, 有丝分裂过程发生异常, 出现较多多极分裂现象. 这些结果表明, 在哺乳动物细胞中, PP4的正常表达对中心体正常行使微管组织功能是必要的, 抑制PP4表达将导致细胞增殖及周期进程发生异常.     

重组慢病毒介导的人凝血因子Ⅸ cDNA在培养细胞和血友病B小鼠中的表达

为探索慢病毒载体介导的人凝血因子Ⅸ(hFⅨ) cDNA在培养细胞中的表达水平, 及重组慢病毒应用于血友病B基因治疗的可行性, 分别构建由肝特异性启动子ABP调控的hFⅨ的慢病毒载体FAXW, 以及由泛肽-C调控的hFⅨ慢病毒载体FUXW; 用磷酸钙法, 将慢病毒载体与包装质粒CMVΔR8.2和包膜质粒VSV-G共转染产毒细胞293 T, 以制备重组慢病毒. 重组FUXW病毒分别感染293 T, BHK和L-02细胞, 经检测皆有hFⅨ蛋白表达. 重组FAXW病毒感染细胞48 h后, 仅在L-02细胞检测到hFⅨ高表达(630 ng/10⁶细胞), 而在其他感染细胞中hFⅨ表达较低. 将重组FAXW病毒经尾静脉途径注射入血友病B小鼠体内, 小鼠血浆中可检测到接近治疗水平的hFⅨ抗原(45 ng/mL), 且持续时间超过60 d. 上述结果表明, 慢病毒载体介导的基因转移为血友病B基因治疗提供了极有潜力的方法.     

环腺苷酸应答元件结合蛋白(CREB)参与人hsp90β基因的热诱导表达

为研究cAMP应答元件（CRE）在人热休克蛋白hsp90β基因表达中的作用，构建了数个受hsp90β基因不同长度调控片段介导的氯毒素乙酰基转移酶（CAT）报告基因质粒。分别转染Jurkat细胞并检测42℃1h热诱导前后CAT活性。结果发现删除hsp90β基因上游含CRE片段（－173／－91bp)后，CAT的热诱导表达活性降低了67％。电泳迁移率变更分析（EMSA）显示热休克后Jurkat细胞的核抽提物中磷酸化的CREB与该片段呈特异性结合。Western印迹实验及PKA活性检测发现CREB的磷酸化程度及PKA活性均随热诱导时间的延长而增加。以上结果表明：磷酸化的CREB通过与hsp90β基因上游的CRE结合参与该基因的热诱导表达，并可能与PKA传导途径有关。     

PRMT5通过抑制NF-κB削弱DR4介导的趋化因子CCL20释放

构建表达DR4的质粒pCMV-DR4-HA(DR4)和表达PRMT5的质粒pCMV- PRMT5-Flag, 共转染293T细胞, 验证DR4和PRMT5的相互作用. 将DR4和蛋白精氨酸N端甲基化转移酶5 (protein arginine methyltransferase 5, PRMT5)两种质粒分别或者共转染293T细胞, 研究PRMT5对DR4引起的炎症因子释放的影响, 探讨PRMT5抑制DR4 (tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand receptor 1)引起炎症因子释放的分子机制. 分别通过RT-PCR和ELISA方法对炎症因子的表达进行定量检测. 通过双荧光报告基因方法检测PRMT5对DR4引起NF-κB活性变化的影响, 并且使用Western Blot方法检测ERK的表达变化. DR4和PRMT5在293T细胞中能相互结合, PRMT5过表达降低了DR4引起的NF-κB活性和ERK的磷酸化, 导致CCL20分泌减少. 因此, PRMT5在293T细胞中与DR4结合, 通过改变NF-κB和ERK激酶活性影响了CCL20的分泌, 参与了DR4介导的细胞免疫调节.     

血管生成抑制因子TSF的设计、表达及其对血管生成的抑制效应

ＰＦ４的Ｃ－末端１３肽和ＴＳＰ１的４２９～４５９片段３１肽通过Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ肽桥设计为融合蛋白ＴＳＦ．采用ｐＧＥＸ－２Ｔ载体在 Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９中获得了 ＴＳＦ蛋白的高效表达．采用 ＭＴＴ方法、损伤细胞迁移实验。鸡胚绒毛尿囊膜实验和小鼠移植肿瘤抑制实验，测定了ＴＳＦ及其相关物ＧＳＴ－ＴＳＦ，ＰＦ４（５８－７０），ＴＳＰ１（４２９～４５９）等对血管生成和肿瘤生长的抑制效应．结果显示ＴＳＦ特异抑制小牛主动脉血管内皮细胞的生长，并有明显的剂量依赖关系；非常显著抑制血管内皮细胞的运动迁移；显著抑制鸡胚绒毛尿囊膜的新生血管生成；上述抑制活性ＴＳＦ＞＞ＧＳＴ－ＴＳＦ＞ＰＦ４（５８～７０）＞ＴＳＰ１（４２９～４５９）．ＴＳＦ显著抑制小鼠Ｌｅｗｉｓ肺癌的生长，１．０μｍｏｌ／ｋｇ·ｄ的ＴＳＦ对Ｌｅｗｉｓ肺癌的抑瘤率达到６８．７５％．结果说明ＴＳＦ的重组设计是成功的，ＴＳＦ为一个人工重组的有效的血管生成抑制因子．     

一种简单有效的检测基因表达产物的方法

外源基因转入动植物细胞后在释译水平上正确表达产物的定性定量测定是基因工程中的重要问题,通常生物中某些酶的含量很低,如异戊烯基转移酶,在进行其转基因研究时较难测定。根据其ｃＤＮＡ序列,预测出抗原位点肽并用固相法合成,与载体蛋白偶联后获得对其起专一性反应的抗体,用该抗体通过ＥＬＩＳＡ法可以有效测定转基因烟草中的基因表达产物。为测定难以分离纯化的低含量的基因表达产物提供了一种简便而有效的方法。     

RNA干扰介导对乙型肝炎病毒复制的抑制作用

构建针对乙型肝炎病毒(HBV)核心区或表面抗原编码区的siRNA表达载体pSI-C和pSI-S, 在体外HBV复制细胞模型中观察对HBV复制和表达的影响. 将pSI-C, pSI-S与1.3倍HBV真核表达质粒pHBV共转染HepG2细胞, 分别在转染后24, 48和72 h, 观察pSI-C和pSI-S对细胞上清和胞内病毒抗原表达的影响, 并用分子杂交方法从病毒复制、转录和翻译水平检测目的基因的表达情况. 实验结果表明, pSI-C及pSI-S能明显抑制细胞内HBsAg和HBcAg的合成, 呈序列特异性和剂量依赖性的特点, 而对照组siRNA无抑制作用. pSI-C比pSI-S抑制作用更强, 转染后第2天对HBsAg和HBeAg抑制率达高峰, 分别为92%和85%. Southern和Northern杂交结果表明, HBV siRNA能降低目的基因转录和病毒复制中间体的表达水平, 提示针对乙型肝炎病毒核心区和表面抗原编码区的siRNA能有效抑制HBV RNA分子转录和病毒复制, 最终降低病毒抗原表达, 这为运用RNAi技术进行HBV基因治疗提供了新的思路.     

兔防御素NP-1基因在转基因烟草中的表达及其对烟草青枯病的抗性研究

从兔子肝脏细胞中扩增到防御素NP_1成熟肽的编码序列 ,长约 2 0 0bp .将此片段插入到切除了GUS编码序列的pBI1 2 1质粒载体中 ,构建成植物表达载体 pBIC_35SNP1 .通过根癌农杆菌介导的叶盘法 ,将pBIC_35SNP1导入烟草细胞中 ,并获得了经Southern杂交证实的转基因植株 .进一步的Northern杂交证明防御素NP_1基因能够在转基因植株中正常转录 .抗菌实验表明转基因植株增强了对烟草青枯病的抗性并延缓了烟草青枯病的发病