衣藻肌动蛋白-绿色荧光蛋白的融合基因在烟草悬浮细胞中的表达及融合蛋白的体外聚合

将衣灌（Chlamydomonas reinhardtii)肌动蛋白（actin）基因(cDNA)与绿色荧光蛋白（green fluorescence protein,GFP)基因融合后，分别构建到原核和植物表达载体中，并在BL21plus细菌和烟草悬浮细胞（BY-2）中进行表达。通过荧光显微镜观测到重组后的融合蛋白在菌体和烟草悬浮细胞中得到正确表达。肌动蛋白-绿色荧光蛋白 的融合蛋白主要分布在烟草悬浮细胞细胞膜周围，参与膜骨架的组成，另外还大量分布于细胞核周围和细胞板的位置，同时也在细胞内形成丝状结构，参与F-actin的组成。将肌动蛋白-绿色荧光蛋白融合基因的原核表达产物经过硫酸铵分级沉淀、离子交换层析和疏水柱层析后，得以纯化，并在纯化产物中加入肌动蛋白聚合缓冲液，纯化的肌动蛋白能聚合成为丝状结构即F-actin，这表明低等藻类的肌动蛋白具有同高等植物和动物相似的性质和功能。     

曲霉淀粉酶的纸上电泳分离及测定

我们曾比较研究了几株酒精工业上常用的曲霉淀粉酶的性质,观察到黄曲霉Asp.oryzae与黑曲霉Asp.batatae及白曲霉(黑曲霉Asp.niger的浅色变种)的淀粉水解酶体系有显著的区别:黄曲霉富含α-淀粉酶(糊精化酶);黑曲霉富含糖化酶,此种糖化酶兼有淀粉糖化力(相当β-淀粉酶)和麦芽糖分解力(相当麦芽糖酶)。在不同的条件下处理或用硫酸铵分段沉淀法,都不能将这两种活性区分开来,故     

水稻Bowman-Birk蛋白酶抑制剂基因OsWIP1-2的诱导表达及其抑制活性

克隆了水稻的WIP1基因, 该基因属于Bowman-Birk蛋白酶抑制剂(BBI)家族. RNA杂交实验结果显示该基因的表达受伤害和茉莉酮酸的诱导, 表明它在植物防御反应中起着重要的作用. 将此基因克隆到表达载体pET28a, 并在大肠杆菌中表达融合蛋白. 分别用胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶为底物检测纯化的融合蛋白的抑制活性, 发现融合蛋白具有胰凝乳蛋白酶的抑制活性, 但没有对胰蛋白酶的抑制活性; 同时发现融合蛋白C端的融合残基对蛋白酶抑制活性有重大影响, 具有C端(His)₆纯化标签的融合蛋白不具有胰凝乳蛋白酶的抑制活性, 而有天然C端序列的融合蛋白具有胰凝乳蛋白酶的抑制活性, 这暗示了过长的C末端序列可能会影响WIP1蛋白的正确折叠. 蛋白酶抑制活性分析表明水稻Bowman-Birk抑制剂家族的成员可能在结构和功能上均发生了分化.     

山羊β-酪蛋白基因启动区指导人血清白蛋白在转基因小鼠乳汁中的高效表达

构建了包含山羊β-酪蛋白基因启动区5′端上游调控序列和外显子1, 2及内含子1在内的乳腺表达载体, 并与人血清白蛋白(hALB)小基因(含全长cDNA序列及其内含子1)构建成融合基因. 鼠尾静脉注射实验表明, 该融合基因能在小鼠乳腺中特异表达. 应用显微注射方法将该融合基因导入小鼠受精卵, 并将受精卵移植于假孕母鼠, 共获得33只F0代小鼠, 经PCR和Southern印迹杂交证实, 有8只小鼠(5♀, 3 ♂ )基因组中整合有hALB基因, 整合率为24.2%(8/33). Western blot分析表明, 在5只雌性整合小鼠中有3只表达了hALB蛋白, 放射免疫法测定其乳汁中hALB含量分别为3.54, 0.21和3.03 g/L.     

转录辅因子CBP/p300提高转录因子C/EBP介导的人白细胞介素5(IL-5)基因启动子活性

IL-5主要由Th2类细胞产生, 在过敏性哮喘等过敏性疾病的发生过程中起着关键的作用. 转录辅因子CBP/p300本身具有组蛋白乙酰转移酶活性, 参与许多基因的转录调控过程. 腺病毒E1A癌蛋白能与CBP/p300蛋白结合并抑制其活性. 我们分析了E1A蛋白在IL-5基因启动子/荧光素酶报告基因表达调控中的作用, 结果表明E1A蛋白能抑制PMA/离子霉素激活和转录因子C/EBPβ介导的IL-5基因启动子/荧光素酶报告基因的活性. 而突变体E1AΔ2-36蛋白因不能与CBP/p300蛋白结合而不能抑制IL-5基因启动子/荧光素酶报告基因的表达. 此结果揭示, 组蛋白乙酰转移酶CBP/p300参与IL-5基因启动子活性的调控. 另外, 转录辅因子CBP/p300和转录因子C/EBPβ可以协同地激活IL-5基因启动子/荧光素酶报告基因的表达. 为进一步研究IL-5基因表达调控的机制奠定了基础.     

乙肝病毒表面抗原(HBsAg)基因在海带中的表达

用自建的海带模式转化体系,以基因枪转化法获得转乙肝病毒表面抗原（HBsAg）基因海带.转基因海带HBsAg蛋白的平均表达量为0.529μg·（mg可溶性总蛋白）-1,最高可达2.497μg·（mg可溶性总蛋白）-1,且表达产物具有天然表位（epitope）.经PCR-Southern,总DNA的Southern blot及ELISA定量检测证明,外源基因已发生整合并已正常表达.通过表达水平的横向比较,提示转基因海带生产乙肝疫苗具有开发潜力,海带作为大型海藻表达系统,有望在高附加值产品生产与海洋环境保护方面发挥独特作用.     

人神经生长因子β亚基的基因在P.pastoris和E.coli中的表达

将hNGFB基因插入甲醇营养性酵母P .pastoris分泌表达载体pHIL S1和E .coli表达载体pET 15b中 ,相应转化P .pastorisGS115 (Mut+,His- )和E .coliBL2 1(DE3 ) .在不含组氨酸平板上生长的酵母转化子通过PCR进一步筛选阳性克隆 ,P .pastoris重组菌株的蛋白电泳表明发酵液中有特异表达带 ,扫描分析占细胞外泌总蛋白的 14 .4% ,Westernblotting证实该分泌蛋白具有hNGF的免疫活性 .E .coli重组菌株在IPTG的诱导下表达融合蛋白 .电泳扫描分析表达的融合蛋白占细胞总蛋白量的 10 .3 % ,Westernblotting检测表明具有免疫活性 .     

斯氏假单胞菌Pseudomonas stutzeri A1501氧胁迫下基因表达谱研究

斯氏假单胞菌Pseudomonas stutzeri A1501分离自我国南方水稻田, 在低铵和微好氧条件下能紧密结合在水稻根表, 并侵入根内生长和固氮. 为探讨氧对A1501基因组表达的影响, 利用全基因组芯片技术, 研究不同氧浓度(0.5%, 21%)下A1501基因组表达谱, 结果表明: (ⅰ) 67个基因在高氧浓度下表达上调2倍以上, 其中17个基因的功能未知; (ⅱ) 68个基因在高氧条件下表达, 其中约50%的基因参与固氮或反硝化. 实时定量RT-PCR验证结果表明, 4个编码氧化还原酶的基因和7个编码胞外夹膜多糖和抗原寡糖合成的基因在高氧下表达上调, 其中sodC在高氧下表达上调2.7倍、编码黄素单胺氧化酶相关蛋白的基因PST1610表达上调2.2倍、编码α-酮戊二酸-铁氧化酶族氧化还原酶的基因PST3584表达上调3.2倍、编码NAD依赖型氧化还原酶的基因PST2179表达上调2.9倍. 这些基因及其表达产物可能在A1501氧保护机制中发挥作用.     

小鼠乳清酸蛋白启动区指导人促红细胞生成素在转基因小鼠乳腺的表达

以小鼠乳清酸蛋白基因 (mWAP)调控区与人促红细胞生成素基因 (hEPO)构建融合基因 ,经动物个体暂态表达方法确证hEPO可在乳腺特异表达后 ,用显微注射方法将融合基因导入小鼠受精卵 ,再将受精卵移植到假孕小鼠 ,获得 86只G0 代小鼠 ,经PCR Southernblot及Southernblot证实 ,有 5 8只整合阳性小鼠 ,整合率为 6 7% ,ELISAkit,dotELISA等方法检测小鼠39只 ,有 1 6只表达阳性 ,乳汁中人hEPO的表达量高于 1 5 μg/mL .     

转基因马铃薯中病原诱导GO基因的表达及其对晚疫病的抗性

利用ＰＣＲ技术从黑曲霉（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）中扩增并克隆了葡萄糖氧化酶（ｇｌｕｃｏｓｅ ｏｘｉｄａｓｅ，简称ＧＯ）基因，并将马铃薯病原诱导型启动子（Ｐｒｐ１－１基因启动子）与其融合构建了植物表达载体ｐＣＡＭＧＯ。经农杆菌介导转化获得了转基因植株，Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交显示葡萄糖氧化酶基因整合进马铃薯基因组。该基因的表达及所引起的Ｈ２Ｏ２的生成由淀粉－ＫＩ的显色反应得到证实。用马铃薯晚     

腺病毒5型E1A在毕赤酵母中的表达及对肿瘤细胞生长的抑制作用

腺病毒5型E1A(Ad5E1A)作为一个抑癌基因, 由于具有较强抑癌作用及显著的化放疗增敏作用而受到人们的关注. 但由于它能整合到宿主细胞基因组中长期表达, 并能使Rb基因失活, 使动物细胞永生化等而引起人们的担心. 为了避免E1A在基因治疗中存在的问题, 设想以E1A蛋白进行探索. 首先构建了E1A真核表达载体(pPIC9/E1A), 转化毕赤酵母(GS115), 筛选高表达重组菌株. 经摇瓶试验, 甲醇诱导表达3 d后, 分泌型的E1A蛋白经HiTrap Q 和HiTrap SP两步柱层析, 获得了较高纯度的E1A蛋白, 并经SDS-PAGE 和Western blot 鉴定. E1A蛋白经Chariot介导能顺利进入细胞, 并大部分定位在细胞核, 使LN686细胞发生明显的G2/M期阻滞, 体外能显著抑制LN686肿瘤细胞生长. 为利用E1A蛋白在肿瘤治疗中应用的可能性提供了实验依据.     

T-DNA插入稻瘟病菌Gγ亚基基因启动子的突变体A1-412丧失形成附着胞、穿透和致病能力

用TAIL-PCR的方法获得了A1-412突变体的T-DNA侧翼基因组序列, 测序结果表明, 外源T-DNA插入到稻瘟病菌G蛋白γ亚基基因MGG1 (Magnaporthe grisea G protein Gamma亚基)的启动子区域. MGG1编码93个氨基酸, 具有典型的G蛋白γ亚基结构域(GGL)和C末端CAAX框, 并与其他丝状真菌G蛋白γ亚基有较高的一致性. 外加cAMP能诱导部分A1-412分生孢子形成附着胞, 但这些附着胞的形态不正常, 不能穿透洋葱内表皮或水稻叶片. 另外, A1-412与相对应交配型的菌株杂交时几乎不产生子囊壳. 将MGG1基因重新导入A1-412突变体可部分恢复上述表型. 这些结果表明, G蛋白γ亚基MGG1可能涉及稻瘟病菌形态分化、有性生殖、致病性等方面的调节作用.     

小鼠BRI3基因的克隆及其诱导细胞死亡的作用

为了阐明TNFα作用的分子机制，用抑制消减杂交（SSH）技术和反转录PCR（RT-PCR),从hTNFα处理过的小鼠脑血管内皮细胞（bEnd．3）总RNA中扩增并克隆BRI3的cDNA，构建了BRI3基因与绿色荧光蛋白（EGFP）基因融合的表达载体pEGFP/I3，转染L929细胞后，发现EGFP／I3融合蛋白位于细胞质里，通过TUNEL法检测或流式细胞仪分析初步表明，该融合蛋白在L929细胞中的表达能够导致细胞死亡，而且这种细胞死亡能被L929细胞中表达的Bcl－2蛋白所抑制，提示BRI3基因的功能可能与TNFα的细胞毒作用有一定的相关性。     

一个水稻P450 CYP72A基因簇受病原菌诱导和发育及组织特异性表达

细胞色素P450超基因家族广泛参与植物的各类生命活动,包括植物对病原菌的防卫反应.我们在植物病原菌诱导基因的DD-PCR分析时,分离到一个受病原菌侵染诱导的水稻cDNA片段.水稻基因组公布后,发现该片段位于1个包含7个P450 CYP72A基因(CYP72A17～23)的基因簇的保守部分.以此片段搜索水稻数据库发现,水稻CYP72A家族有14个成员,这14个蛋白质之间的差异主要在N端,C端则同源性很高.我们分别对该基因簇的7个成员进行了表达特性分析,发现其中CYP72A18,19,22和23的表达受稻瘟病菌侵染的调节,而且在抗、感植株中的表达存在明显差异.除CYP72A20外,其余6个CYP72A基因均具有发育和组织特异性表达的特征.CYP72A20在所有研究中均检测不到信号,可能为一个假基因.这些发现为水稻P450基因功能的研究提供了新的资料.     

改造的腺病毒5型E1A基因对TNF-α诱导的猪血管内皮细胞中NF-κB活性的抑制作用

在延缓性免疫排斥反应(DXR)过程中, NF-κB发挥着关键作用. 如何恰到好处地抑制其活性是本领域研究的重要问题之一. 用改造的E1A基因(E1A)包括功能区(1 ~ 80氨基酸)和核定位区(139 ~ 243氨基酸), 删除其中可能对人体有害的CR2区, 将其克隆到真核表达载体pcDNA3中, 并转染猪血管内皮细胞(PAEC), 经G418筛选, 获得稳定表达细胞株. RT-PCR技术和细胞生长曲线分析, 证明E1AΔ基因能在PAEC中稳定表达, 且不影响细胞的正常生长, 并能抵抗肿瘤坏死因子-α (TNF-α)诱导的细胞凋亡. 报告基因分析表明, E1A(能抑制由TNF-α诱导的NF-κB活性, 其抑制率为53%, 对NF-κB信号转导途径下游的一个重要炎症基因--E-选择素基因的表达抑制率达63%. 综上, E1AΔ基因的这些功能基本符合异种器官移植中克服DXR的要求, 为利用E1AΔ基因克服DXR的可行性提供了实验依据.     

C3—C4中间型植物Flaveria anomala中甘氨酸脱羧酶P—蛋白亚基上游调控序列在转基因水稻中的表达

将C3-C4中间型植物Flaveria anomala中甘氨酸脱羧酶(GDC)P-蛋白亚基基因(gdcsP)的上游调控序列与β-葡萄糖苷酸酶(GUS)基因编码区以及CaMV终止子融合,构建植物表达载体.采用农杆菌介导方法转化水稻,并在转基因水稻中分析了GUS的表达活性和特异性.结果表明,在水稻中gus嵌合基因特异地在木质部和韧皮部表达,在不同器官及组织中表达活性也有所差异,其中以根中最高,茎秆次之,叶再次,而在成熟胚乳中没有表达.在转基因水稻中,gdcsP启动子的表达也受水稻发育时期的调控,随植物组织成熟度的增加而降低.     

通过叶绿体基因工程在烟草中合成中长链羟基脂肪酸聚酯

中长链羟基脂肪酸聚酯(medium-chain-length-PHAs, mcl-PHAs)属于微生物聚酯. PHA合酶(PHA synthase, 由phaC基因编码)和3-羟酰基-酰基转移蛋白-辅酶A转移酶(3-hydroxyacyl-acyl carrier protein-coenzyme A transferase, 由phaG基因编码)是mcl-PHAs生物合成途径中的关键酶. 以aadA(氨基糖苷-3′-磷酸转移酶)基因做筛选标记, 分别构建了含phaC2基因的单价叶绿体转化表达载体pTC2以及同时嵌合phaC和phaG基因的双价叶绿体转化表达载体pTGC. 通过PDS1000/He基因枪转化法转化烟草, 获得具有壮观霉素抗性的叶绿体型转基因烟草植株, PCR和Southern Blot结果表明, 外源基因确已整合进烟草叶绿体基因组中且基本达到同质化. 气相色谱法检测转基因株系中的mcl-PHAs含量最高达4.8 mg/g干重, 合成的PHAs单体主要成分为3-羟基辛酸(3-hydroxyoctanoate, 3-HO)和3-羟基癸酸(3-dydroxydecanoate, 3-HD). 透射电子显微镜观察到转基因烟草叶片叶绿体中确有PHAs颗粒累积.     

植物NAD-IDH基因克隆及体外表达酶活力分析

植物NAD⁺-依赖型异柠檬酸脱氢酶(NAD-IDH)是一多功能酶. 以拟南芥生态型“Columbia gl1”及甘蓝型油菜三系“陕2A”, “陕2B”和“垦C1”的叶片为材料, 采用RT-PCR方法成功地从每种植物材料中分别克隆了3种NAD-IDH不同亚基基因. 同源性搜索发现, 来源于油菜的克隆基因是新基因. 将克隆基因的功能蛋白编码区整合到pMID1多克隆位点, 构建表达重组体, 均能在体外翻译系统中高效地表达出特异目的蛋白. 亚基0, 亚基1和亚基2基因转录本加入到含终浓度为36 μg/mL的二硫键异构酶的体外翻译系统, 体外表达产物中检测到NAD-IDH酶活力. 不同基因种类及转录本分子比的体外表达产物的酶比活力比较表明, NAD-IDH由3种亚基组成, 缺一不可, 缺少亚基0是致命的, 缺少亚基1或2中的任何一个对酶活力的损伤是严重的. 同时发现, 来源于陕2A和陕2B的亚基1基因转录本中存在碱基缺失现象, 从而发生移框突变或无义突变, 使突变亚基不表现正常亚基1功能, 导致油菜品系间叶片NAD-IDH酶比活力存在差异.     

小麦中一个PDR型ABC转运蛋白基因的克隆和特征分析

脱氧血腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol, DON)在小麦赤霉病发病过程中起重要作用, 是一种毒性因子. 禾谷镰刀菌的侵染能力依赖于其产生DON的能力, 抗病品种能显著降低病穗组织中DON的含量. 本研究利用Affymetrix小麦基因组芯片, 对抗赤霉病小麦品种望水白经DON诱导后的穗组织基因表达特点进行了分析, 结果发现, 一个编码PDR型转运蛋白的EST受DON诱导后上调表达45倍. 根据该EST设计引物筛选小麦基因组TAC文库, 得到一个包含该基因的TAC单克隆. 利用染色体walking对该单克隆测序, 用Softberry软件进行基因预测, 根据预测基因的5′和3′非翻译区设计引物, 从DON诱导的小麦望水白穗组织cDNA中克隆出该转运蛋白基因. 该基因组全长7377 bp, 包含19个外显子, CDS长度为4308 bp, 编码长1435 aa且分子量161 kD的蛋白. 蛋白序列比对表明, 该基因属于PDR蛋白家族, 命名为TaPDR1 (Triticum asetivum Pleiotropic Drug Resistance). 利用一套中国春缺体-四体系将TaPDR1基因定位在小麦5A染色体上. 半定量RT-PCR表明, TaPDR1在望水白穗中受DON和禾谷镰刀菌诱导表达, 表明其参与了植物抗病防御反应. 该基因在望水白感病突变体中低水平表达, 进一步证明TaPDR1与赤霉病抗性有关. TaPDR1的表达不受与生物胁迫相关的激素(JA和SA)和非生物胁迫因子(热、冷、伤害和NaCl)的诱导, 但受到Al³⁺和游离Ca²⁺的诱导表达, 推测[Ca²⁺]i介导了TaPDR1的表达信号.     

2,3,7,8-四氯代二苯并二英(TCDD)和苯并芘(B[a]P)对原代培养鲫鱼肝细胞中卵黄蛋白原诱导的影响

通过测定原代培养鲫鱼(Carassius auratus)肝细胞中雌激素受体所介导的卵黄蛋白原(Vtg)生成以及芳香烃受体所介导的CYP1A1基因转录水平的变化, 建立了一种类雌激素体外实验模型. 实验结果表明, Vtg和Vtg mRNA的表达与己烯雌酚(DES)之间均有很好的剂量-效应关系, Vtg和Vtg mRNA均可作为指示类雌激素毒性的生物标志物. TCDD, B[a]P可显著抑制鱼肝细胞中DES诱导的Vtg和Vtg mRNA的表达, 呈明显的抗雌激素效应, 并同时激活了CYP1A1 基因的表达; 但0.1和0.2 pg/mL的TCDD和5 ng/mL的B[a]P对Vtg和Vtg mRNA表达却有一定的促进作用, 表明TCDD和B[a]P在不同的浓度下, 可能呈现出相反的毒性效应; b-naphthoflavone(b-NF)可抑制鱼肝细胞中DES诱导的Vtg和Vtg mRNA的表达, 并可激活CYP1A1基因的表达; Tamoxifen抑制了鱼肝细胞中Vtg和Vtg mRNA的表达, 但不能诱导CYP1A1基因的表达; 而TCDD诱导细胞CYP1A1基因的表达同样可被DES抑制; 上述实验结果说明鱼肝细胞中分别受雌激素受体和芳香烃受体所介导的途径之间存在某些相互作用关系, 这为研究类雌激素复合暴露下的致毒机理提供了新的实验证据.