TNF-α 诱导血管内皮细胞的衰老

TNF-α 是 极为重要的促炎性细胞因子, 在调节细胞免疫反应中起着多种生理和病理作用. TNF-α 能激活血管内皮细胞, 继而表达多种细胞因子和黏附分子引发一系列的炎性白细胞浸润和炎症反应. 研究发现TNF-α 炎性刺激除了能引起内皮细胞死亡外, 还能诱导内皮细胞的衰老. TNF-α 处理的血管内皮细胞衰老相关的β-半乳糖苷酶染色反应显示阳性, 细胞周期停滞在G0~G1期; 内皮细胞中线粒体膜电位早期上升, 衰老时则降低, 表征早期细胞线粒体功能亢进, 而后期功能衰退; 活性氧水平早期有上升和下降的振荡, 诱导衰老后有所降低. 结果表明线粒体的功能变化与TNF-α 诱导的内皮细胞衰老有关.     

一种新硫色满酮衍生物诱导人乳腺癌MCF-7细胞凋亡

初步研究了新合成的(顺)-3-(氯代亚甲基)-5-甲基-硫色满-4-酮(3-chloromethylene-5-fluoro-thiochroman-4-one,CMTK)对人乳腺癌MCF-7细胞增殖和凋亡的影响,分别用不同浓度的CMTK对细胞进行干预,采用改良的MTT法测定CMTK抑制细胞增殖的能力,台盼蓝染色法计数活细胞数,绘制生长曲线,流式细胞术检测细胞对细胞周期的影响,同时采用流式细胞术及TUNEL染色法(terminal dexynucleotidyl transferase(TdT)-mediated dUTP nick end labelling)检测CMTK诱导凋亡,活性检测法测定细胞中人半胱氨酸蛋白酶8(caspase-8)和人半胱氨酸蛋白酶9(caspase-9)的活性,ELISA法测人死亡受体3(deathreceptor3,DR3)、人肿瘤坏死因子受体1(tumor necrosis factor receptor1,TNFR1)、人肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、人半胱氨酸蛋白酶3(caspase-3)的蛋白表达情况.结果表明,CMTK可明显抑制MCF-7细胞增殖,与顺铂(cisplatin,CDDP)相比,其抗肿瘤活性更明显,IC50为14.24±0.12molL1;生长曲线进一步说明CMTK抑制细胞增殖,其抑制作用呈时间-剂量依赖性;流式细胞仪检测分析显示,加药12和24h后可将细胞阻滞于G0/G1期(**P<0.05);TUNEL法和流式细胞仪分析CMTK可诱导凋亡的结果基本一致;与药物作用后,caspase-8和caspase-9的活性增高,并呈浓度剂量依赖性;ELISA法检测DR3蛋白量和TNF-细胞因子的量无变化,TNFR1和caspase-3的蛋白量显著增高,CMTK诱导肿瘤细胞凋亡的机制可能是:不仅可以通过死亡受体TNFR1介导凋亡途径,激活caspase-8;还可以通过线粒体凋亡途径,激活caspase-9;最终激活caspase-3凋亡通路.本研究为深入研究CMTK诱导肿瘤细胞凋亡的机制提供了依据.     

TNF—α诱导血管内皮细胞的衰老

TNF－α是极为重要的促炎性细胞因子，在调节细胞免疫反应中起着多种生理和病理作用。TNF－α能激活血管内皮细胞，继而表达多种细胞因子和黏附分子引发一系列的炎性白细胞浸润和炎症反应。研究发现TNF－α炎性刺激除了能引起内皮细胞死亡外，还能诱导内皮细胞的衰老。TNF－α处理的血管内皮细胞衰老相关的β－半乳糖苷酶染色反应显示阳性，细胞周期停滞在G0－G1期；内皮细胞中线粒体膜电位早期上升，衰老时则降低，表征早期细胞线粒体功能亢进，而后期功能衰退；活性氧水平早期有上升和下降的振荡，诱导衰老后有所降低。结果表明线粒体的功能变化与TNF－α诱导的内皮细胞衰老有关。     

黑果枸杞花色苷Pt3G对前列腺癌LNCaP和PC-3细胞增殖与凋亡的影响

有报道指出,花色苷对疾病具有一定的化学预防活性.黑果枸杞富含花色苷,具有多种生物活性.本实验前期研究发现,黑果枸杞花色苷Pt3G可通过ROS/PTEN/PI3K/Akt途径抑制前列腺癌DU145细胞的增殖.本研究针对另外2种前列腺癌细胞LNCaP和PC-3进一步探讨黑果枸杞花色苷Pt3G抑制前列腺癌细胞的作用及其相关机制.采用甲基噻唑基四唑比色法检测细胞增殖、流式细胞术和TdT介导的dUTP缺口末端标记技术(TdT-mediated dUTP nick-end labeling, TUNEL)法检测细胞凋亡以及蛋白印迹法检测相关蛋白的表达.结果表明, Pt3G以浓度依赖性方式抑制细胞增殖,其抑制LNCaP和PC-3细胞的半数抑制浓度分别为601.97和445.79μg/mL.流式细胞术和TUNEL检测发现, Pt3G能够诱导前列腺癌LNCaP和PC-3细胞凋亡,并促进细胞周期阻滞在S期.而且,不同浓度Pt3G处理前列腺癌细胞24 h后,细胞抗凋亡因子PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt的表达水平显著降低,而促凋亡因子Bax、Cytochrome c、caspase 3、cleav...     

(DIPP-L-Leu)2-L-Lys-OCH3抑制K562细胞周期并诱导细胞凋亡

利用本实验室建立的方法，合成了20种N-磷酰二肽甲酯，通过MTT比色实验筛选，发现（DIPP-L-Leu)2-L-Lys-OCH3对K562细胞的增殖抑制作用明显好于其他的N-磷酰二肽甲酯（IC50为22.66μmol/L），通过对其结构类似物的活性研究，发现DIPP-和-OCH3都是使其具有活性的必不可少的基团，细胞核的形态学改变，DNA琼脂糖凝胶电泳出现梯状条带及流式细胞仪检测到早期的凋亡细胞都证明（DIPP-L-Leu)2-L-Lys-OCH3对K562细胞的增殖抑制作用是通过诱导其发生细胞凋亡实现的，利用碘化丙锭对细胞核内染色质进行着色，流式细胞仪测定细胞内DNA分布情况，发现（DIPP-L-Leu)2-L-Lys-OCH3同时具有细胞周期抑制作用，推测（DIPP-L-Leu)2-L-Lys-OCH3可能通过将细胞阻滞在G2/M期，再启动这一时相的凋亡调控机制而引发细胞凋亡。     

一氧化氮损伤神经细胞线粒体并诱导细胞凋亡

研究了一氧化氮对原代培养的大鼠小脑颗粒神经元的细胞毒性及其作用机理 .实验结果表明 ,一氧化氮供体S 亚硝基 N 乙酰基青霉胺 (SNAP ;5 0 0 μmol/L)可诱导未成熟小脑颗粒神经元凋亡 .流式细胞分析及HPLC分析表明 ,神经细胞经SNAP处理后线粒体跨膜电位及细胞内ATP含量均明显下降 .一氧化氮清除剂血红蛋白可有效保护线粒体 ,防止细胞凋亡 .实验结果提示 ,一氧化氮通过抑制线粒体呼吸链的活力、降低细胞内ATP含量而启动细胞凋亡程序 .     

杆状病毒诱导凋亡昆虫细胞中的线粒体反应和Ca2+的变化

以罗丹明123作为线粒体跨膜电位荧光标记探针, 流式细胞术和激光共聚焦显微镜研究显示, SfaMNPV诱导凋亡的斜纹夜蛾SL-1细胞, 线粒体跨膜电位(&#8710;Ψm)产生明显改变, 病毒接种后4 h, 膜电位开始下降, 随着病毒感染进程的延续, 线粒体膜电位&#8710;Ψm持续降低. 利用Western 杂交分析定位于线粒体的Bcl-2蛋白, 结果表明, 线粒体Bcl-2蛋白含量随病毒感染逐渐减小, 表达水平降低, 病毒感染下调了Bcl-2蛋白的表达. Western杂交检测到显示细胞色素c从线粒体向细胞质中释放, 并在细胞质逐渐积累, 呈时间依赖性特征. 病毒感染诱发的线粒体反应, 提示杆状病毒诱导昆虫细胞凋亡, 可能存在线粒体介导的凋亡信号转导途径. 以Ca²⁺荧光探针Fluo-3/AM负载, 激光共聚焦显微镜观察和荧光分光光度计测定凋亡细胞 [Ca²⁺]_i浓度的变化, 检测到病毒诱导凋亡细胞内的[Ca²⁺]_i浓度明显升高, 细胞外Ca²⁺内流; 在EGTA抑制胞外钙离子内流和细胞质Ca²⁺钳制状态下, PI染色后流式细胞仪检测显示细胞凋亡不受影响, 说明胞质内游离Ca²⁺升高和胞外钙离子内流不是细胞凋亡的主要诱因, 提示内质网钙库Ca²⁺排空可能是SfaMNPV诱导SL-1细胞凋亡信号转导通路中的重要媒介.     

叶酸-磁性淀粉纳米颗粒的研制及其肿瘤靶向磁热疗效应分析

采用反相微乳液法制备了包裹磁流体的淀粉纳米颗粒(StNP@Fe₂O₃), 再经叶酸活性物质(FA-PEG-NH2)修饰, 得到叶酸-磁性淀粉纳米颗粒(FA-StNP@Fe₂O₃),透射电子显微镜和激光粒度分析仪检测显示, 所得颗粒的平均粒径约为250 nm;邻菲罗啉法检测FA-StNP@Fe2O3的含铁量为2 mg/g. FA-StNP@Fe₂O₃纳米颗粒在交变磁场下作用30 min, 可使环境温度(37℃)升高到42～43℃, 显示其具有一定的磁热效应. 将纳米颗粒分别与HUEC-12正常细胞和Hela肿瘤细胞共培养, 经交变磁场作用后, 通过四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)实验、Hochest-PI双染色分析、流式细胞仪技术检测了纳米颗粒在细胞水平的生物学效应, 结果表明, FA-StNP@Fe₂O₃纳米颗粒在未加磁场时, 在一定浓度范围内对细胞的增殖无明显影响; 而在一定交变磁场强度作用下则能有效地诱导HeLa细胞凋亡, 细胞凋亡率为13.4%, 普鲁士蓝染色实验显示, 叶酸修饰有助于FA-StNP@Fe₂O₃纳米颗粒靶向识别HeLa细胞. 研究表明, FA-StNP@Fe₂O₃纳米颗粒具有良好的肿瘤靶向磁热治疗效果, 可望应用于肿瘤的靶向治疗.     

体外定向诱导胚胎干细胞为造血细胞

采用分阶段诱导小鼠和人胚胎细胞分化的培养体系,用流式细胞仪,免疫组织化学及Ｗｒｉｇｈｔ染色鉴定细胞,探索体外定向诱导小鼠及人的胚胎干细胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ,ＥＳ）为造血细胞的方法,为胚胎干细胞来源的造血细胞应用于临床,以及研究造血细胞发育机制奠定基础。     

科学家发现新一代抗衰老物质

近期,我国科学家从天然药库中筛选并发现葡萄籽提取物(GSE)具有清除衰老细胞的作用,而其组分PCC1能够选择性诱导衰老细胞凋亡.结合多种小鼠模型研究,研究组全面揭示了PCC1清除小鼠体内衰老细胞、改善衰老相关疾病治疗效率、延长老年小鼠寿命的显著效果和作用机制.该研究表明,PCC1是高度具有医学转化价值的新一代抗衰老物质...     

白藜芦醇双向调节核转录因子-kB活化和HEK293细胞增殖

白藜芦醇(resveratrol, Res)是一种广泛存在于植物中的多酚化合物, 临床前研究显示其具有抗氧化、抗炎以及潜在的抗肿瘤作用. 为进一步了解白藜芦醇临床应用的可能性和安全性, 研究了其对于人胚肾HEK293细胞增殖的影响及其可能的作用机制. 利用台盼蓝拒染方法测定细胞增殖活性, PI染色-流式细胞分析法测定细胞周期和细胞凋亡, 利用稳定转染的HEK293/luc-kB细胞株和荧光素酶报告基因法测定细胞内核转录因子-kB(NF-kB)活化水平, 酶联免疫法测定细胞培养液中人白介素-8(IL-8)含量. 结果表明, 经10-7 mol/L白藜芦醇处理48 h, HEK293细胞增殖明显增加. 在联合10 ng/mL 的肿瘤坏死因子-a(TNFa)处理时, 10-8～10-7 mol/L白藜芦醇(24 h)和10-6 mol/L白藜芦醇(48 h)也可明显促进细胞增殖. 10-4 mol/L白藜芦醇单独或联合处理均明显抑制细胞生长. 处理24 h时, 10-7 mol/L白藜芦醇显著下调内源性和TNFa诱导的NF-kB活化, 但在10-4 mol/L浓度下明显上调NF-kB活化. 10-4 mol/L 白藜芦醇还明显增加培养液中IL-8含量, 引发明显的S期细胞周期阻滞并伴随轻微细胞凋亡; TNFa对10-4 mol/L白藜芦醇的上述活性具有协同作用. 由于白藜芦醇可以双向调节体外细胞增殖, 对其可能的临床应用应予全面评价.     

腺病毒介导的CTLA4-FasL基因转移预防小鼠自身免疫性糖尿病

抑制或删除自身免疫性T细胞对胰岛素生成细胞——β细胞的破坏可以有效预防1型糖尿病的发生. 研究表明CTLA4-FasL双功能免疫抑制分子可以抑制T细胞活化及促进T细胞的凋亡. 在多次小剂量(40 mg/kg)腹腔注射链脲佐菌素诱导的小鼠自身免疫性糖尿病模型中, 初次给予链脲佐菌素的同时, 经尾静脉输注(2 ~ 5)×10⁸ pfu/mL CTLA4-FasL腺病毒进行基因治疗后, 糖尿病的发病率显著降低(13%, n = 15), 血糖和胰岛素水平维持正常; 且显著诱导胰腺淋巴细胞凋亡及胰腺淋巴细胞IFN-γ与Vβ8.2 TCR的mRNA表达明显下降. 表明腺病毒介导CTLA4-FasL基因治疗, 有效诱导自身反应性T细胞凋亡, 提示其在预防自身免疫性糖尿病的潜在价值.     

35ku的PF18-3分子在小鼠胸腺细胞凋亡亚群上的特异表达

ＰＦ１８－３抗体是一株大鼠抗小鼠胸腺基质细胞单克隆抗体。在以往的共培养研究中发现该抗体可抑制小鼠胸腺树突状细胞系（ＭＴＳＣ４）诱导的胸腺细胞凋亡作用。目的是观察ＰＦ１８－３抗体识别分子（ＰＦ１８－３分子）的特点及其在ＭＴＳＣ４诱导的胸腺细胞凋亡中的作用。利用流式细胞仪对ＰＦ１８－３分子的表达进行了特性分析，发现ＰＦ１８－３分子除表达于ＭＴＳＣ４表面外，还表达于ＣｏｎＡ活化的胸腺细胞上，但新鲜胸腺细     

疫霉菌激发子PB90诱导烟草悬浮细胞的凋亡

激发子PB90是疫霉菌(Phytophthora boehmeriae)分泌的一种分子量为90 kD的胞外蛋白激发子, 该激发子可以诱导非寄主植物烟草的过敏反应和系统获得抗性. BY-2烟草悬浮细胞经该激发子PB90处理后, Trypan blue染色观察到细胞死亡, 这种死亡可被蛋白质合成抑制剂Cycloheximide抑制, 表明这种细胞死亡是主动死亡过程. 提取PB90处理的悬浮细胞的DNA进行琼脂糖凝胶电泳观察到DNA Ladder现象, 表明核小体间的DNA发生了断裂; 对经PB90分别处理4和12 h的烟草悬浮细胞进行TUNEL染色, 观察到较强的阳性信号, 进一步表明其细胞核内发生了DNA末端断裂; 同时结合DAPI染色观察到经PB90处理后的细胞染色质凝集、细胞核解体形成凋亡小体等细胞凋亡的形态学特征. 上述结果表明激发子PB90可以诱导BY-2烟草悬浮细胞发生细胞凋亡, 提示该激发子诱导的过敏反应是一个细胞凋亡过程.     

神经干细胞体外扩增和诱导分化为多巴胺能神经细胞

神经干细胞(neural stem cell, NSC)是神经系统发生的始祖细胞, 具有自我更新和多向分化潜能. NSC的研究不仅对阐明神经系统发育有重要意义, 对神经系统疾病的治疗也提出了新的思路. 在体外对NSC进行培养鉴定和扩增, 细胞巢蛋白表达阳性, 具有多向分化能力; 体外传代培养15代后, 细胞数量增加约2.4(±0.4)×10⁴倍; 在无血清培养体系中诱导NSC分化为多巴胺能神经细胞, 结果表明, 抗坏血酸(ascorbic acid, AA)能明显提高NSC定向分化为多巴胺能神经细胞的比例(由对照的(0.7±0.3)%升高到AA 100 mmol/L时的(17.2±2.3)%, P < 0.01). 这为获得足够的治疗帕金森疾病(PD)的多巴胺能神经元提供了新的思路, 对更好地利用NSC移植治疗PD有重要意义.     

青蒿琥酯对人白血病K562 细胞凋亡抑制蛋白表达的影响

用Western blot 法检测青蒿琥酯对白血病K562 细胞的X 染色体连锁凋亡抑制因子 (X-linked inhibitor of apoptosis protein, XIAP)、存活素(Survivin)、细胞凋亡抑制蛋白1 (cellular IAP1, cIAP-1)和细胞凋亡抑制蛋白2 (cellular IAP2, cIAP-2)表达的影响, 以及对K562 细胞半胱 氨酸天冬氨酸酶3 (caspase-3)和多聚ADP-核糖聚合酶裂解片段(poly ADP-ribose polymerase cleavage, PARP cleavage)的作用. 青蒿琥酯能够下调XIAP, Survivin 和cIAP-2 的表达, 上调 caspase-3 活化亚基(17 kD)和PARP cleavage (85 kD)的表达. 青蒿琥酯通过下调XIAP, Survivin 和cIAP-2 的表达来诱导白血病细胞凋亡, caspase-3 也与诱导白血病细胞凋亡有关.     

白藜芦醇双向调节核转录因子-κB活化和HEK293细胞增殖

白藜芦醇(resveratrol, Res)是一种广泛存在于植物中的多酚化合物, 临床前研究显示其具有抗氧化、抗炎以及潜在的抗肿瘤作用. 为进一步了解白藜芦醇临床应用的可能性和安全性, 研究了其对于人胚肾HEK293细胞增殖的影响及其可能的作用机制. 利用台盼蓝拒染方法测定细胞增殖活性, PI染色-流式细胞分析法测定细胞周期和细胞凋亡, 利用稳定转染的HEK293/luc-κB细胞株和荧光素酶报告基因法测定细胞内核转录因子-κB(NF-κB)活化水平, 酶联免疫法测定细胞培养液中人白介素-8(IL-8)含量. 结果表明, 经10^-7 mol/L白藜芦醇处理48 h, HEK293细胞增殖明显增加. 在联合10 ng/mL 的肿瘤坏死因子-α(TNFα)处理时, 10^-8~10^-7 mol/L白藜芦醇(24 h)和10^-6 mol/L白藜芦醇(48 h)也可明显促进细胞增殖. 10^-4 mol/L白藜芦醇单独或联合处理均明显抑制细胞生长. 处理24 h时, 10^-7 mol/L白藜芦醇显著下调内源性和TNFa诱导的NF-κB活化, 但在10^-4 mol/L浓度下明显上调NF-κB活化. 10^-4 mol/L 白藜芦醇还明显增加培养液中IL-8含量, 引发明显的S期细胞周期阻滞并伴随轻微细胞凋亡; TNFα对10^-4 mol/L白藜芦醇的上述活性具有协同作用. 由于白藜芦醇可以双向调节体外细胞增殖, 对其可能的临床应用应予全面评价.     

利用正义和反义技术研究着丝粒/动粒复合体蛋白CENP-B在细胞周期调控中的作用

为研究着丝粒/动粒复合体蛋白(centromere/kinetochore complex protein-B, CENP-B)高表达和低表达在细胞周期调控中的作用, 将全长CENP-B cDNA基因(cenpb)构建到pBI-EGFP真核表达载体上, 获得正义和反义cenpb真核表达重组质粒, 并转染HeLa-Tet-Off细胞. 结果表明, 正义质粒转染导致细胞产生巨型着丝粒/动粒复合体, 细胞分裂几次后发生凋亡; 转染反义质粒至HeLa-Tet-Off细胞, 克隆筛选获得稳定表达反义cenpb的细胞株HACPB. HACPB细胞着丝粒/动粒复合体小、数量多, CENP-B表达量低; 细胞周期延长, 恶性表型降低, 裸鼠致瘤能力降低, G2/M期向下一周期的G1期过渡发生延迟. 细胞周期蛋白相关激酶(cyclin-dependent kinases, CDKs)、细胞周期蛋白、细胞周期蛋白相关激酶抑制剂(CDK inhibitors, CKIs)等的表达在某时相发生特异的变化. 这些结果说明, CENP-B是维持着丝粒/动粒复合体正常结构和功能的必需组分, 并参与细胞周期调控.     

Nutlin-3a可降低野生型p53肿瘤细胞对紫杉醇的敏感性

p53通路在细胞周期停滞和细胞凋亡中起重要作用.p53的下降可增加肿瘤细胞对化疗或放疗的耐药性.小鼠双微蛋白2(murine double minute2,MDM2)可与p53结合,调节其转录活性和稳定性.本研究旨在观察MDM2拮抗剂Nutlin-3a在非小细胞肺癌野生型p53+/+A549细胞及p53-/-H1299细胞对紫杉醇的反应中的作用.研究发现,Nutlin-3a联合紫杉醇可使A549细胞G0-G1和G2-M期明显增多,S期显著减少;凋亡百分率显著低于单紫杉醇处理组与p53-/-的H1299细胞组.总之,Nutlin-3a联合紫杉醇大大减少了野生型p53+/+的A549细胞对紫杉醇的敏感性,Nutlin-3a对紫杉醇毒性的调控依赖于p53的状态,它可以保护野生型p53细胞免受有丝分裂抑制药物紫杉醇的杀伤.     

JWA参与维甲酸、佛波酯和三氧化二砷诱导急性早幼

JWA基因是受维甲酸(RA)、 13顺-维甲酸(13-cRA)和佛波酯(TPA)等调控的细胞骨架相关基因. 以前的研究发现, JWA基因与细胞分化和凋亡有关. 为了探讨JWA基因在急性早幼粒细胞性白血病(APL)细胞分化和凋亡过程中的作用及机制, 分别用ATRA, 4HPR, TPA和As2O3处理NB4细胞, Western blot和RT-RCR检测JWA基因在蛋白和mRNA水平的表达, 同时检测细胞周期和CD11b, CD33细胞表面抗原, 分析细胞分化和凋亡. 结果表明ATRA和 As2O3分别诱导细胞分化和凋亡, 而4HPR和TPA对NB4细胞分化和凋亡有双重诱导作用. 在诱导细胞分化和凋亡过程中, JWA基因的表达水平均上调, 但PML / RARα 融合基因变化不明显; 用JWA反义核酸处理NB4细胞后, TPA诱导其分化和调亡的作用受到明显抑制. TPA对NB4的作用可能是通过由JWA参与的直接和间接两种途径实现的. 在对APL(M3)原代细胞的研究中除观察到与NB4细胞相似的JWA的变化外, 还发现一特异的与APL细胞分化和凋亡有关的异常分子量的JWA蛋白; 异常分子量的JWA蛋白是否是APL(M3)区别于NB4细胞的一种分子标志物以及JWA是否通过caspases信号调节通路参与NB4细胞分化和凋亡等均有待进一步研究证实.