PMA与PCR结合的细菌活细胞检测方法

基于PCR的分子生物技术在检测过程中不能有效区分样品中细菌的死活状态,这会导致对细菌数量的错误估计.文中用叠氮溴化丙锭(PMA)对样品基因组提取进行前处理,使PMA与样品中死细胞的DNA分子共价交联,并抑制该DNA分子的PCR扩增.结果表明:当样品中PMA质量浓度大于3μg/mL、曝光时间大于3 min时,PMA可抑制细胞膜破裂的E.coli死细胞DNA的PCR扩增;PMA质量浓度高于50μg/mL时对活细胞DNA的PCR扩增有一定影响;当浊度小于10NTU时,PMA能有效地抑制死细胞DNA的PCR扩增,而当浊度大于100NTU时,PMA失去效果.     

PMA-qPCR快速检测结核活菌方法的建立

为建立快速鉴别诊断结核活/死菌的方法,本研究应用PMA染料与实时定量PCR技术结合(PMA-qPCR),以结核标准株16 sRNA基因为靶基因,PMA对样品基因组提取物进行处理,PMA能够与死细胞DNA分子共价交联并抑制DNA分子扩增。结果显示:PMA浓度在3μg/mL,曝光时间大于15 min时,PMA既不影响活菌的的扩增,又能有效抑制死菌的扩增;当PMA浓度大于20μg/mL时,PMA影响活菌DNA的扩增;PMA-qPCR技术能够定量不同比例的结核活/死菌悬液中的活菌。结论:PMA-qPCR技术能够快速准确检测出结核杆菌中的活细胞。     

硫酸二甲酯对毛泡桐丛枝病幼苗植原体及SSR扩增位点的影响

通过形态观察、巢式PCR和SSR分析,研究了不同浓度硫酸二甲酯(DMS)处理对毛泡桐丛枝病幼苗植原体及泡桐DNA的SSR扩增位点变化的影响。结果表明:质量浓度为15 mg/L的硫酸二甲酯处理5 h或质量浓度大于25 mg/L的硫酸二甲酯处理3 h以上仍成活的幼苗其形态上可转变为健康幼苗,但15 mg/L硫酸二甲酯处理5 h时形态健康的幼苗仍有丛枝病植原体的存在,而其余浓度处理后存活的幼苗内则检测不到植原体;质量浓度大于150 mg/L的硫酸二甲酯处理3 h以上的幼苗全部死亡。此外,毛泡桐丛枝病幼苗、健康幼苗和DMS处理后形态健康幼苗DNA的SSR扩增位点相同。     

微量热研究稀土离子对大肠杆菌的作用

用不同浓度的甲醛染毒人宫颈癌Hela细胞、离体小鼠睾丸细胞、昆虫小菜蛾细胞,应用单细胞凝胶电泳技术检测细胞DNA的损伤效应.结果表明:对于Hela细胞和小菜蛾细胞,甲醛在10 μmol/L时可以极显著地诱导DNA断裂(P<0.01);在30 μmol/L时既有断裂也有交联作用(P<0.01),而在50μmol/L时尾部DNA百分比和尾距与阴性对照组无显著差异(P>0.05).对于睾丸细胞,甲醛在10μmol/L、30 μmol/L和50μmol/L时均可导致DNA断裂(P<0.05,P<0.01).该结果提示:甲醛兼具有断裂和交联的作用,可引起多种细胞DNA的损伤.     

复合铝混凝剂CPAC强化混凝去除藻类试验研究

以三氯化铝和有机高分子PGA为原料,制备了复合混凝剂CPAC,并探讨了该种混凝剂对含藻水的强化混凝去除作用.结果表明:复合混凝剂混凝效果优于单独的无机混凝剂PAC,当混凝剂投加量(以Al质量计)为4.5 mg/L时,PAC的浊度去除率为84.3%,而CPAC的浊度去除率达到93.1%;CPAC对高浊度原水的去除效果好于低浊度原水,当原水浓度从30 NTU提高到1 000 NTU时,混凝剂投加量为4.5 mg/L,其浊度去除率相应的由81%提高到98.2%;混凝剂最挂投加量约为4.5 mg/L,在此浓度下,浊度和叶绿素a 的去除率达到最高,分别为93.1%和82.5%;pH在5.0～9.0范围内,混凝效果均比较稳定.     

苎麻绿原酸体外抗乙型肝炎病毒的作用研究

为了考察苎麻绿原酸对HepG 2 2.2.15细胞毒性作用,以及对其HBsAg、HBeAg表达的抑制作用,本研究提取苎麻中的绿原酸,配成100.00 μg/mL、50.00 μg/mL、25.00 μg/mL、12.50 μg/mL和6.25 μg/mL 5个浓度,作用于HepG 2 2.2.15细胞,在第3日、第6日和第9日分别收集上清液,四甲基噻唑蓝（MTT）法检测药物的细胞毒性;酶联免疫（ELISA）法检测HBsAg和HBeAg水平。实验结果表明：苎麻绿原酸对HepG 2 2.2.15细胞无毒性作用,其对HBsAg的表达呈现一定的抑制作用,且呈时间依赖性和浓度依赖性抑制,在第9日,最高浓度100.00 μg/mL时抑制率为70.12%;对HBeAg的分泌无抑制作用。苎麻绿原酸无细胞毒性作用,能明显抑制HepG 2 2.2.15细胞HBsAg的表达。     

膜-好氧组合工艺处理餐饮废水的研究

采用无机膜－好氧组合工艺对高浓度餐饮废水（COD15000mg/L)进行处理，考察进水COD浓度，溶解氧浓度，水力停留时间对好氧反应器处理效果的影响，结果表明，当水力停留时间大于5．6h时，废水的COD去除率高于90％，温度对处理效果影响不大。对好氧出水用无机膜进行分离，最终出水COD小于25mg/L，浊度小于1NTU。     

一种利用微波炉加热快速提取细菌DNA用于PCR扩增的方法

利用微波加热原理,探索一种快速、简单、高效提取细菌DNA用于常规PCR快速检测的方法。在微波炉额定功率800 W条件下分别对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特氏菌、副溶血弧菌、沙门氏菌以及志贺氏菌6种常见食源性病原菌进行微波处理,离心取上清,获取细菌DNA,将样本DNA进行PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳进行验证。并进一步采用微波加热方法针对6种病原菌最低检出浓度和混合提取6种病原菌DNA的PCR检测进行分析。6种病原菌在微波炉中加热40-130 s的上清DNA样本均能用于常规PCR扩增。针对检出浓度的分析表明,副溶血弧菌的最低检出浓度为103 cfu/ml,金黄色葡萄球菌为104 cfu/ml,肠出血性大肠杆菌为105 cfu/ml,肠炎沙门氏菌和福氏志贺氏菌的最低检出浓度为106 cfu/ml,针对单核细胞增生李斯特氏杆菌的的最低检出浓度为107 cfu/ml。进行6种混合菌微波共提取时,其中5种病原菌的特异性基因都能扩出,并且条带很亮。该微波提取方法具有快速,简单,高效的特点,能满足大部分食源性病原菌的常规PCR检测需求,大大节约了时间和成本,具有广泛的适用性,为细菌快速分子检测提供了简便手段。     

一种采用微波炉加热快速提取细菌DNA用于PCR扩增的方法

利用微波加热原理,探索一种快速、简单、高效提取细菌DNA用于常规PCR快速检测的方法.在微波炉额定功率800 W条件下分别对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特氏菌、副溶血弧菌、沙门氏菌以及志贺氏菌6种常见食源性病原菌进行微波处理,离心取上清,获取细菌DNA,将样本DNA进行PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳进行验证.并进一步采用微波加热方法针对6种病原菌最低检出浓度和混合提取6种病原菌DNA的PCR检测进行分析.6种病原菌在微波炉中加热40-130 s的上清DNA样本均能用于常规PCR扩增.针对检出浓度的分析表明,副溶血弧菌的最低检出浓度为103cfu/ml,金黄色葡萄球菌为104cfu/ml,肠出血性大肠杆菌为105cfu/ml,肠炎沙门氏菌和福氏志贺氏菌的最低检出浓度为106cfu/ml,针对单核细胞增生李斯特氏杆菌的的最低检出浓度为107cfu/ml.进行6种混合菌微波共提取时,其中5种病原菌的特异性基因都能扩出,并且条带很亮.该微波提取方法具有快速,简单,高效的特点,能满足大部分食源性病原菌的常规PCR检测需求,大大节约了时间和成本,具有广泛的适用性,为细菌快速分子检测提供了简便手段.     

靶向survivin基因的shRNA慢病毒载体的构建及其对膀胱癌EJ细胞凋亡的影响

目的:构建survivin基因特异性shRNA慢病毒干扰载体,转染膀胱癌EJ细胞,研究survivin基因在膀胱癌细胞株中的表达抑制情况,观察survivin shRNA慢病毒载体对EJ细胞凋亡的影响.方法:以survivin基因为靶标设计shRNA干扰序列,克隆至p SIH1-H1-cop GFP慢病毒载体.干扰载体鉴定正确后转染膀胱癌细胞株EJ细胞,荧光显微镜下观察GFP表达情况,实时荧光定量PCR检测survivin基因mRNA含量变化,Western blotting法检测survivin蛋白表达,Annexin V-FITC/PI双染法检测EJ细胞凋亡情况.结果:PCR扩增鉴定、DNA测序证实survivin慢病毒干扰载体构建成功;EJ细胞经干扰载体处理后,EJ细胞survivin基因mRNA水平下调了73.33%,蛋白表达受到显著抑制,EJ细胞凋亡率达到24.39%.结论:成功构建了靶向survivin基因的shRNA重组慢病毒干扰载体,可以显著降低转染细胞survivin基因的表达水平,并有效提高膀胱癌细胞凋亡率.     

抗菌药物对大肠杆菌防突变浓度研究

通过测定临床常用抗菌药物对大肠杆菌的防突变浓度(MPC)、耐药突变选择窗(MSW)、及耐药选择性指数(SI),为临床治疗提供抗菌药物用药参考,以降低细菌耐药情况的发生.方法:采用琼脂稀释法分别测定利福平、头孢羟氨苄、头孢地尼对大肠杆菌ATCC25922的MPC及SI.结果:利福平对大肠杆菌的MPC,MSW及SI分别为32μg/mL、12～32μg/mL、2.67;头孢羟氨苄的MPC,MSW及SI分别为30μg/mL、17～30μg/mL、1.76;头孢地尼的MPC、MSW及SI分别为0.5μg/mL、0.28～0.5μg/mL、1.78;结论:头孢地尼的抑菌效果明显高于其余两种药物,且其在较低浓度水平即可抑制耐药菌株的产生、防止耐药情况出现.     

BDE-209对人正常肝L-02细胞生长和凋亡的影响

采用Cell Counting Kit-8 (CCK-8)和Hoechst 33342/PI等, 分析十溴联苯醚(BDE-209)对人正常肝L-02细胞增殖和凋亡的影响。结果显示, 在不同浓度水平(0~70 μg/mL)的BDE-209中暴露24小时后, 细胞增殖抑制率随着BDE-209浓度的升高而升高。经SPSS-Probit-Logit法计算, 得出 BDE-209对人正常肝L-02细胞24小时的IC₅₀为127.08 ±24.93 μg/mL。在不同浓度水平(0~15 μg/mL)的BDE-209中暴露24小时后, 与对照组相比, 各剂量组细胞未出现明显的细胞形态变化, 仅在15 μg/mL剂量组观察到细胞减少的现象。凋亡染色后, 荧光显微镜检发现, 随着BDE-209浓度升高, 亮蓝、淡粉染色细胞数量增大, 人正常肝L-02细胞的凋亡率增高。与对照组相比, 各剂量组差异均具有统计学意义。分析结果表明, BDE-209可引起人正常肝L-02细胞增殖受到抑制, 并诱导细胞凋亡率增加。     

红景天苷对BMSC生物学特性影响

目的：研究红景天苷对骨髓间充质干细胞（Bonemesenchymalstemcells,BMSCs）生物学活性影响。方法：采用贴壁法分离培养BMSCs,检测细胞表面分子表达对所获干细胞进行鉴定。以终浓度为10¨g／mL红景天苷与BMSCs共培养,通过形态学观察和MTT法分析研究其对BMSCs生物学特性影响。结果：成功培养出BMSCs,免疫荧光染色显示,培养的第3代BMSCs表达CD29、CD44干细胞标志。10μg／mL红景天苷与BMSCs共培养后,较对照组细胞生长更为旺盛,更为规整,形成典型的“鱼群状”。生长曲线显示,实验组细胞较对照组生长稳定,增殖能力活跃。结论：10μg／mL红景天苷可促进BMSCs增殖分化,又不影响细胞增殖分化等生物学特性。     

北川白山羊血液中总DNA的不同提取条件对PCR的影响

对35只北川白山羊血液中总DNA提取并根据普通牛已知的κ-CN基因序列设计一对引物进行扩增,对影响PCR反应结果的因素进行了比较分析。结果表明:蛋白酶K终浓度为0.05 mg/mL,饱和酚—氯仿抽提3次、每次30 min,采用乙醇沉淀DNA时,DNA产量最低,PCR反应无特异条带;蛋白酶K终浓度为0.1 mg/mL,饱和酚-氯仿抽提1次、每次5 min,分别采用超速离心和乙醇沉淀DNA时,DNA产量最高,PCR反应有特异条带(350 bp),但前者出现引物二聚体,故作PCR反应时选择后者沉淀最佳。     

稀土离子对TaqTMDNA聚合酶的抑制机理

在PCR扩增水平上研究了La^ 3和Ce^ 3对Taq^TMDNA聚合酶的抑制机理,采用动态荧光比色法测定PCR扩增产物浓度，证明了La^ 3和Ce^ 3在10～50μmol／L抑制DNA复制是由于其抑制了Taq^TMDNA聚合酶的活性所致,且该抑制属竞争性的抑制，得到了La^ 3和Ce^ 3对Taq^TMDNA聚合酶的抑制常数分别为12．7μmol／L和14．4μmol／L。     

Mechanism of the interaction between Au nanoparticles and polymerase in nanoparticle PCR

Nanoparticle PCR is a novel method to optimize DNA amplification. It performs well in improving specificity, enhancing sensitivity and speed. Several mechanisms were proposed in previous studies: one was based on the interaction between gold nanoparticles (AuNPs) and DNA while the other was attributed to the heat transfer property of AuNPs. In this paper, we propose that the interaction between AuNPs and DNA polymerase can significantly influence PCR. First, the addition of DNA polymerase can eliminate the inhibitory effects of excess AuNPs. Second, the addition of AuNPs will increase yield of the desired PCR product and make the optimum concentration of DNA polymerase move to higher value. Third, while excess polymerase might inhibit amplification efficiency, AuNPs can reverse this process and the yield of PCR amplification. Based on these results we propose a possible mechanism that AuNPs might modulate the activity of polymerase and improve PCR amplification.     

Optimization of dual effects of Mg– 1Ca alloys on the behavior of chondrocytes and osteoblasts in vitro

Mg ions can enhance the proliferation and redifferentiation of chondrocytes and the osteogenic differentiation of osteoblasts at specific concentrations, respectively. However, degradation of Mg alloys at varying degradation rates could lead to complex changes in the surrounding tissue environment, such as changes in the dynamic concentration of Mg ions and subsequent p H value. Considering the above mentioned factors, the comprehensive effects of Mg alloys on chondrocytes and osteoblasts behaviors have not yet been optimized. In this study, we evaluated the effects of Mg–1Ca microspheres on cell behavior with an aim to optimize conditions favorable for both cell types. Cells were cultured with Mg–1Ca microspheres prepared using the following concentrations: 250 μg/ml, 500 μg/ml and 1000 μg/ml. At specific time points,cytotoxicity, expression of specific genes and extracellular matrix deposition by cells(Alizarin Red Staining of osteoblasts and Alcian blue staining for chondrocytes) were evaluated. The experimental results revealed that Mg–1Ca microspheres prepared at a concentration of 250 μg/ml were optimum for both cell types, where chondrocytes were found to be in hypertrophy state while osteoblasts in close proximity to the microspheres showed osteogenetic differentiation. Interestingly, a slight change in osteoblasts behavior was observed nearer to and at a relative distance away from Mg–1Ca microspheres, an important observation for administering the application of microspheres as potential scaffolds.     

奶样无乳链球菌PCR检测方法敏感性研究

意义无乳链球菌是引起牛临床或亚临床乳腺炎主要病原菌,研究PCR奶样检测方法的敏感性,对探索病原无乳链球菌的简易、快速诊断具有重要意义.目的通过对含细菌数不同奶样的PCR扩增试验的观察和比较研究,探索其检测方法的敏感度.方法常规检测方法初选奶样,然后对其病原菌奶样进行培养、增菌和生化鉴定,筛选出牛无乳链球菌.将得到的无乳链球菌按10个稀释度奶样进行稀释,以标准该菌株作为阳性对照,分别进行PCR扩增、电泳.结果基于编码16S rRNA亚基的编码基因序列设计引物的PCR方法具有独特敏感性,可以检测到1ml生奶样中的一个细菌.     

超滤膜处理地表原水膜阻力特性研究

从实际应用角度考虑,把膜阻力分为构造阻力、滤饼层阻力和吸附阻力,并将后两种阻力与水力冲洗强度联系起来,具有实用性.在过滤地表水源且当水中有机物含量变化不大时,吸附膜比阻力与过滤时间呈线形性增加.原水浊度较高时,吸附膜比阻力较小,反之较高.在过滤初期,吸附膜比阻力与原水UV254相关,原水UV254较高时,初始吸附膜比阻力较高,反之较低.滤饼层阻力随过滤时间呈线性下降.浊度较高的原水,滤饼层膜比阻力较小,且下降速率减缓,亦即由滤饼层阻力转化为吸附阻力的部分减少.因此,原水浊度适当提高,可降低总的膜阻力,增加透水通量.     

草地早熟禾ISSR-PCR反应体系优化

采用正交设计和单因子试验结合的方法,优化适合于草地早熟禾的ISSR体系。对影响ISSR-PCR的多个因素,包括MgCl2、dNTP、Primer、TaqE的浓度和用量进行优化,同时,对DNA模板浓度、引物退火温度进行筛选。确定草地早熟禾的最佳ISSR-PCR反应体系为：94℃预变性5min,94℃变性30 s,Tm值退火45 s,72℃延伸90 s,35个循环,最后72℃延伸10 min,4℃保存;20μL反应体系包括2μL10×Buffer,0.96μL dNTP（2.5×10^-3mol.L^-1）,1μL Primer（1.0×10^-5mol.L^-1）,0.2μL Taq酶（5 U.μL^-1）,1μL Template DNA,14.84μL H2O。