年龄、成熟方式及培养液对小鼠卵母细胞体外成熟和人工活化的影响

为研究卵母细胞能充分在体外成熟和发育,比较了年龄、成熟方式及培养液对昆明白小鼠卵母细胞体外成熟和人工活化的影响.1.5月龄、3月龄、6月龄、9月龄和12月龄小鼠的GV期卵母细胞其体外成熟率无差异(P0.05).经人工活化后,与体内成熟的卵母细胞相比,体外成熟的卵母细胞发育到原核期胚和2-细胞期胚的比率都明显降低;体外成熟的生长在HTF培养液的卵母细胞发育到2-细胞期胚的比率(44.4%)显著高于生长在M16培养液的比率(22.9%)(P0.01).结果表明昆明白小鼠卵母细胞的体外成熟不受年龄影响,体外成熟的卵母细胞人工活化后支持发育的能力比体内成熟的差,HTF培养液更适合小鼠卵母细胞人工活化后的进一步发育.     

昆明白小鼠卵母细胞的生发泡移植

为探讨细胞核与细胞质调控减数分裂的机制，对昆明白小鼠GV期卵母细胞进行了GV移植研究．将6～8周龄小鼠GV期卵母细胞分别与6～8周龄和3月龄小鼠GV期卵母细胞进行GV互换，所形成的3种GV～胞质体复合体的融合率(85．0％～89．8％)和3种重组卵母细胞的成熟率(93．9％～96．2％)并不因小鼠年龄的改变而有所变化．经人工活化后，3种重组卵母细胞形成原核期胚和2-细胞期胚的比率(分别为80．5％～85．4％和51．2％～55．4％)也不因不同年龄小鼠卵母细胞所带来的细胞质或细胞核的改变而受到影响．细胞遗传学分析表明成熟的重组卵母细胞表现出正常的核型．     

促减数分裂甾醇（MAS）对猪卵母细胞体外成熟及其胚胎发育能力的影响

利用促减数分裂甾醇(MAS)合成代谢过程中的抑制剂AY9944累积FF-MAS的原理,在猪卵母细胞体外成熟过程中添加AY9944,间接地研究了内源性MAS对猪卵母细胞体外成熟质量的影响.猪卵丘卵母细胞复合体(cumulus oocyte complexes,COCs)培养在NCSU23成熟培养液中,并添加不同浓度(0,10,20,40μmol/L)的AY9944培养44h.培养结束后,成熟的卵母细胞进行孤雌激活和以胎儿成纤维细胞为核供体重构胚胎,分别于48和144h观察胚胎发育情况,统计卵裂率和囊胚率及囊胚/2-细胞胚比率.结果如下:(1)随着AY9944添加浓度的增加,退化的卵母细胞增多,40μmol/L AY9944处理的退化卵显著,卵母细胞成熟率显著下降.(2)成熟培养液添加20和40μmol/L AY9944处理的孤雌激活胚胎的囊胚形成率和2-细胞胚发育到囊胚的比率显著增加(P<0.05).(3)以对照组(0μmol/L AY9944)和20μmol/L AY9944处理的卵母细胞为胞质受体,发现20μmol/L AY9944处理的克隆胚的发育能力囊胚率和2-细胞胚发育到囊胚的比率有所提高,但无显著差异(P>0.05).以上结果表明,猪卵母细胞体外成熟过程中添加AY9944提高了猪卵母细胞体外成熟的胞质质量,胚胎的发育能力提高.     

绵羊卵母细胞不同采集方法对体外成熟培养的影响

为提高绵羊卵巢卵母细胞的采集效率,提供用于卵母细胞体外成熟培养和体外受精的更多优质的成熟卵母细胞,试验利用抽吸法和剖切法2种采集方法采集绵羊卵巢卵母细胞进行体外成熟培养并对其效果进行了对比研究.结果表明剖切法获得的卵子数量显著高于抽吸法(P<0.05),而所用时间则无显著差异(P>0.05);A、B级卵母细胞的比例在剖切法中显著高于抽吸法(P<0.05),抽吸法所采集的C级细胞显著高于剖切法(P<0.05);剖切法中卵丘扩散率和第一极体排出率要显著高于抽吸法(P<0.05).     

体外培养时间和表皮生长因子对牦牛卵母细胞成熟及孤雌胚胎体外发育的影响

研究在成熟液中添加表皮生长因子（Epidermal growth factor,EGF）以及成熟时间对牦牛卵母细胞体外成熟及孤雌胚胎体外发育的影响,以确立牦牛卵母细胞体外成熟的最佳体系.结果表明,成熟液中添加EGF组的成熟率明显高于未添加组（P＜0.05）,并且牦牛卵母细胞的成熟率随着EGF添加的浓度增加也不断上升;随着体外培养时间的延长,成熟率逐渐增加,培养24 h后成熟率趋于稳定;胚胎体外培养液中添加EGF能显著提高孤雌胚胎的8-细胞和囊胚形成率（P＜0.05）.由此推测：在体外培养22-24 h,且添加40 μg/mL EGF最有利于牦牛卵母细胞体外成熟;胚胎培养液中添加40μg/mLEGF能显著提高牦牛孤雌胚胎的体外发育能力.     

猪卵母细胞体外成熟及电激活后发育能力的研究

探讨了不同的成熟培养液及外源激素对猪卵母细胞体外成熟培养及电激活后孤雌胚胎发育能力的影响. 结果表明：（1）改良M199（mM199）组猪卵母细胞成熟率显著高于M199组，且这两组又较NCSU-23组能极显著提高卵母细胞的成熟率. （2）孕马血清（PMSG）+人绒毛膜促性腺激素（hCG）+促卵泡素（FSH）组卵母细胞成熟率略高于FSH+促黄体素（LH）组，两者卵母细胞成熟率极显著高于尿促性腺激素（hMG）组. （3）含胎牛血清（FBS），猪卵泡液（PFF），表皮生长因子（EGF）的培养液较对照组在卵母细胞成熟率上无显著差异，但均能显著提高电激活后的卵裂率.添加EGF组桑囊率明显高于不添加组.但分别添加FBS和PFF组较对照组在桑囊率上均无显著差异. （4）卵丘细胞扩散与卵母细胞第一极体排出之间无直接相关性，但扩散程度好能提高电激活后的卵裂率.     

小鼠腔前卵泡卵母细胞的体外培养、体外成熟和体外受精研究

小鼠腔前卵泡在体外生长过程中，于培养液中添加血清，以及ＦＳＨ和胰岛素均对小鼠腔前卵泡的体外生长、体外成熟、体外受精起促进作用，其中以胰岛素的效果最为显著，腔前卵泡的体外成熟率和体外受精率可达６９．４％和８０．６％，但是体外受精后的体外发育率低于添加ＦＳＨ的试验组，表明ＦＳＨ有益于卵母细胞生长过程中细胞质的成熟。单层培养的卵巢颗粒细胞对腔前卵泡的体外生长也具有促进作用。将体外受精后发育至２—细胞的胚胎移植入受体鼠，胚胎可以正常着床发育。同时，卵母细胞的核仁和线粒体在培养过程中也发生相应的变化。     

"两步法"体外培养山羊卵母细胞的初步研究

体外成熟培养的卵母细胞经本外受精后，囊胚发育率远低于体内成熟卵母细胞，原因之一是由于体外成熟卵母细胞的不充分获能造成的，有假说认为：卵母细胞在体外培养过程中，如果延长GV期，可促进卵母细胞进一步获能，从而提高发育潜能。本文以山羊卵子为研究对象，探讨了山羊卵泡各种成分以及异种家畜卵泡液对山羊卵母细胞核成熟抑制以及抑制解除后减数分裂的影响，结果显示，山羊50％Q卵泡液、100％卵泡液、半卵泡、打孔整体卵泡以及完整卵泡对山羊卵母细胞的核成熟抑制率分别为：0.00%、9.38%、60.47％、78.26%和70.09%，随后，对经山羊半卵泡、打孔整体卵泡、完整卵泡抑制培养后的卵子进行恢复培养发现，卵子核成熟率分别为：64.29%、3.49%和4.13%，山卵母细胞与半卵泡共培养24h后进行0h、12h、20h、24h和30h的恢复培养，核成率分别为：0.00%、20.00%、61.90%、64.29%和43.75%，表明山羊半卵泡可以有效抑制山羊卵母细胞使之处于GV期，并且这种抑制作用可以恢复，恢复培养时间以20h和24h较为适宜，初步研究异种家畜卵泡液对山羊卵母细胞核成熟抑制的影响发现，50％牛卵泡液、1005牛卵泡液、50％绵羊卵泡液、100％绵羊卵泡液对山羊卵母细胞核成熟抑制率分别为3.7%、21.88%、10.00%、58.82%，表明，100％绵羊卵泡液对山羊卵母细胞核成熟抑制效果较好。     

瘦素对猪卵母细胞体外成熟及克隆猪妊娠率的影响

体细胞克隆猪在人类医学、基础科学研究和畜牧业生产方面均具有很大的应用潜力.为了提高体细胞克隆猪的效率,首先比较了两种基础成熟液NCSU-23和TCM199的体外成熟效果,然后在TCM199培养液的基础上,较系统地研究了添加不同浓度的瘦素对猪卵母细胞成熟、孤雌激活胚胎和克隆胚胎的体外发育以及克隆胚胎体内发育的影响.结果表明:成熟液中添加100ng/mL或200ng/mL瘦素对猪卵母细胞的核成熟没有显著影响(P>0.05);对孤雌激活卵裂率和克隆胚胎卵裂率也没有显著影响(P>0.05);但却显著提高了孤雌激活胚胎的囊胚率和囊胚细胞数,并且显著提高了克隆胚胎的囊胚率;当添加量为100ng/mL时,克隆囊胚的细胞数显著升高.另外,研究表明,瘦素很可能具有提高克隆胚胎移植妊娠率和妊娠到期率的作用.     

小鼠腔前卵泡卵母细胞的体外培养、体外成熟和体外受精研究

小鼠腔前卵泡在体外生长过程中，于培养液中添加血清，以及ＦＳＨ和胰岛素均对小鼠腔前卵泡的体外生长，体外成熟，体外受精起促进作用，其中以胰岛素的效果最为显著，腔前卵泡的体外成熟率和体外受精率可达６９．４％和８０．６％，但是体外受精后的体外发育率低于加ＦＳＨ的试验组，表明ＦＳＨ有益于卵母细胞生长过程中细胞质的成熟，单层培养的卵巢颗粒细胞对腔前卵泡的体外生长也具有促进作用，将体外受精后发育至２－细胞的胚胎     

屠宰母牛卵巢卵母细胞的体外受精与早期发生

将采自屠宰母牛卵巢的未成熟卵子在含有促性腺激素和牛血清的TCM199或Ham'sF10内培养成熟后,再用以钙离子载体Ionophore A23187诱导获能的牛新鲜或冷冻精子进行授精处理,6～7小时后移入发育用培养液,即含有牛血清及丙酮酸钠的M199或Ham's F10内继续培养。在授精48小时及60～96小时后分别统计了培养卵子的受精率及受精卵的卵裂率。在部分实验中把发育为4～8细胞期的胚移入经假孕处理过的母兔输印管内培养4～5天或者在原发育培养液内继续培养5～8天之后观察了桑椹胚、囊胚的出现率。结果是培养卵子的受精率及受精卵的卵裂率分别达92.0～97.8％和62.5～67.6％,移入兔输卵管内和在体外条件下继续培养的卵子中分别有3.7～30.8％和4.3～31.0％(发育为外形正常的桑椹胚～囊胚期胚胎(包括扩张囊■及■化囊胚)。     

第一次减数分裂期小鼠卵母细胞的化学去核

过免疫荧光染色法确定了小鼠第一次减数分裂的进程,在此基础上分别用脱羧秋水仙碱和放线菌酮处理成熟培养的小鼠卵母细胞,抑制其纺锤体极间微管的延长和降低成熟促进因子的浓度,使其核物质随极体全部排出.结果表明:(1) 卵母细胞从有腔卵泡中分离时处于生发泡期,可见核仁;成熟2h内则全部发生生发泡破裂;培养5h,90%到达第一次减数分裂的前中期;培养8h,则33.3%处于中期;71.4%的细胞在成熟12h后发育为后期;第二次减数分裂的中期则于成熟培养15h发生.(2) 于成熟的不同时间取卵母细胞-卵丘细胞复合体进行去核处理后发现,体外成熟培养5h(即卵母细胞处于第一次减数分裂前中期时进行处理),其去核率最高,达85.6%;成熟5h之前各组随成熟培养时间的延长而去核率升高,之后各组则降低.(3) 比较卵母细胞-卵丘细胞复合体与自然裸卵去核率,后者效率为56%,显著低于前者(p＜0.05),因此该方法在卵母细胞-卵丘细胞复合体的完全去核率与传统的物理去核方法相当.     

小鼠卵泡卵母细胞体外成熟培养基的选择

试验选用30只昆明小白鼠,采出卵巢回收卵泡卵母细胞,分别在培养基WM、TALP、M-199、mD-PBS和BMOC-3中培养。小鼠卵泡卵母细胞在五种培养基中的发育率都在81％以上,统计处理之间都没有显著差异。但成熟率差异明显,其中WM最高(65.7％),BMOC-3最低(18.2％),TALP、M-199和mD-PBS则相近,三者的成熟率分别为37.1％、37.5％和38.5％。试验资料表明WM是小鼠卵泡卵母细胞体外成熟的最佳培养基。     

富勒烯及其衍生物对小鼠卵母细胞成熟和激活的作用

为探索富勒烯及其水溶性衍生物对哺乳动物卵母细胞减数分裂的作用,使用富勒烯膦酸衍生物(2P)、富勒烯-PVP和富勒醇作用于体外培养的小鼠GV期卵母细胞和超排卵母细胞,通过观察第一极体排出率和原核形成率以判断卵母细胞的成熟和激活,并探讨光照对这一作用的影响.结果表明,在光照和非光照下,富勒烯的PVP水溶液、富勒醇对卵母细胞的成熟没有明显影响,而2P在光照下对卵母细胞的成熟和孤雌激活具有明显抑制作用,其作用有浓度依赖性.     

细胞松弛素B、温度、离心处理对猪卵母细胞OPS玻璃化冷冻的影响

主要探讨使用CB预处理和不同温度冷冻保护剂对猪卵母细OPS玻璃化冷冻保存的影响,并对使用不同温度冷冻保护剂下,探讨离心猪卵母细胞后的OPS冷冻、解冻的效果.结果表明,体外成熟培养12h后,将经7.5μg/mL细胞松弛素B(CB)处理的猪卵母细胞进行OPS玻璃化冷冻保存.解冻后继续体外成熟培养,猪卵母细胞的形态正常率和成熟率与对照组无显著差异(P>0.05),但是与对照组相比,经冷冻前经CB预处理的卵母细胞其体外受精胚胎的卵裂率、桑葚胚和囊胚率显著提高(P<0.05).此外,使用预平衡至39℃的冷冻保护剂能够达到较好的解冻效果,卵母细胞成熟率较高,但离心并没有促进冷冻后猪卵母细胞体外受精胚胎发育率.     

水牛卵母细胞孤雌激活及孤雌胚与体外受精胚发育的比较

目的对MII期水牛卵母细胞进行人工诱导激活,可以间接判断体外成熟卵母细胞质量的优劣,并且,卵母细胞的充分激活也是提高核移植效率的关键因素之一。比较了水牛卵母细胞体外成熟时间对孤雌激活胚发育能力的影响以及不同化学激活方法对水牛卵母细胞孤雌激活效果的影响,并在相同条件下,对孤雌激活胚与体外受精胚的发育能力进行了比较。结果表明,水牛卵母细胞体外成熟27 h或30 h的囊胚发育率(19.0%,17.7%)明显高于体外成熟21 h或24 h的囊胚发育率(12.3%,13.8%);Ion联合6_DMAP激活水牛卵母细胞的效果优于其他几组激活方法;在相同培养条件下,孤雌激活胚与体外受精胚的发育能力存在着差异,其中卵裂率差异不显著,但孤雌激活胚的囊胚发育率显著高于体外受精胚(21.7%,13.0%)。     

绵羊体外成熟,体外受精卵的体外发育及移植后的产羔

体外成熟、体外受精后的绵羊卵在体外长期培养或在2～4细胞期和桑堪～囊胚期移植给受体母羊,观察了培养卵的发育和移植后的受胎率。方法是将采自屠宰场的绵羊卵巢在1～12小时内带回实验室,抽取卵母细胞。从中选取卵丘细胞层完整的卵子,在二氧化碳培养箱内,用含有10％NSS(或FCS)、hCG和E_2,并以Hepes缓冲的M199培养24～26小时。再用以IonophoreA23187诱导获能处理过的新鲜公羊精于进行体外受精.7～10小时后移入发育培养基,即含有10％FCS(或NSS)和丙酮酸钠的Hepes缓冲的M199内继续培养,受精后将部分发育为2～4细胞胚和桑堪～囊胚期胚手术移植给受体母羊。另一部分卵子则在受精后48～72小时的不同时间内统计其卵裂卵的出现率,并继续培养7～12天详细观察卵裂卵的发育情况。在受精后48～72小时卵裂卵的出现率,FCS和NSS组分别为39.6％145/366)和52.4％(182/347),前者显著低于后者;将61枚2～4细胞期胚和桑椹～囊胚期胚分别移植给20只受体母羊,有10只受胎。共产羔11只,受胎率为50％;在发育培养液内继续培养的482枚卵裂卵中有312枚(64.7％)发育为桑椹～囊胚期胚(其中包括部分孵化囊胚)。     

兔胚胎在不同培养液中体外发育的比较

本试验对比兔2细胞胚胎在三种培养液中体外培养144h后的发育状况。三种培养液分别为：加小牛血清的A组M199培养液、加牛白蛋白5片段的B组M199培养液和加胰岛素、转铁蛋白及谷氨酰胺的C组M199培养液。从发育速度看,A组和B组比C组的胚胎发育快;从发育效果看,发育到囊胚和孵化囊胚的比例,A、B、C三组分别为77．0％、64．8％及7．0％。这两方面结果都说明A、B组培养效果接近,C组的培养效果较差。试验结果表明,B组培养液是研究影响兔胚胎发育因素的适宜培养液。     

犬卵母细胞体外成熟培养前后的超微结构变化

从屠宰场采集犬卵巢，收集间情期（不可见卵泡）和发情期卵巢卵母细胞。成熟培养前，其超微结构有以下特征：间情期犬卵母细胞与卵丘细胞间以及卵丘细胞之间通过胞质突起相连，胞质中的主要细胞器是线粒体和脂滴，质膜下有发达的粗面内质网；囊状卵泡的卵母细胞，结构近似于间情期犬卵母细胞，但细胞间连接更为普遍，胞质中细胞器更加丰富，并出现零星的皮质颗粒。经ＴＣＭ１９９＋２０％ＦＣＳ＋１０ＩＵ／ｍＬＦＳＨ体外培养３６ｈ后，微绒毛、线粒体、滑面内质网、皮质颗粒等细胞器增多，胞质内细胞器向皮质区迁移，核仁发生致密化。体外培养７２ｈ后，卵母细胞进一步成熟，表面微绒毛由倒伏状变得细长且坚起，皮质颗料沿质膜下呈线行排列，线粒体分散于皮质中央     

猪卵母细胞第一极体排出与否对其早期胚胎发育的影响

探讨猪卵母细胞第一极体排出与否对其体外受精和孤雌激活后早期发育的影响．从屠宰场收集猪卵巢卵母细胞,体外成熟培养42-46h后分为3组：排出第一极体组、没有排出第一极体组和对照组（不挑选第一极体卵母细胞）,进行体外受精或化学孤雌激活之后放入胚胎培养液进行体外培养,分别于第48h和第168h统计分裂率和囊胚率．①体外受精后,有极体组的卵裂率略高于无极体组和对照组的卵裂率（62．19％&#177;6．99％vs55．40％&#177;6．80％和56．33％&#177;8．17％）,各组间没有显著差异（P〉0．05）;囊胚率分别为4．87％&#177;3．77％,2．33％&#177;1．34％和3．50％&#177;2．96％,有极体组明显高于无极体组（p〈0．05）,对照组与其它两组没有显著差异（p〉0．05）．②化学激活后,有极体组的卵裂率高于无极体组和对照组（75．45％&#177;1．35％vs64．81％&#177;2．07％和69．64％&#177;2．51％,p〈0．05）;有极体组的囊胚率也高于无极体组和对照组（24．54％&#177;4．34％vs12．96％&#177;3．99％和18．75％&#177;1．87％,p〈0．05）．排出第一极体卵母细胞比没有排出第一极体卵母细胞的发育能力强,但没有排出第一极体卵母细胞经体外受精或人工激活后也可以发育到囊胚阶段．