食管癌表达上调基因EC45 cDNA的克隆

鉴别食管癌中差异表达的基因.利用抑制削减杂交和反式Northern高密度点杂交相结合的方法,获得一个在70%(18/26)食管癌中表达显著上调的基因,命名为EC45.通过放射杂交技术将其定位于3p12-3p11.2.通过筛选食管癌cDNA文库获得全长EC45cDNA(1987bp).EC45编码204个氨基酸,与核糖体蛋白l15的开放阅读框100%同源,但与5'非翻译区和3'非翻译区均无同源性.16种正常成人组织Northern杂交显示EC45均有表达,其转录本大小为2.0kb.以上结果提示:编码核糖体蛋白L15的EC45基因在食管癌组织中表达上调,在食管癌发生发展过程中可能发挥作用.     

cDNA文库的差异筛选与抑制性减数杂交相结合分离胡萝卜体细胞胚根发育相关基因

应用cDNA文库差异筛选与抑制性减数杂交相结合的技术程序,并通过反向Northern分析进一步验证,成功地从解调控12h的胡萝卜体细胞胚的cDNA文库中,分离到7个在解调控12h特异表达的基因.其中4个含有完整的编码框,分别编码木质葡聚糖内转糖基化酶、脂肪酸去饱和酶、一种poly(A)结合蛋白和一种酰基转移酶.另外3个是5′端部分缺失的cDNA基因片段,分别编码三磷酸甘油醛脱氢酶、一种糖蛋白和一种与单链RNA/DNA结合的蛋白.对其中部分基因的Northern分析结果显示,它们的表达量在蔗糖调控下的胡萝卜体细胞胚根发育的不同时期均有显著变化,说明它们都是与胚根发育相关的基因.     

棉花纤维细胞分化相关基因的cDNA阵列分析

利用陆地棉(Gossypiumhirsutum)品种徐州142(野生型)开花前1-3d的胚珠构建了一个高质量的cDNA文库,从该cDNA文库中提取13056个质粒,用Biomek2000高密度点阵系统,将这些质粒点于强化硝酸纤维素膜上.分别用徐州142野生型和无絮突变体开花前1-3d的胚珠mRNA反转录标记探针与cDNA阵列杂交,筛选到8个在野生型胚珠中高表达的基因,其中4个在GenBank中有同源序列,4个为未知新基因.Northern杂交表明有两个基因在野生型中比突变体中表达量显著提高.     

水稻矮化突变体差异表达cDNA片段的克隆与分析

利用抑制性消减杂交（Suppressive subraction hybridization,SSH）分离本实验室获得的一株水稻矮化突变体dwarf69与其野生型对照品系特光矮-2（Rryza sativa,TGA-2 indica）间表达有差异的cDNA片段,分别以dwarf69作为驱赶子,TGA-2为检测子,以及以dwarf69作为检测子,TGA-2为驱赶子建立了两个差异表达cNDA文库,分别代表在TGA-2和dwarf69中特异表达的cDNA,经反式Northern检测这两个文库共得到10个阳性克隆。     

人新的PLP基因全长cDNA的克隆与分析

在批量分离与脑发育相关的基因克隆时,从人3个月胎脑cDNA文库中得到一全长2261bp的cDNA克隆.其开放性阅读框架编码一个含有551个氨基酸残基的蛋白质,此蛋白与一种推测的细胞结构调节蛋白parelemmin同源,故命名为PLP(paralemmin-like protein).GenBank接受号为AF132731.Northern杂交显示该基因只有一个转录本,大小与获得的该克隆吻合.组织表达谱分析发现该基因在成人心脏、骨骼肌中的表达量高于其他组织.     

大蕉冷诱导差减文库的构建与分析

以低温处理的大蕉幼苗cDNA为检测子,未处理的大蕉幼苗cDNA为驱赶子,利用抑制性差减杂交技术(suppression subtractive hybridization,SSH)构建了大蕉幼苗冷诱导差减cDNA文库,通过点杂交差异筛选cD-NA文库,得到约50个低温下表达增强的候选克隆,对其进行DNA测序和同源性比较,发现获得的ESTs在功能上主要涉及信号传导、表达调控、非生物胁迫防御、蛋白质加工和能量代谢等方面。该SSH文库的构建为克隆大蕉抗寒相关基因奠定了基础。     

一条在人睾丸中高表达的新的环指蛋白(RNF20)

从人胎脑构建的cDNA文库中,通过大规模测序筛选的方法获得一条新基因,该基因蛋白序列含有1个环指（RING finger)基序及2个进核信号（nuclear localization signal NLS)序列,钭此基因命名为RNF20（RING Finger 20),用放射杂交细胞系（Radial hybrid RH)方法定位此基因在人染色体的9q22上,Northern杂交表明,其mRNA在睾丸组织中高表达,用小鼠睾丸做原位杂交表明,小鼠的同源基因在精原细胞及初级精母细胞中高表达,未成年小鼠睾丸中的精原细胞没有发达,提示RNF20可能参与精子发生的调控作用。     

Rab结合蛋白RanBP1的同源基因M3的克隆与功能分析

以Ran结合蛋白RanBP1的保守区域作为探针,低严谨条件下杂交筛选人视网膜cDNA文库,得到阳性克隆M3,它与鼠zhx-1基因高度同源.RH作图将其定位于8q24.11～q24.3.拼接EST序列并填补缺口,得到M3 cDNA全长4 934 bp,与Northern blot得到的主要转录本长度一致.此cDNA全序列包括2 622 bp开放阅读框,编码873氨基酸,含有2种翻译调控元件uUAG和TTATTTAT.该基因预测蛋白含有2个锌指结构,5个同源盒保守区,1个双侧核定位序列(NLS)及35个磷酸化位点,表明它既可能作为转录调控因子,也可能受到上游因子的调控.     

应用cDNA微阵列芯片筛选胃癌转移相关基因的初步研究

采用cDNA微阵列技术建立胃癌原发灶和淋巴结转移灶基因表达谱,识别和克隆胃癌转移相关基因。用含10000个已知基因和7000个EST的cDNA微阵列分析胃癌原发灶和淋巴结转移灶表达谱的变化,利用生物信息学分析差异表达基因, RT-PCR和反向Northern点杂交验证cDNA微阵列结果。发现2倍以上的差异表达基因601个,其中淋巴结转移灶中表达上调527个,表达下调74个;2倍以上的差异EST 71个,其中淋巴转移灶中表达上调62个,表达下调9个。在胃癌原发灶中,与细胞免疫、发育、信号转导功能相关基因存在高表达;而在淋巴结转移灶中,与细胞生长、细胞周期、细胞运动和粘附功能相关基因存在高表达。RT-PCR和反向Northern点杂交结果进一步证实carbonic anhydraseⅡ、IGFBP-4基因高表达与胃癌转移相关。通过分析胃癌原发灶和淋巴结转移灶表达谱的变化,发现一些与胃癌转移相关的基因和EST,为进一步寻找和克隆胃癌转移相关基因提供研究线索。     

Construction of cDNA library from iron-deficiency induced maize roots and screening and identification of iron-stress gene Fdr3

To isolate Fe-deficient related (Fdr) genes, an expression cDNA library of 4.5×105 pfu/μg has been constructed from maize roots in iron-stress. 6 clones have been screened from the cDNA library by differential hybridization screening. It is proved that an Fdr3 cDNA clone expressed stronger under iron-deficient condition than under iron-sufficient one by Northern blot and Western blot.     

Cloning of a down-regulated gene encoding small GTP binding protein in hybrid wheat

Previous studies showed that differential gene expression between wheathybrids and their parents was responsible for the heterosis. To provide an insight into the molecular basis of wheat heterosis, one cDNA, designated TaRab, was identified from the cDNA library of wheat seedling leaves. The sequence comparison in GenBank revealed that TaRab is homologous to a group of genes encoding Rab-GTP binding protein. Semi-quantitative RT-PCR analysis indicated that TaRab was expressed in all plant tissues examined, but at slightly higher level in leaves. Further analysis exhibited that TaRab displayed lower expression in hybrid than in its patents in both roots and leaves, which was in agreement with the original results of suppression subtractive hybridization. TaRab was located on chromosome 7B and C-7DS5-0.36 by in silico mapping. The relationship between differential expression of TaRab and the molecular basis of wheat heterosis was also discussed.     

Identification and characterization of a salt tolerance-responsive gene( AtGRP9) of Arabidopsis

Soil salinity is one of the important limiting factors for plant growth and development. A cDNA clone encoding a glycine-rich protein (designated AtGRP9) was identified from Arabidopsis by functional expression of the plant cDNA library in the fission yeast S. pombe. Yeast cells overexpressing AtGRP9 displayed significantly enhanced salt tolerance. Northern analysis showed that expression of AtGRP9 in Arabidopsis was induced by NaCl and plant hormone abscisic acid (ABA). These results suggest that AtGRP9 may be involved in the salt stress response in Arabidopsis.     

Construction of cDNA library from iron-deficiency induced maize roots and screening and identification of iron-stress geneFdr3

To isolate Fe-deficient related (Fdr) genes, an expression cDNA library of 4.5×10⁵ pfu/μg has been constructed from maize roots in iron-stress. 6 clones have been screened from the cDNA library by differential hybridization screening. It is proved that anFdr3 cDNA clone expressed stronger under iron-deficient condition than under iron-sufficient one by Northern blot and Western blot.     

SMART法构建蚕豆全植株cDNA文库

采用了一种简单而快速的全长cDNA文库构建法,即SMART法,并应用cDNA片段与质粒共转化大肠杆菌的方法,成功地构建了蚕豆全植株cDNA文库.     

杜洛克与梅山猪大卵泡消减文库的构建

为了鉴定杜洛克猪相对于梅山猪在大卵泡中高表达的基因,本研究应用抑制性消减杂交技术成功构建了以梅山大卵泡c DNA为driver,杜洛克大卵泡c DNA为tester的消减c DNA文库。结果显示:以G3PDH和β-actin为指标检测文库的消减效率为25,从该文库中获取了350个有效的阳性克隆,PCR检测插入片段主要分布在150-750 bp。克隆测序得到74个有效的EST序列,GO分析表明主要与细胞信号、细胞结构、代谢、细胞分化、基因/蛋白质合成、细胞组织防护等功能相关。利用q PCR技术验证了ELTD1、Grb14、SNRPE、CSDE1、ALDH18A1、e IF4E、BMPR-IB等基因在梅山和杜洛克大卵泡中的表达模式。结果发现在两猪种的大卵泡间存在显著性差异。本研究有助于揭示影响猪卵泡发育和生殖数量控制的分子基础。     

差异展示法鉴定GA3诱导的水稻差异表达的mRNA

赤霉素是植物生长发育过程中一类重要的调节激素，在水稻不育系上喷施合适浓度的ＧＡ３（赤霉素的一种）可以克服其包颈现象。运用反转录和聚合酶链式反应建立了一套旨在分离差异表达ｃＤＮＡ的差异展示方法。     

辣椒抗菌蛋白cDNA的分离与表达的初步分析

本研究从经辣椒疫霉侵染处理的辣椒叶片cDNA文库中分离获得了一个辣椒抗菌蛋白cDNA阳性克隆,其长度为255bp,含有长度为85个氨基酸的开放读码框架,与其它植物抗菌蛋白或几丁质酶有不同程度的同源性,推测为辣椒抗菌蛋白,命名为CansLTPS.cDNA-AFLP分析表明,CansLTPS的转录受UV-B照射和辣椒疫霉侵染的诱导,外源脱落酸(ABA)、乙烯(ETH)、水杨酸(SA)等可不同程度的诱导CansLTPS基因的转录,而MeJA处理对CansLTPS基因的转录表达影响不大,表明CansLTPS基因可应答生物和非生物逆境胁迫,其上游可能涉及ABA、ETH、SA等介入的信号传递途径.     

金标银染技术在表达文库筛选中的应用

以胶体多标记钙调素作为探针再辅以银染法（金标银染技术）,自玉米ｃＣＮＡ表达文库中筛迁钙调素结合蛋白。该探针保持钙调素的活性,特异性地与钙调素结合蛋白相结合,在胶体金标记的基础上进行银染,灵敏度获得显著提高（达ｎｇ级）。应用这一方法对玉米ＣＮＤＡ表达文库进行筛选获得了一个与探针特异结合的阳性克隆。以生物素标记的钙调素对该克隆表达的融合蛋白进行结合实验,结果表明该克隆编码的蛋白为一个钙调素结合蛋白。本     

生殖域中特异表达的新基因Rcet2的克隆

利用NCBI中的数字差异显示数据库首先电子克隆了Rcet2基因,然后从成年小鼠睾丸组织中克隆出Rcet2全长基因,序列分析显示：Rcet2基因全长cDNA为454 bp,含3个外显子,编码88个氨基酸残基,该蛋白含1个不完整的半胱氨酸蛋白酶抑制剂结构域,但缺少半胱氨酸蛋白酶抑制剂关键的作用位点,而这些位点对半胱氨酸蛋白水解酶的抑制作用是重要的.小鼠多组织RT-PCR结果显示,Rcet2在成年老鼠大脑、睾丸和附睾生殖域中特异表达,睾丸中的表达高于附睾和大脑,Rcet2与半胱氨酸蛋白酶抑制家族2的Cres亚家族具有相似的特征,结果显示Rcet2可能是Cres亚家族中的一个新成员.