产酸菌的分离纯化

着重研究粮食酒发酵中4类产酸菌的分离 ,其中己酸菌与丁酸菌同属梭状芽孢杆菌 ,为厌氧菌 ,醋酸菌为好氧菌 ,乳酸菌则微好氧 ,因此各自有不同的分离鉴定方法 ,其中己酸菌与丁酸菌分离方法相似 ,丁酸菌与乳酸菌的性能鉴定方法相似 ,其他则各有特色     

真核原核两界细胞融合子SEM形态

报道应用扫描电子显微镜（SEM）、测定跨界融合Fhhh细胞形态的结果。Fhhh由2株真菌真核细胞与1株细菌原核细胞的原生质体融合而成。2株真菌是黄孢原毛平革菌和酿酒酵母，1株细菌是从对苯二甲酸废水活性污泥中筛选获得的土细菌。3个亲株菌体细胞SEM的形态差异极为显，既不同于黄孢原毛平革菌与土细胞的首次跨界融合获得的Fhh，也不同于Fhh与酿酒酵母的2次跨界融合获得的Fhhh。经过350多代的繁殖传代。Fhhh仍然同时含有来自3亲株的基因DNA，具有分子遗传稳定性。研究结果表明，跨界原生质体融合是一种快速有效的构建基因工程菌的生物技术。     

白酒窖泥中乳酸菌分离鉴定及其发酵产挥发性风味物质比较

从白酒窖泥中分离得到11株乳酸菌,经16S rDNA基因序列同源性分析,鉴定为1株短乳杆菌、1株鼠李糖乳杆菌、2株干酪乳杆菌和7株铅黄肠球菌。 分析了11株菌MRS培养基发酵产乳酸性能,结果表明:乳酸产量与菌群生长呈正相关,鼠李糖乳杆菌L₉、干酪乳杆菌L₁₀与L₁₁发酵液乳酸含量较高,分别为15.74、15.58、14.74g/L。4株代表菌相同条件下发酵高粱培养液产挥发性风味组分,共有物质13种,包含了白酒中重要香气成分:乙酸、己酸、乙酸苯乙酯和苯乙醇,且乙酸、己酸相对含量较高。各菌产可挥发性组分差异明显,相对含量较高的化合物种类为:短乳杆菌L₅产烷烃类化合物(27.91%),铅黄肠球菌L₈产醇类化合物(43.14%),鼠李糖乳杆菌L₉产酯类(7.35%)、酮类(3.61%)和吡嗪类(3.3%)化合物,干酪乳杆菌L₁₁产酸类(27.98%)和芳香类(5.96%)化合物。仅有短乳杆菌L₅产四甲基吡嗪,短乳杆菌L₅和铅黄肠球菌L₈可明显产乙醇,鼠李糖乳杆菌L₉和干酪乳杆菌L₁₁产3-羟基-2-丁酮。这些物质对白酒风味和口感有重要影响。研究显示,窖泥中各种乳酸菌特征不一,对白酒酿造有不同影响。本研究旨在为进一步挖掘白酒酿造功能微生物、拓展乳酸菌的应用提供理论依据。     

谷氨酸高产菌TG-866的选育及发酵罐试验

以TG—3菌为亲株,经紫外线、硫酸二乙酯的复合诱变,定向选育抗单氟乙酸、耐高糖、耐高谷氨酸、以谷氨酸为唯一碳源不长和以琥珀酸为唯一碳源生长良好的突变株,选育出TG—866谷氨酸高产菌.在实验室的摇瓶试验中,连续4批达到平均产酸8.37%,平均转化率55.1%。在500L发酵罐上以淀粉水解糖为原料,取得了连续5批产酸7.5％以上,转化率50％以上的成绩。     

脂肪酸酰基辅酶A合成酶对酿酒酵母己酸乙酯合成的影响

己酸乙酯作为浓香型白酒的特征性风味物质,主要是在发酵后期由窖泥微生物产生的己酸与酵母产生的乙醇在大曲中酯化酶的作用下生成的,而酿酒主体微生物酿酒酵母(S. cerevisiae)的产己酸乙酯能力很低。本研究从酿酒酵母具有外源脂肪酸摄入能力入手,通过构建酿酒酵母脂肪酸酰基辅酶A合成酶基因(FAA1、FAA2、FAA3、FAA4、FAT1)敲除和过表达菌株,研究了脂肪酸酰基辅酶A合成酶对酿酒酵母摄入外源己酸生成己酰辅酶A进而合成己酸乙酯的影响。玉米浓醪发酵实验结果表明,α5-ΔFAA3菌株己酸乙酯产量提高了23.8%,过表达FAA4菌株己酸乙酯产量提高了32.1%,进而通过FAA3敲除同时过表达FAA4得到菌株α5-FAA4ΔFAA3,其己酸乙酯产量达到了17.34 mg/L,比出发菌α5提高了57.4%。该研究有效提高了酿酒酵母利用外源己酸合成己酸乙酯的能力,为通过酿酒酵母强化浓香型白酒中己酸乙酯的生成奠定了基础。     

对菌根分泌物强趋性产酸克氏菌突变体的筛选

体积分数0.01%和0.001%的桉树油悬浮液与苗期桉树—彩色豆马勃菌根、桉树根、彩色豆马勃菌Pisolithus tinnctorius分泌物对随机突变的产酸克氏菌Klebsilla oxytoca进行趋性筛选,得到1株较野生株对桉树—彩色豆马勃菌菌根分泌物趋向性强1~2倍的突变株菌株TR-M30-1。该菌株为建立桉树—彩色豆马勃菌—产酸克氏菌三元互利共生体系提供了材料。     

应用原生质体融合技术选育L-异亮氨酸生产菌

以黄色短杆菌WY10和ASL495为亲本菌株，分别摸索了其原生质体形成和再生的条件，并在此基础上，进行了原生质体融合试验，考察了PEG浓度、融合时间等条件对原生质体融合的影响；最后利用所确定的条件对两亲株进行了融合，筛选出目的融合子WYA09和WYA17，带有双亲株标记Met^-和Leu^-。经产酸验证后，产酸量没有大幅提高，但副产氨基酸(主要是亮氨酸)减少，对工业生产中分离提纯工作和下一步的筛选高产菌工作都大有益处。     

骆驼消化道中吡啶降解菌的分离筛选

以吡啶为唯一碳源、氮源,采用吡啶质量浓度每代递增(0.1,0.2,0.3,0.4,0.5g/L)的5代富集培养方法,从3头骆驼消化道分离筛选吡啶降解菌株,并通过气相色谱-质谱联用仪检测高效降解菌株对吡啶的降解能力.实验结果显示:实验共获得3个属22株吡啶降解菌,其中瘤胃7株,归属为芽孢杆菌属(Bacillus sp.)和产碱菌属(Alcaligenes sp.);肠道15株,归属为假单胞菌属(Pseudomonas sp.)、芽孢杆菌属和产碱菌属.筛选获得的菌株都可以较好地降解吡啶,其中1株产碱菌(KF641851)经96h,1株芽孢杆菌(KF641839)经108h能够将吡啶(0.4g/L)完全降解.研究显示骆驼消化道在有氧条件下可培养降解吡啶微生物种类不丰富,肠道菌种类和数量较瘤胃多,其优势降解菌归属为产碱菌属.研究提示骆驼消化道可能蕴藏着可降解吡啶的微生物,本研究可为研究动物消化道微生物降解有毒有害物质以及动物源微生物在生物治理中的应用提供依据.     

柴外线诱变原生质体已酸高产菌株的选育(Ⅰ)--出发菌株的分离与最佳产酸条件的探讨

采用“从生产中选育”的方法，从老窑泥中分离出产已酸的细菌，经纯化，最佳培养基的选择以及最佳产酸条件实验，筛选出最高已酸产生菌ＴＱ－４２９菌株，其产酸量为１０．０４ｍｇ／ｍＬ     

沼泽红假单胞菌高产辅酶Q10菌株的诱变选育研究

以沼泽红假单胞菌为出发菌株,通过紫外诱变和罗红霉素抗性筛选,以期获得辅酶Q10高产菌株.试验结果表明,紫外照射时间60-70s时可能达到最大正向突变概率.通过紫外诱变、罗红霉素初筛和发酵复筛,获得一株沼泽红假单胞菌突变株R-1,辅酶Q10产量达到0.021g/L,较出发菌株产量（0.018g/L）提高16％.经过6次传代培养,突变菌株产辅酶Q10产量稳定,可用于进一步研究.     

一株产谷氨酸菌株的复合诱变选育及突变株的生物学特性

对产谷氨酸的谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)进行以硫酸二乙酯(DES)和紫外线(UV)相结合的复合诱变,经选育得到一株高产突变株LG - 01.将其接种在含葡萄糖初始浓度为150.0 g/L,初始pH值为7.2～7.6的液体培养基中,于30℃下培养48 h后,其谷氨酸产量达到106.10 g/L,比原始菌株提高了25.74％(同等条件下,原始菌株的谷氨酸产量为84.38 g/L).对该突变株的产谷氨酸代谢特性进行研究,结果表明:其最适初始pH值为7.2,最佳培养温度为30 ℃,以葡萄糖为最佳碳源,其谷氨酸产量最高时相应的葡萄糖浓度为150.0 g/L,其某些生物学特性发生了改变,如延迟期变长,对数期的细胞生长能力较强,对底物的利用率比原始菌株约提高5％等.     

紫外线诱变原生质体己酸高产菌株的选育(Ⅱ)--原生质体的制备、诱变及选育己酸高产菌株

以ＴＱ－４２９ 菌株作为出发菌株，经紫外线处理原生质体，再生菌通过初筛复筛，选育出己酸高产菌株ＴＱ－５２０，其产酸量达到１２．１７ ｍ ｇ／ｍ Ｌ。     

一株谷氨酰胺合成酶高产菌株的酶学分析及其基因的克隆分析

对谷氨酰胺合成酶菌球形节杆菌(Arthrobacter globiformis)突变菌株Y3进行分析.其谷氨酰胺合成酶摇瓶发酵单位是原始菌株的2.81倍;最适反应温度为40℃;最适pH为6.5.以突变菌株和原始菌株基因组为模板,通过同源克隆策略,成功地获得了球形节杆菌谷氨酰胺合成酶基因gln片段.通过序列比对,突变菌株gln基因在第409 bp处产生T→C的碱基的突变,该处突变使酪氨酸(Tyr409)被组氨酸(His409)取代,该突变解决了谷氨酰胺合成酶腺苷酰基化问题,保证了其在高浓度铵盐条件下保持酶活性.     

发酵法生产京尼平菌株的筛选与培养

从土壤中筛选到一株产β-葡萄糖苷酶的菌株FYS-9,其发酵可将京尼平苷转化为京尼平。通过菌落形态特征、孢子和菌丝显微观察及18S rDNA基因序列分析,初步鉴定该菌株为泡盛曲霉（Aspergillus awamori）。以FYS-9为出发菌株,通过紫外线、原生质体诱变,选育得到一株高产β-葡萄糖苷酶的突变株70C-3,该突变株发酵产酶平均酶活力达到36.15IU/mL,比FYS-9提高39.4%。对突变株70C-3发酵转化京尼平苷条件的优化结果表明,在京尼平苷添加量1.5%,30℃、150r/min转化24h的条件下,京尼平苷的转化率达到97.7%,京尼平的产量可达8.5g/L。     

高效产絮突变体Enterobacter sp. W16-c的筛选及其产絮特性

采用原生质体融合-紫外诱变技术分离得到高效絮凝剂产生菌Enterobacter sp. W16-c,并对其产絮特性和影响因素进行分析。结果表明:Enterobacter sp. W16-c的絮凝能力比出发菌提高13.91%;突变菌株发酵产絮最适碳源为蔗糖,最适氮源为酵母膏,最佳初始发酵pH值为5～9;金属离子Fe2+、Na+对Enterobacter sp. W16-c的产絮效果有促进作用;在最佳发酵条件下所产絮凝剂的絮凝率可达96.2%;Enterobacter sp. W16-c的主要成分为多糖;Enterobacter sp. W16-c是一株产絮性能稳定的高效产絮突变菌株。     

枯草芽孢杆菌YYW-1蛋白酶缺陷株诱变与筛选

从羽毛废弃物中筛选出一株高效降解羽毛、产角蛋白酶和蛋白酶的革兰氏阳性芽孢杆菌,经鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus sublitis),命名为B.sublitisYYW-1。利用紫外线对菌株YYW-1进行诱变,筛选蛋白酶缺陷株,获得蛋白酶活性丧失的诱变株YYW-1-5,其蛋白酶活性残余22.7%,而角蛋白酶活性残余94.7%,没有明显的变化。     

降解秸秆的纤维素酶高产菌的选育

研究了可以用于降解农作物秸秆的纤维素酶高产菌的筛选方法,通过利用刚果红纤维素粉琼脂培养基以及滤纸条培养基进行初筛,然后以玉米秸秆为发酵培养基进行复筛,筛选到纤维素酶活力较高的1株真菌b3.通过进行紫外诱变得到诱变菌株,其纤维素分解能力进一步提高.     

α-亚麻酸特异性脂肪酶产生菌的复合诱变研究

将前期实验中经筛选、紫外诱变获得的α-亚麻酸特异性脂肪酶产生菌为诱变出发菌,通过紫外线、硫酸乙二酯和氯化锂的物理—化学复合诱变处理,经平板筛选和摇瓶发酵及发酵液中脂肪酶活性的测定,分离出具有产生更高活力α-亚麻酸特异性脂肪酶的菌株,测试结果显示,其酶活较单一紫外诱变菌种提高了31%.     

Vc二步发酵伴生菌苏云金芽孢杆菌的选育

苏云金芽孢杆菌经紫外线(UV)、亚硝基胍(NTG)及两者的复合诱变,获得1株高效伴生菌株UN-366.在pH 6.5~6.8的发酵培养基中与氧化葡萄糖酸杆菌混合发酵,UN-366的平均糖酸转化率提高了6.32%,古龙酸的质量浓度达到了83.7 g/L,经连续5代转接发酵实验,性状稳定.     

利用抗药性选育盐霉素高产菌株

采用紫外线诱变和紫外线复合氯化锂处理盐霉素生产菌株,利用含棕榈油的筛选平板,结合选育脂肪酶活力高的菌株,成功获得产量提高并适应棕榈油发酵的高产菌株Ae-4.棕榈油完全替代豆油摇瓶113 h发酵的产量是豆油发酵的88.7%(出发株为69.6%).进一步通过选育抗药性突变株获得了抗链霉素的高产突变株E4Lt-1(摇瓶发酵产量提高57.4%)和抗利福霉素的高产突变株Rift-1-2(摇瓶发酵产量提高44.9%).