哺乳动物细胞高效表达系统研究进展

哺乳动物细胞高效表达系统是生物制药工业中十分关键的环节,而表达载体和宿主细胞又是哺乳动物细胞表达系统的两个重要组成部分.文章较详细综述了通过目的基因整合位点的优化、增加目的基因拷贝数、提高目的基因的转录和翻译水平等构建哺乳动物细胞高效表达载体的研究进展.同时,为使宿主细胞更好地适应工业化大规模培养要求,对通过抗凋亡、细胞周期调控、糖基化、细胞增殖控制技术和多基因代谢等细胞代谢工程对其进行改造的研究进展也作了介绍.     

重组慢病毒对不同哺乳动物细胞基因转移及表达效率的研究

慢病毒是一种具有独特优点和巨大应用潜力的哺乳动物细胞基因转移载体,我们对慢病毒载体对不同哺乳动物细胞的基因转移及表达效率进行了平行比较研究.应用第三代重组慢病毒系统构建了携带CMV启动子-EGFP报告基因表达元件的重组慢病毒Lenti-EGFP,分别对多种不同哺乳动物细胞进行转导实验,在转导48 h后应用流式细胞仪检测报告基因在不同细胞株中的转移及表达效率.我们共使用了29种哺乳动物细胞株,包括14种人类组织细胞,5种猴组织细胞,9种鼠组织细胞,1种兔组织细胞.结果显示,重组慢病毒具有良好的基因转移能力,可有效进入多数哺乳动物细胞,对不同种属来源的细胞没有表现出特别的偏嗜性,但对贴壁培养细胞的基因转移效率明显高于对悬浮培养细胞.本研究为重组慢病毒系统的合理使用提供了基础.     

TMCO1蛋白2种不同亚型的表达分析

内质网钙离子通道蛋白TMCO1具有2个不同的亚型,分别表达239个氨基酸和188个氨基酸,而2种亚型在细胞中的表达还缺少研究论证.通过对氨基酸序列的分析,比较了2种不同亚型的结构域,并构建得到2种不同亚型的哺乳动物细胞表达载体.免疫荧光实验和蛋白质免疫印迹实验表明了2种蛋白亚型的亚细胞定位和表达,同时表明在哺乳动物细胞中,TMCO1的m RNA更倾向于在下游的起始密码子翻译.进一步通过RNA干扰实验发现敲低TMCO1的表达对细胞周期没有明显的影响.     

重组痘苗病毒对不同哺乳动物细胞株的感染效率及EGFP表达水平研究

研究重组痘苗病毒对不同哺乳动物细胞的感染效率及表达水平，可为痘苗病毒表达系统宿主细胞的正确选择提供依据．本研究利用重组绿色荧光蛋白基因的痘苗病毒WR—EGFP同时感染不同的哺乳动物细胞株，利用流式细胞仪检测EGFP的表达强度．共使用20种哺乳动物细胞株，其中10种人类组织细胞，2种猴组织细胞。8种小鼠组织细胞．结果表明，重组痘苗病毒wR-EGFP对鼠细胞系BHK21和人细胞系A-549的感染效率和表达效率最佳；整体看，痘苗病毒对多数灵长类动物细胞的感染效率和表达效率优于鼠细胞；对贴壁细胞的感染效率和表达效率明显优于悬浮细胞；但没有特别的组织偏嗜性。     

昆虫细胞中共表达人糖基转移酶对重组蛋白SEAP表达的影响

杆状病毒-昆虫细胞表达系统有表达量高及蛋白翻译后修饰较完善等特点,但与哺乳动物相比其缺乏几种关键的糖基转移酶.许多研究表明将哺乳动物的糖基转移酶基因转入昆虫细胞中,能使得昆虫细胞表达蛋白的修饰得到有效改善.本研究通过RT-PCR克隆了人Ⅱ型N-乙酰葡萄糖胺转移酶(β-1,2-N-acetylglucosaminyltransferaseⅡ)和Ⅰ型β-1,4-半乳糖基转移酶(β-1,4-galactosyltransferase)基因,并将它们分别插入重组杆状病毒上,获得了表达GnT2和β4GalT1的重组杆状病毒.以具有糖基化修饰位点的人分泌型碱性磷酸酶(Secreted Alkaline Phosphatase,SEAP)为对象,将表达糖基转移酶的重组杆状病毒和表达SEAP的重组杆状病毒共感染细胞,Western blot分析结果表明共感染时所表达的SEAP蛋白条带分子量明显大于其单独表达时的分子量.结果表明重组病毒共感染对杆状病毒-昆虫细胞表达的SEAP有修饰作用.     

鸡γ－干扰素表达载体的构建

采用PCR方法从peDNA-ChlFN-γ重组质粒中扩增得到鸡γ-干扰素基因.将目的基因定向克隆进能够在大肠杆菌、昆虫细胞和哺乳动物细胞中表达的pQE lxisystem载体内,转化大肠杆菌M15菌株.以IPTG诱导表达8xHis-tag 标签蛋白并对其进行纯化,通过SDS-PAGE检测方法表明,ChlFN-γ基因片段成功表达.     

草鱼生长激素基因在COS7细胞中转染表达的研究

应用RT-PCR技术克隆草鱼生长激素(gcGH)的cDNA,将此cDNA定向插入真核表达载体VR1020中,构建成重组真核表达质粒VgcGH.利用脂质体法使质粒VgcGH转染哺乳动物细胞COS7,对转染后的COS7细胞进行RT-PCR、ELISA和免疫荧光检测,分别在转录和翻译水平证实gcGH基因在COS7细胞中得到了持续和正确的转染表达.     

四环素调控表达系统调节EGFP和HBV前核心蛋白在哺乳动物细胞中表达

构建新型四环素调控的增强绿色荧光蛋白(EGFP)基因和乙肝病毒(HBV)前核心蛋白基因的表达载体,利用脂质体转染哺乳动物细胞.流式细胞术检测结果说明:应用此系统四环素可使EGFP在CHO细胞中的表达提高18倍,在SSMC-7721细胞与HEK293细胞中的表达分别提高5倍和接近2倍.并且,四环素可有效地诱导HBV的前核心蛋白基因在肝癌细胞系中的表达.     

RNA干扰及其在哺乳动物中的应用进展

通过双链RNA(dsRNA)在植物、线虫、果蝇等中进行RNA干扰(RNAi)已获得了很大的成功,但将其应用于哺乳动物却遇到了一定困难.随着各种转染方法的日益改进,以及各种小干扰RNAs(siRNAs)表达载体的出现和不断优化,它们在体内的转录产物(长约21～23nt的双链siRNAs)能特异性抑制哺乳动物基因的表达,使得RNAi应用于哺乳动物系统成为可能. RNAi正在改变以往人们研究哺乳动物细胞基因功能的方式.不仅如此,RNAi正在向病毒、癌症、基因药物研制等方向迅猛发展,文中对RNA干扰及其在哺乳动物中的应用进展进行了综述.     

人白血病抑制因子真核表达载体的构建及在哺乳动物细胞中的表达

应用RT-PCR方法从人子宫内膜组织总RNA扩增出hLIF的全长基因,然后将其克隆至pcDNA3上,成功构建了重组真核表达载体pcDNA3/hLIF.利用脂质体介导将这一表达载体导入COS-7细胞和CHO-K1细胞,分别获得了hLIF的瞬时表达和稳定表达,为进一步进行hLIF生物学功能研究和hLIF在哺乳动物细胞中的高表达研究奠定了基础.     

果蝇SCS'绝缘子对杆状病毒在哺乳动物细胞中介导基因表达的影响

将果蝇SCS'绝缘子以不同方向置于CMV启动子和报告基因egfp表达框的上下游,构建了包括对照病毒在内的9个重组杆状病毒.比较了这些病毒转导CHO,BHK和CNE细胞后报告基因表达的情况.结果显示:各株重组病毒的复制没有明显差异,但报告基因的表达水平有明显不同.当SCS'绝缘子位于表达框的上游,并与报告基因同向时,基因的表达水平显著提高.在CHO中,转导后24 h EGFP表达量比对照病毒提高近3倍,egfpmRNA水平也比对照病毒高4倍多.当在表达框上、下游各有一个SCS',且分别与CMV启动子方向-致和相反时,EGFP表达量降低到只有对照病毒的1/3,其mRNA水平也仅是对照病毒的1/6～1/5.丁酸钠和TSA等组蛋白脱乙酰基酶抑制剂处理可以使该病毒介导EGFP表达大幅上升,甚至超过对照病毒.这些结果揭示了杆状病毒在哺乳动物细胞介导基因表达时受到细胞染色质调节机制的影响,也为优化杆状病毒-哺乳动物细胞系基因表达系统提供了新的方法.     

哺乳动物细胞表达外源基因常用病毒载体的研究进展

文章概述了逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、慢病毒载体等四种常用哺乳动物细胞表达外源基因的病毒载体系统的来源、组成、特点及应用方面研究的进展.     

gD2 DNA疫苗诱导细胞免疫应答

用生殖器疱疹gD2 DNA疫苗pcDNA3-gD转染哺乳动物细胞COS-7,鉴定gD表达．再用其免疫BALB／c小鼠,测定脾细胞增殖、CTL细胞杀伤活性,以及CD4^ 和CD8^ 细胞群．结果表明：pcDNA3-gD能够在哺乳动物细胞COS-7中表达gD抗原,其免疫小鼠脾细胞增殖活性增加,CTL活性达37．69％,明显高于pcDNA3组和生理盐水组;CD4^ 占T细胞数量的33．38％,数量较pcDNA3组和生理盐水组显著增加．     

密码子优化的H5亚型流感病毒HA基因重组质粒在哺乳动物细胞中的高效表达及其免疫原性的研究

为了提高流感病毒血凝素(HA)基因的表达量及其免疫原性,按照哺乳动物偏爱密码子将A/Goose/HLJ/QFY/04(H5N1)流感病毒的血凝素基因进行优化改造,然后插入到真核表达载体pCI-neo中,构建了真核表达质粒pCI-opti-HA.将此质粒和含野生HA基因的真核表达质粒pCI-wt-HA分别转染Vero或293T细胞,通过免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)和蛋白免疫印迹(WB)实验比较HA蛋白的表达量.将两种重组质粒免疫Balb/c小鼠,比较两者诱导的抗体产生水平.三次免疫后两周用强毒攻击,通过体温和体重变化评价两种重组质粒的免疫保护效果.IP-MA和WB实验结果表明:密码子优化后,HA蛋白在哺乳动物细胞中的表达水平显著提高.酶联免疫吸附实验(ELISA)结果表明:小鼠免疫后密码子优化的重组质粒诱导的特异性抗体效价较高.攻毒试验结果表明:两种重组质粒均能够提供较好的保护.     

拟南芥高渗诱导Ca2+通道蛋白OSCA1的表达、结晶及晶体初步分析

高渗透胁引发植物细胞内发生复杂的生理反应,钙离子信号作为信号级联反应的第二信使,在胞质内的浓度变化对细胞行使正常生理功能十分关键.OSCA1是定位于细胞质膜上的高渗透压诱导离子通道,具有Ca2+ 通透性.利用 pEG BacMam高水平表达系统在哺乳动物细胞HEK293S GnTI-中过表达质膜蛋白AtOSCA1,通过去污剂DDM(n-Dodecyl-β-D-Maltopyranoside)纯化OSCA1样品,并在去污剂GDN(glyco-diosgenin)条件下结晶.采用正交梯度优化,添加剂筛选和去污剂筛选来获得更好的晶体衍射,对渗透胁迫离子通道的结构和功能分析研究具有重要意义.     

哺乳动物细胞线粒体基因组的转录及调控机制研究进展

目的:系统的归纳和总结近年来哺乳动物线粒体基因组转录及调控机制研究的进展,以期为哺乳动物和人类线粒体疾病及相关医学领域的研究提供参考依据。方法:从哺乳动物线粒体DNA(mtDNA)的结构和转录过程,转录基本元件和转录机制等方面,检索和整理近年来关于哺乳动物细胞线粒体基因组的转录及调控机制的文献并进行总结。结果:线粒体是哺乳动物细胞中普遍存在的具有独立基因组的半自主性细胞器,其主要功能是通过氧化磷酸化为细胞提供ATP,同时对于物质代谢、细胞周期调控、细胞分化和凋亡、细胞信号传递等生理过程发挥着重要作用。近年来对线粒体基因组的转录及其调控机制的研究已取得了一些突破和成果。结论:哺乳动物线粒体基因组的转录与调控机制的研究不仅有助于深入阐明和理解线粒体基因组的表达调控机制,而且也助于揭示临床线粒体病的发病机制。     

miR-34c在哺乳动物生殖发育过程中的功能探讨

miRNA是对基因转录后调控有重要作用的非编码RNA,其中miR-34c被证实在哺乳动物精卵都有表达,且在精子成熟及合子卵裂中有重要作用,其已有报道的作用靶点如Bcl-2、Fox O3a、Myc、TGIF2和Notch2多与细胞凋亡或与哺乳动物繁殖性状相关。本文拟就miR-34c在哺乳动物生殖发育中可能的生物学功能进行探讨。     

酿酒酵母CMK2在氧化胁迫应答中的作用

CMK2是酵母中和哺乳动物钙调蛋白激酶CaM kinasesⅡ同源的一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,具有重要调控作用.本文利用PCR方法扩增含内源启动子的CMK2基因序列,克隆到pRS316上并在C末端连接6个组氨酸标签,构建真核表达载体,转化不同酵母进行表达,并通过免疫印迹鉴定.发现氧化胁迫后细胞中CMK2发生磷酸化.生长实验结果显示cmk2缺失的细胞对氧化胁迫非常敏感,而Δcmk2中转入pRS316- cmk2-HIS6可以部分恢复Δcmk2细胞对双氧水的敏感性.表明CMK2参与细胞氧化胁迫应答途径,并发挥正调控作用.     

HIV-1病毒样颗粒真核表达系统的建立

目的 利用哺乳动物细胞表达HIV-1病毒样颗粒,为HIV-1病毒的生物学研究和进一步设计HIV-1中和优势表位预防性疫苗奠定基础.方法 以293T细胞作为宿主细胞,利用磷酸钙沉淀法将带有HIV-1病毒被膜蛋白gp160基因的pcDNA3.1/BaL gp160真核表达载体和带有HIV-1核心蛋白(gag)的pVRC3900真核表达载体共转染至293T细胞中,收集培养上清,经蔗糖不连续梯度离心,收集病毒样颗粒,经磷钨酸负染,透射电镜观察结果 .结果 以磷酸钙沉淀DNA转移技术,EGFP真核表达质粒为靶基因,293T细胞为宿主细胞,最佳转染效率达30%以上;将peDt NA3.1/BaL gp160(env)和pVRC3900(gag)真核表达质粒共转染,宿主细胞成功表达目的 蛋白,转染细胞培养上清经蔗糖密度梯度离心,电镜观察可见自行装配的HIV病毒样颗粒.结论 在真核细胞中表达HIV-1病毒样颗粒.     

重组慢病毒介导的NMD途径因子UPF1和SMG1可诱导干扰细胞株的构建

无义介导的mRNA降解途径是一个比较完善的异常mRNA的降解机制,结合在外显子拼接复合体上的多种蛋白决定NMD途径对异常转录物的识别和降解的启动,其中UPF1和SMG1发挥主要功能.UPF1是一个RNA解旋酶和RNA依赖的ATP酶;而SMG1具有磷脂酰肌醇激酶活性,负责UPF1的磷酸化.本研究构建了含有UPF1和SMG-1基因发夹结构的诱导开关基因表达干扰质粒.利用慢病毒介导转化哺乳动物细胞HEK293T细胞得到重组病毒,经鉴定后感染细胞AD_293,目的基因在细胞中得以高效表达.通过继代培养和单克隆化,得到强力霉素诱导干扰UPF1和SMG-1表达的稳定细胞株.