人类T型钙通道α1G和α1H亚单位基因在细胞增殖中的功能

已经发现T型钙通道的表达与细胞增殖关系密切，然而T型钙通道的表达是细胞增殖的原因还是结果有待进一步研究．利用过量表达人类T型钙通道α_1G和α_1H亚单位基因 （CACNA1G和CACNA1H） 的HEK-293细胞研究了这两种基因在细胞增殖中的直接作用．通过RT-PCR和标准全细胞膜片钳记录分别从mRNA转录水平和T型钙通道蛋白功能水平验证了α_1G和α_1H亚单位基因的过量表达；从生长曲线分析得到了细胞群体倍增时间，HEK_α1G ⁺细胞为（13.7±0.3）h，HEK_α1H ⁺细胞为（14.0±0.4）h，都短于对照HEK-293细胞的（22.1±1.1）h.流式细胞分析结果表明，在稳定转染细胞处于S期的细胞百分率比对照HEK-293细胞高，相反地处于G₁期的百分率比对照HEK-293细胞低．结果表明，T型钙通道α_1G和α_1H亚单位基因的过量表达都能显著促进细胞增殖，这一作用可以被T型钙通道特异性阻断剂mibefradil抑制．Western杂交结果提示了T型钙通道的过量表达是通过提高与细胞周期有关的蛋白质（CDK2，cyclin A和 cyclin E）的表达水平刺激了细胞周期的进程从而促进细胞增殖．     

人全长Notch1基因的克隆及其在HEK293 T细胞中的表达

目的:克隆人全长Notch1基因,构建人全长Notch1/p CMV6-Entry真核重组质粒并在HEK293 T细胞中进行瞬时表达.方法:采用PCR公知不认方法扩增人全长Notch1基因并克隆到真核表达载体p CMV6-Entry中并用限制性内切酶分析和DNA测序鉴定重组质粒.将该重组质粒转染HEK293 T细胞24h后,通过实时荧光定量PCR(q-PCR)和Western blot检测鉴定人全长Notch1的表达.结果:成功构建了人Notch1/p CMV6-Entry重组真核表达质粒,人全长Notch1基因在mRNA和蛋白水平上的表达显著高于p CMV6-Entry载体对照组和HEK293 T细胞对照组.结论:克隆获得人全长Notch1基因并验证在HEK293 T细胞中表达.     

牛泡沫病毒转录激活因子Borf1影响细胞周期相关基因的表达

Borf1蛋白是牛泡沫病毒编码的转录激活因子,可影响其自身及病毒结构基因的表达.但目前对Borf1在宿主细胞周期上的作用还未见研究报道.通过建立人胚肾293稳定表达Borf1的细胞系来研究其对宿主细胞的影响表明,在细胞内稳定表达Borf1可显著引发细胞在G1/G0的阻滞,并且降低S期细胞的比例.用半定量RT-PCR分析发现,Borf1可在mRNA水平下调周期蛋白cyclin A2,cyclin B1和cyclin E的表达.蛋白水平检测进一步核实这一结果.因此,Borf1通过影响周期相关蛋白表达,在G2-M及G1-S限制位点上发挥作用,进而引发细胞G1期阻抑.     

人DLL1真核表达质粒的构建及过表达DLL1抑制人口腔鳞癌细胞SCC15的增殖

目的:构建人全长DLL1基因真核表达质粒及过表达DLL1对人口腔鳞癌细胞增殖的影响.方法:PCR扩增人全长DLL1基因,酶切和测序鉴定后克隆至真核表达载体pCMV-Tag4并构建真核重组质粒DLL1/pC MVTag4,瞬时转染HEK293T细胞并通过实时荧光定量PCR(Q-PCR)和Western blot鉴定DLL1的表达;进一步检测DLL1在SCC15等3株人口腔鳞癌细胞中的表达;DLL1/pCMV-Tag4瞬时转染SCC15细胞,Q-PCR和Western blot检测过表达及MTT检测DLL1过表达对细胞SCC15增殖的影响.结果:真核重组质粒DLL1/pCMV-Tag4在HEK293T细胞中成功表达;DLL1在口腔鳞癌细胞中的表达高于正常口腔细胞;DLL1/pCMV-Tag4在SCC15细胞中获得表达且过表达DLL1抑制SCC15细胞的增殖.结论:人全长DLL1分子在HEK293T及SCC15细胞中获得表达,过表达DLL1抑制口腔鳞癌细胞SCC15的增殖.     

Cyclin E分子siRNA慢病毒载体的构建及其对骨肉瘤细胞系sosp9607的影响

设计筛选针对人cyclin E分子的siRNA序列,构建相应的siRNA慢病毒载体,检测其对骨肉瘤细胞系Sosp9607胞内cyclin E分子表达水平的影响.首先设计并合成4对siRNA双链寡聚核苷酸,与cyclin E分子真核表达载体共同转染293T细胞.挑选出最有效抑制cyclin E表达的序列,应用基因工程技术,将该序列连接于慢病毒载体pLKO.1中,构建携带针对目的基因cyclin E的siRNA慢病毒载体pLKO-CE.使用慢病毒包装质粒混合物和构建好的慢病毒载体共转染293T细胞,收获病毒上清,感染Sosp9607细胞系,对病毒感染后抑制cyclinE表达的效果进行检测.结果在4条针对cyclin E分子设计的siRNA序列中,siRNA-464最为有效的抑制了外源性cyclin E分子的表达;带有该序列的慢病毒载体pLKO-CE可以完全抑制Sosp9607细胞中天然分子的表达,引起Sosp9607细胞生物学行为的改变:G1期细胞增多,S期减少,细胞增殖受抑制.说明应用基因工程技术成功构建了针对cyclin E分子的RNA干扰慢病毒载体,可有效抑制骨肉瘤细胞cyclin E的表达,使肿瘤细胞增殖减缓,为深入研究针对cyclin E的基因治疗方案的临床前实验研究提供了实验证据和理论依据.     

正常脐血TCR Vα亚家族的分布和克隆性表达

目的:了解正常脐血中T细胞受体(TCR)Vα亚家族T细胞的分布和克隆性情况.方法:利用RT-PCR分别扩增10例正常脐血单个核细胞的TCR Vα29个亚家族基因,了解各Vα亚家族的利用情况.阳性的PCR产物进一步经荧光素标记和基因扫描分析产物的CDR3长度,了解T细胞的克隆性.9例健康成人外周血和T细胞株Jurkat作为对照.结果:正常脐血T细胞平均表达17.30±5.48个Vα亚家族,占全部家族的59.65%±18.89%,以Vα3,4,5,6,8,10,12,13,15,17,21和Vα25为多见,健康成人外周血T细胞则大部分表达Vα亚家族,Vα1,6和Vα13在脐血中的表达率高于健康成人对照组,而Vα14和Vα16的表达率则低于对照组.T细胞株Jurkat则仅表达Vα1亚家族.基因扫描显示10例脐血中有2例在Vα24和Vα28 T细胞出现寡克隆性,其余均为多克隆性.结论:脐血中TCR Vα亚家族T细胞分布存在倾斜性,绝大部分TCR Vα亚家族T细胞均呈多克隆性,极个别可出现寡克隆性.     

SARS-CoV-2 Spike蛋白诱导人肾上皮细胞周期阻滞及细胞凋亡

目的:初步探讨慢病毒载体介导的SARS-CoV-2 Spike蛋白(简称S蛋白)过表达对人肾上皮细胞生长的影响及相关机制.方法:构建S蛋白慢病毒的表达载体pLV-CMV-S-IRES-eGFP,并将此载体包装成慢病毒颗粒(LV-S).利用重组的慢病毒LV-S感染人肾小管上皮细胞(HK-2)及HEK293T细胞(293T),利用EdU测定其细胞活力,利用流式细胞术测定其细胞周期和细胞凋亡,并通过Western blot检测相关蛋白表达水平.结果:重组慢病毒载体感染HK-2及293T细胞24 h均能观察到eGFP表达,细胞活力检测结果显示S蛋白过表达可以使HK-2及293T细胞的细胞活力下降.流式细胞术结果显示S蛋白诱导细胞周期阻滞在G2/M期,同时S蛋白通过激活Caspase-3和Caspase-9诱导细胞发生凋亡.此外,SARS-CoV-2 S蛋白过表达可以增强HK-2及293T细胞自噬相关蛋白的表达.结论:SARS-CoV-2 S蛋白可能通过诱导肾上皮细胞发生周期阻滞和凋亡,介导细胞损伤.     

H13对HT-29细胞周期和caspase-3蛋白表达的影响

探讨新型Topo I抑制剂H13对体外培养的人结肠癌细胞HT-29细胞周期和caspase-3表达的影响.以人结肠癌细胞HT-29为研究对象,PI染色,流式细胞仪检测H13处理48 h后细胞周期的分布;Western Blot法检测H13处理48 h后caspase-3表达的变化.2.5和5 g/mL H13处理的HT-29处理48 h后,G1期细胞百分率下降,S期细胞百分率上升,并且有剂量依赖性;2.5,5,10 g/mL H13处理的HT-29处理48 h后,caspase-3蛋白表达升高.H13对诱导HT-29细胞周期阻滞于S期,其机制可能与其上调caspase-3表达有关.     

pEGFP-C1-MCH真核表达载体的构建及其在HEK293 细胞系中的表达

目的:构建pEGFP-C1-MCH真核表达载体,并将其转染入HEK293细胞中,筛选阳性细胞克隆,为研究MCH基因在能量代谢中的功能及机制提供细胞模型.方法:提取脑组织总RNA,反转录为cDNA,参照Genbank中提供的序列设计引物扩增MCH基因全长.再将该基因全长cDNA克隆至质粒pEGFP-C1,经菌落PCR筛选及双酶切和DNA测序鉴定,成功构建了含有目的基因MCH的重组质粒pEGFP-C1-MCH.并利用脂质体2000介导其转染HEK293细胞,用荧光显微镜和RT-PCR检测EGFP和MCH在细胞中的表达.结果:克隆的pEGFP-C1-MCH质粒序列中的MCH与Gen Bank相符;细胞转染72 h后,转染成功的细胞在荧光显微镜下表达较强的绿色荧光,MCH基因稳定表达.结论:pEGFP-C1-MCH真核表达载体的构建及其在HEK293细胞中的稳定表达,为研究MCH基因在能量代谢中的功能及作用机制提供了实验模型.     

汉坦病毒G1S0.7嵌合基因真核载体的构建及表达

构建含汉坦病毒嵌合基因G1S0.7的真核重组质粒,并在真核细胞中有效表达.从本室前期构建并经测序的重组质粒pShuttle-G1S0.7上双酶切回收得到片段G1S0.7后,克隆入真核表达载体pVAX,并将其通过脂质体介导转染HEK293细胞,表达产物用ELISA和Western-blot进行鉴定.酶切鉴定结果表明,成功构建了含汉坦病毒嵌合基因G1S0.7的重组质粒pVAX-G1S0.7; ELISA检测结果和Western-blot结果显示,汉坦病毒G1S0.7嵌合基因在HEK293细胞中得到了表达,所表达的融合蛋白分子量约90kD,与预期大小一致,并且表达产物可与抗汉坦病毒NP mAb特异性结合.说明所构建的表达载体可在真核细胞中表达出与汉坦病毒抗体有特异性结合活性的融合蛋白,为下一步基因免疫及进一步筛选HFRS基因疫苗候选组分提供实验依据.     

rhNDPK-α蛋白对正常小鼠脾细胞增殖和细胞周期的影响

目的:探讨rhNDPK-α蛋白对正常小鼠脾细胞增殖和细胞周期的影响.方法:不同质量浓度的rhNDPK-α蛋白体外作用于脾细胞,通过MTT法和流式细胞术测其增殖和细胞周期.结果:rhNDPK-α蛋白的质量浓度为10～250μg·mL-1时对脾细胞的自发增殖反应有明显的促进作用;10～50μg·mL-1时对PHA诱导的脾细胞增殖有明显的协同作用;50μg·mL-1rhNDPK-α蛋白作用小鼠脾细胞24h后,G0/G1和G2-M期细胞比例明显增加,而S期比例显著减少.结论:rhNDPK-α蛋白可促进脾细胞的存活,很可能通过调控细胞周期而参与细胞的生长调节.     

白杨素对小鼠T细胞体外活化、增殖和细胞周期的影响

目的:研究白杨素(CR)对刀豆蛋白A(ConA)刺激的小鼠T细胞体外活化、增殖和细胞周期的影响,初步探讨其免疫调节作用机制。方法:利用荧光标记的单克隆抗体染色结合流式细胞术,检测小鼠活化T细胞CD69的表达情况;用羧基荧光素已酰已酸(CFDA-SE)染色结合流式细胞术,分析T细胞增殖相关指数;用碘化丙锭(PI)染色分析细胞周期分布。结果:加入终浓度为5、25、50μmol/L的CR后,活化T细胞CD69的表达率由ConA对照组的(85.12±1.07)%,分别降低为(78.42±1.82)%、(66.24±1.43)%和(53.09±1.77)%;72 h的T细胞增殖指数由ConA对照组的2.29±0.14分别降至1.91±0.02、1.47±0.03和1.14±0.01;对细胞周期的影响表现为:随着CR浓度升高,处于G0/G1期的细胞增加,S期细胞减少,25μmol/L时,G2/M期细胞也减少。结论:CR能有效抑制小鼠T细胞的体外活化和增殖,阻滞活化细胞从G1期进入S期,是一种潜在的免疫抑制剂。     

磷酸钙法将MMP-2，MMP-3双基因干扰载体转入HEK293T细胞的效率观察

检测用磷酸钙法能否将修饰后用于沉默MMP-2,MMP-3基因的慢病毒载体有效地转入到HEK293T细胞。利用磷酸钙法,MMP-2,MMP-3双基因干扰载体（MMP组）与对照质粒（对照组）被分别转染HEK293T细胞,在转染后的第24,48及72h,通过计算绿色荧光蛋白（GFP）阳性细胞数的百分比来判断转染效率。转染24h后,两组细胞均生长状况良好,荧光显微镜下观察,已有大量绿色荧光出现,计算MMP组转染效率为（91．5±6．2）％,对照组转染效率为（80．3±4．7）％;转染后48—72h,两组感染效率均未见明显下降。与对照相比,插入了MMP-2,MMP-3 shRNA模板序列的慢病毒载体没有降低磷酸钙法转染HEK293T细胞效率,反而有所增高。     

Spindlin 1编码的蛋白质定位于细胞核并使NIH3T3细胞发生恶性转化

研究了卵巢癌中高表达的新基因spindlin1的亚细胞定位及其对小鼠NIH3T3细胞生物学行为的影响, 并探讨了人spindlin1基因的生物学功能. 采用脂质体转染法将构建的融合蛋白表达载体pEGFP-N1/ pEGFP-N1-spindlin1瞬时转染COS-7细胞,观察spindlin1基因的亚细胞定位;同时稳定转染NIH3T3细胞,经G418抗性筛选后,用RT-PCR筛选并鉴定表达spindlin1的稳定细胞株;通过细胞增殖活性、流式细胞检测、软琼脂克隆形成、迁移实验及裸鼠成瘤等对转染细胞的生物学行为进行检测. 结果表明,spindlin1定位于胞核;并促进NIH3T3细胞的增殖,使其处于G2/M期的细胞比例显著增加;同时证实过表达spindlin1的NIH3T3细胞不仅具明显的克隆形成及迁移能力,而且能使裸鼠成瘤. 由此我们得出结论:spindlin1基因过表达可促使NIH3T3细胞发生恶性转化,提示spindlin1可能是一种与肿瘤形成相关的原癌基因.     

蛋白激酶C对转录延伸正调节因子b(P-TEFb)的影响

本文探讨了PKC的4种亚型α、βⅡ、γ和λ对PTEFb各蛋白组分的表达影响.成功构建了带有HA标签的pcDNA3.1 PKC的各亚型真核表达载体,并转染HEK293细胞株,用Western bolt检测其表达情况,发现这四种PKC亚型在细胞中表达良好。将PKCβⅡ或者PKC λ转染进入HEK293细胞株 ,发现其可使CDK9和Cyclin T蛋白表达量升高;但在细胞中高表达PKCα和PKCγ,对P-TEFb各组分表达量没有影响.表明PKC可通过提高P-TEFb的组分表达量,从而上调某些基因的表达.     

研究G偶联蛋白受体G2A功能特定细胞模型的建立

通过克隆人质子感知受体G2A基因、构建G2A基因的表达载体并瞬时转染293T细胞,建立G2A受体调控机理及其功能研究的转基因细胞模型,并检测G2A介导的细胞应答.从人脐静脉内皮细胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells,HUVECs)中提取总RNA,反转录为cDNA为模板,设计一对针对G2A基因的引物,克隆不含终止密码子的G2A基因并亚克隆到pMD-19T载体.将鉴定出的阳性质粒和表达载体pEGFP-N3用HindⅢ和BamHⅠ双酶切回收后连接获得阳性重组质粒pEGFP-N3-G2A,并测序鉴定;重组载体以lipofectamine2000介导转染293T细胞.Real time PCR法检测外源基因在293T细胞中的表达;ELISA检测转染与未转染G2A基因的细胞内三磷酸肌醇(Inositol-1,4,5-triphosphosate,IP3)的含量.测序和酶切证实了克隆到G2A基因并获得pEGFP-N3-G2A表达载体;荧光成像与Real time PCR证实在293T细胞中过表达G2A基因;ELISA检测在酸性刺激下转基因细胞内IP3含量(应答)明显升高,而脂质配体LPC则抑制其IP3的积累,本研究为G2A受体介导信号机制及其功能研究提供一个真核细胞模型.     

重组慢病毒介导的NMD途径因子UPF1和SMG1可诱导干扰细胞株的构建

无义介导的mRNA降解途径是一个比较完善的异常mRNA的降解机制,结合在外显子拼接复合体上的多种蛋白决定NMD途径对异常转录物的识别和降解的启动,其中UPF1和SMG1发挥主要功能.UPF1是一个RNA解旋酶和RNA依赖的ATP酶;而SMG1具有磷脂酰肌醇激酶活性,负责UPF1的磷酸化.本研究构建了含有UPF1和SMG-1基因发夹结构的诱导开关基因表达干扰质粒.利用慢病毒介导转化哺乳动物细胞HEK293T细胞得到重组病毒,经鉴定后感染细胞AD_293,目的基因在细胞中得以高效表达.通过继代培养和单克隆化,得到强力霉素诱导干扰UPF1和SMG-1表达的稳定细胞株.     

Cyclopamine对牛脂肪间充质干细胞细胞周期相关基因表达的影响

间充质干细胞具有自我更新和多向分化的能力,能在体外诱导成脂细胞、软骨细胞、骨细胞和肌细胞等.脂肪间充质干细胞(adipose mesenchymal stem cells,AMSCs)取材方便,来源较为丰富.本试验利用hedgehog信号通路的特异性抑制剂cyclopamine(CPA)对牛AMSCs的细胞分裂周期机制做了初步探讨.先用血清饥饿法使细胞处于G0/G1期,再经CPA处理,检测不同处理时间的细胞周期蛋白cyclinA、cyclinD和cyclinE的表达情况.经CPA处理的细胞,其周期蛋白cyclin A、cyclin D和cyclin E的表达水平显著低于对照组.表明,CPA通过抑制细胞周期蛋白基因的表达从而抑制了细胞的增殖.     

脑心肌炎病毒pCMV-HA-VP2表达载体的构建及在HEK293细胞中的表达

目的:构建脑心肌炎病毒(Encephalomyocarditis Virus,EMCV)衣壳蛋白VP2基因的真核表达载体pCMV-HA-VP2,并在HEK293细胞中表达.方法:提取EMCV的总RNA,RT-PCR扩增VP2基因,酶切后构建带HA标签的真核表达质粒pCMV-HA-VP2,运用脂质体介导法将其转染至HEK293细胞中,分别进行过表达检测、Westernblotting分析及IFA检测来验证VP2基因的转录及表达情况.结果:重组表达载体pCMV-HA-VP2构建成功,转染至HEK293细胞中,VP2蛋白和HA标签融合表达成功.结论:EMCV衣壳蛋白VP2基因的真核表达载体pCMV-HA-VP2在HEK293细胞中的成功表达,为EMCV衣壳蛋白的功能研究提供理想的实验材料,同时也为EMCV感染机制及其受体研究奠定基础.     

CML相关抗原诱导正常T细胞增殖的TCR Vα基因选用和克隆性研究

目的：了解慢性粒细胞白血病（CML）相关抗原体外诱导T细胞的TCR Vα亚家族限制性表达和克隆性增殖情况。方法：采用混合淋巴细胞和肿瘤细胞培养（MLTC）方法，利用CML细胞、K562细胞和bcr3-abl2多肽体外诱导脐血或正常人的T细胞增殖，用RT-PCR和基因扫描分析MLTC后T细胞的29个TCRVtx亚家族基因的互补决定区（CDR3），了解各Vd亚家族的限制性表达情况和T细胞克隆性增殖特点。结果：经CML抗原刺激后增殖的T细胞仅表达部分Vd谱系基因（1—14个亚家族），两例脐血均出现有Vα3亚家族T细胞克隆性增殖趋势；正常人外周血出现寡克隆增殖的Va5、Vα14亚家族T细胞。结论：CML相关抗原体外诱导脐血和正常人T细胞出现抗原相关的TCR Vα优势利用和克隆性增殖。