高山被孢霉Δ~6-脂肪酸延长酶基因在巴斯德毕赤酵母中的表达

长链多不饱和脂肪酸花生四烯酸(ARA,C20:4n-6)是合成生物活性物质类二十碳烷酸的初级底物神经组织的重要组成成分.Δ6-脂肪酸延长酶是花生四烯酸Δ6-合成途径的关键酶之一.根据已经报道的Δ6-脂酸延长酶基因序列设计引物,分别从产花生四烯酸的丝状真菌高山被孢霉ATCC16266菌株基因组和cDNA扩增得到该序列.经序列分析后,将来源于cDNA的序列连接到毕赤酵母表达载体pPIC3.5K上,得到重组质PIC3.5K-ELO.用电击转化法将重组载体pPIC3.5K-ELO转化到巴斯德毕赤酵母GS115中,在缺省培养基筛选得到毕赤酵母转化菌株pPIC3.5K-ELO.在适宜的培养条件下,添加外源底物γ-亚麻酸(GLA)和诱导物醇诱导基因表达.气相色谱分析表明该基因在毕赤酵母中得到了表达,底物GLA转化为二高γ-亚麻酸GLA),转化效率为28.91%.对Δ6-脂肪酸延长酶进行跨膜分析,表明该蛋白为具有7个跨膜域的膜结合蛋白.     

脂肪酸碳链延长酶与脱饱和酶在酿酒酵母中共表达

为了利用转基因技术在酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae中生产二十二碳六烯酸(DHA,22∶6Δ4,7,10,13,16,19n-3),构建了同时含C20-Δ5脂肪酸碳链延长酶(TFD5)和C22-Δ4脂肪酸碳链脱饱和酶(FAD4)基因的共表达质粒pYTFD5-FAD4.该质粒是通过基因重组的方法,使脂肪酸碳链延长酶与脱饱和酶基因置于各自启动子和终止子下获得的.共表达质粒pYTFD5-FAD4转化酿酒酵母所得到基因工程菌,在添加终质量分数为2%的半乳糖,终体积分数为1%的NP-40和0.3 mmol/L的底物二十碳五烯酸(EPA,20∶5Δ5,8,11,14,17n-3)下进行诱导,可直接转化二十碳五烯酸(EPA,20∶5Δ5,8,11,14,17n-3)生成二十二碳五烯酸(DPA,22∶5Δ4,7,10,13,16n-3)和二十二碳六烯酸(DHA,22∶6Δ4,7,10,13,16,19n-3).     

毕赤酵母△~9-脂肪酸脱氢酶基因的克隆和表达

根据真菌Δ9-脂肪酸脱氢酶保守的氨基酸序列设计简并引物进行PCR,获得一个741 bp的毕赤酵母cDNA片段,再根据获得的部分序列设计基因特异性引物,通过cDNA末端扩增技术(RACE)获得该cDNA的3′和5′序列,从而得到全长为1 689 bp的cDNA序列.序列分析结果表明,该序列具有一个长度为1 194 b p、编码397个氨基酸的开放阅读框(PPD9).与报道的Δ9-脂肪酸脱氢酶一样,推测的氨基酸序列具有膜整合脂肪酸脱氢酶特异性的3个组氨酸保守区和疏水结构,在其氨基酸序列的C-末端具有类似于细胞色素b5的血红素结合区.该序列为一个新的编码Δ9-脂肪酸脱氢酶的基因,为了验证其功能,把开放阅读框序列PPD9亚克隆到表达载体pYES 2.0,构建重组表达载体pYPPD9,并转化到酿酒酵母的Δ9-脂肪酸脱氢酶缺陷型菌株DTY-11A中进行表达。通过平板互补实验结果表明,该序列在酿酒酵母中获得表达。所编码的蛋白具有Δ9-脂肪酸脱氢酶活性,能弥补DTY-11A中由于Δ9-脂肪酸脱氢酶的缺失而引起的致死性突变。     

红冬孢酵母Δ~(12)-脂肪酸脱氢酶基因的克隆和表达

Δ~(12)-脂肪酸脱氢酶是多不饱和脂肪酸合成的关键酶.参考已知的Δ~(12)-脂肪酸脱氢酶基因序列设计特异性引物,通过PCR扩增从红冬孢酵母YM25235中获得了全长为1 341 bp的一个cDNA序列.序列分析表明,该序列具有一个编码446个氨基酸、相对分子质量为50.6 ku的完整开放阅读框,所编码的氨基酸序列与Δ~(12)-脂肪酸脱氢酶相似性最高但并不相同,而且也具有Δ~(12)-脂肪酸脱氢酶特异性的3个组氨酸保守区,表明该序列为一个新的编码Δ~(12)-脂肪酸脱氢酶的基因.为了验证功能,将该基因序列克隆到表达载体pYES3/CT中,构建重组质粒pY3RKD12,并转化到酿酒酵母的缺陷型菌株INVSCI中进行异源表达.通过脂肪酸气相色谱(GC)分析表明,在pY3RKD12转化的酵母细胞总脂肪酸中出现一个保留时间和亚油酸甲酯标准品相同的新峰,其含量占酵母总脂肪酸的3.76%,但在pYES3/CT转化的酵母细胞总脂肪酸中没有检测到.这些结果证明所克隆的序列是一个新的Δ~(12)-脂肪酸脱氢酶基因,其表达的蛋白质可催化油酸合成亚油酸.     

Δ^6-脂肪酸脱氢酶的系统进化分析

将已报道的Δ6-脂肪酸脱氢酶基因所编码的氨基酸序列进行比较,推断它们的系统进化关系.分析结果显示的Δ6-脂肪酸脱氢酶氨基酸序列都具有3个高度保守的组氨酸富集区,表明它们具有共同起源,并分为原核、动物、高等植物和低等真核4个类型.推测原核类型的Δ6-脂肪酸脱氢酶是所有Δ6-脂肪酸脱氢酶的共同祖先,真核类型的Δ6-脂肪酸脱氢酶在后来的进化中形成更具选择优势的细胞色素b5融合蛋白.动物类型的Δ6-脂肪酸脱氢酶处于真核类Δ6-脂肪酸脱氢酶的最基础分枝,其中鱼类的Δ6-脂肪酸脱氢酶可能是动物类型的Δ6-脂肪酸脱氢酶通过序列改变向Δ5-脂肪酸脱氢酶进化的中间过度形式.高等植物和真菌类型的Δ6-脂肪酸脱氢酶存在着共同起源,藻类和苔藓可能在高等植物和真菌类Δ6-脂肪酸脱氢酶的进化关系上扮演着重要的角色.线虫的Δ6-脂肪酸脱氢酶作为一个独立而且最基础的分枝位于低等真核单系组中,它可能是一种趋同进化的结果.     

深黄被孢霉△6-脂肪酸脱氢酶基因敲除及鉴定

以产油丝状真菌深黄被孢霉M6-22(Mortierella isabellina 6-22)为出发菌株,利用亚硝基胍诱变技术筛选到一株对潮霉素药物敏感的菌株Mortierella isabellina 6-22-4,同时构建了含有潮霉素抗性基因表达单元和深黄被孢霉△6-脂肪酸脱氢酶基因5'与3'端部分同源序列的重组质粒PD4MI6,用于对深黄被孢霉△6-脂肪酸脱氢酶基鼠的敲除.通过PEG/CaCl2介导的原生质体转化法,将质粒PD4MI6转化入深黄被孢霉M6-22-4菌株.转化子经潮毒素抗性选择平板筛选、分子检测获得了一个△6-脂肪酸脱氢酶基因缺失的突变株Mut6.气相色谱分析结果显示,该突变株γ-亚麻酸特征峰消失,相应地亚油酸产量显著增加.培养结果表明该突变株的菌落形态、颜色及生长状况与出发菌株M6-22或M6-22-4相比均有显著改变.     

深黄被孢霉Δ12-脂肪酸脱氢酶基因RNAi表达载体的构建

 深黄被孢霉是国内研究生产γ-亚麻酸(γ-linolenic acid,GLA)和花生四烯酸(Arachidonic acid,AA)等多不饱和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acid,PUFA)的主要产油丝状真菌.前期的实验结果表明,深黄被孢霉M6-22具有潮霉素抗性,而且目前也没有关于深黄被孢霉营养缺陷型菌株的报道,限制了一些基于深黄被孢霉菌株进行遗传操作的研究.研究以红色荧光蛋白DsRED基因作为报告基因,构建能同时用于丝状真菌外源基因和RNAi表达载体pS-DsRED.通过PEG/CaCl₂原生质体转化法将pS-DsRED导入深黄被孢霉M6-22中进行表达,成功获得产粉红色的阳性菌落,并在此基础上构建了深黄被孢霉Δ¹²-脂肪酸脱氢酶基因RNAi表达质粒pSREDMID12RNAi,为下一步目的基因的敲除和基因功能分析奠定了基础.     

少根根霉△12-脂肪酸脱氢酶基因在毕赤酵母中的表达

为探讨采用转基因的方法将毕赤酵母改造为产多不饱和脂肪酸菌株的可行性,将来自于丝状真菌少根根霉的△12-脂肪酸脱氢酶基因与毕赤酵母的胞内表达载体pPIC3.5K连接构建了重组表达载体pPICRAD12,经Sac I线性化后电击转化毕赤酵母菌株GS115获得转基因酵母菌株PICRAD12.PCR鉴定结果表明,目的基因已经整合到毕赤酵母基因组中.经甲醇诱导表达后,通过气相色谱和气相色谱和质谱连用的方法分析转基因毕赤酵母的脂肪酸成分表明,转基因毕赤酵母的亚油酸含量增加了4.5%,说明了可以通过增加△12-脂肪酸脱氢酶基因的拷贝数或者使用强启动子的方法来增加亚油酸的含量,为将毕赤酵母改造为产多不饱和脂肪酸的基因工程菌株进行了有意义的探索.     

△6-脂肪酸脱氢酶的系统进化分析

将已报道的△6-脂肪酸脱氢酶基因所编码的氨基酸序列进行比较,推断它们的系统进化关系.分析结果显示的△6-脂肪酸脱氢酶氨基酸序列都具有3个高度保守的组氨酸富集区,表明它们具有共同起源,并分为原核、动物、高等植物和低等真核4个类型.推测原核类型的△6-脂肪酸脱氢酶是所有△6-脂肪酸脱氢酶的共同祖先,真核类型的△6-脂肪酸脱氢酶在后来的进化中形成更具选择优势的细胞色素b5融合蛋白.动物类型的△6-脂肪酸脱氢酶处于真核类△6-脂肪酸脱氢酶的最基础分枝,其中鱼类的△6-脂肪酸脱氢酶可能是动物类型的△6-脂肪酸脱氢酶通过序列改变向△5-脂肪酸脱氢酶进化的中间过度形式.高等植物和真菌类型的△6-脂肪酸脱氢酶存在着共同起源,藻类和苔藓可能在高等植物和真菌类△6-脂肪酸脱氢酶的进化关系上扮演着重要的角色.线虫的△6-脂肪酸脱氢酶作为一个独立而且最基础的分枝位于低等真核单系组中,它可能是一种趋同进化的结果.     

豆科4种野生植物种子油脂中脂肪酸组成的测定

采用毛细管气相色谱法，对青海境内4种豆科野生植物种子油脂中脂肪酸成分进行测定，鉴定出14种脂肪酸，主要由十八碳不饱和脂肪酸的油酸、亚油酸、亚麻酸组成，其中人体必需脂肪酸含量高于65％，α-亚麻酸含量高于25％。     

mRNA差异显示技术研究低温条件下深黄被孢霉基因的表达差异

mRNA差异显示技术已经广泛应用于研究植物、动物和微生物在各种环境条件下基因的差异表达研究.研究以15℃和30℃培养的深黄被孢霉M6-22菌体为材料,利用mRNA差异显示技术研究两种培养条件下基因的表达差异.经实时荧光定量PCR验证,共获得7条差异片段,相似性搜索结果表明它们是6-磷酸葡萄糖异构酶、单糖核苷酸转运蛋白、Ras1鸟苷酸转移因子、依赖于NAD的苹果酸脱氢酶、Δ12-脂肪酸脱氢酶、CLK4关联的丝氨酸/精氨酸丰富蛋白和假定蛋白,涉及糖酵解、蛋白质修饰、信号传导、脂肪酸合成和mRNA加工等生命过程,表明深黄被孢霉M6-22低温适应性是多种途径协同调控的结果.     

FAE1启动子的克隆和转γ-TMT基因大豆的获得

脂肪酸链延长酶组分1(FAE1)是广泛存在于植物中催化脂肪酸碳链延长的酮脂酰CoA合成酶,该反应是脂肪酸碳链延长的限速步骤,在油料种子胚中特异性表达.以拟南芥基因组DNA为模板,设计引物,扩增到该基因的启动子片段.序列分析表明,该片段长度为943 bp,与GenBank注册序列AF355982达99.5%同源,并含有与之完全相同的种子特异性表达元件,据此认定它具有种子特异性启动活性.将其与甘蓝型油菜γ-生育酚甲基转移酶(γ-TMT)基因连接,构建成表达载体pFAE1-TMT,通过农杆菌介导的方法转化大豆胚尖,获得28株卡那霉素抗性筛选植株,进一步PCR检测获得2株转γ-TMT基因植株.     

表达KstD重组大肠杆菌转化甾体化合物的条件优化

3-甾酮-Δ1脱氢酶是胆固醇降解的关键酶之一,能脱去甾酮C1,2位上的氢原子,形成双键,在甾体药物的合成过程中具有重要的作用.以异源表达3-甾酮-Δ1脱氢酶的重组大肠杆菌为材料,对其培养条件以及黄体酮转化条件进行了优化,实现了甾体化合物的高效转化.首先,对表达3-甾酮-Δ1脱氢酶基因的重组大肠杆菌的培养条件对黄体酮脱氢的影响进行了研究,结果表明,IPTG浓度为0.05mmol/L,在28℃,pH值为7的条件下诱导培养5h,获得最高转化活性的细胞;其次,以优化条件下获得的菌体为催化剂,研究了各种转化条件对底物转化的影响,结果表明,以甲基-β-环糊精为助溶剂,转化温度为37℃,底物质量浓度为6g/L,菌体量为100g/L,pH为7.0,黄体酮的转化率达到99%以上,比优化前的产量提高了2倍,转化率提高近1倍.     

多不饱和脂肪酸与红冬孢酵母低温适应性的关系研究

以一株产油酵母——红冬孢酵母(Rhodosporidium kratochvilovae)YM25235作为出发菌株,分析其低温生长适应性与细胞膜流动性、膜脂脂肪酸含量的变化和多不饱和脂肪酸合成关键基因——Δ12-脂肪酸脱氢酶基因mRNA表达水平的关系.结果显示,YM25235在5～35 ℃温度条件下均能生长,最适生长温度为30 ℃.低温条件下细胞膜流动性明显降低,但是多不饱和脂肪酸质量分数由从30 ℃时的24.35%增加到15 ℃时的40.32%,而且15 ℃时Δ12-脂肪酸脱氢酶基因mRNA水平提高了3.4倍.结果说明低温条件下细胞膜流动性下降,导致多不饱和脂肪酸合成相关基因表达水平提高,使得细胞膜脂中多不饱和脂肪酸含量增加,促进了菌株低温生长适应性.     

四氢噻吩-3-酮还原酶的筛选与表征

通过基因挖掘技术获得一种来源于炭疽芽胞杆菌的短链脱氢酶BaCR1。它能够催化四氢噻吩-3-酮的不对称还原反应,进而合成碳青霉烯类抗生素硫培南的重要手性中间体(R)-四氢噻吩-3-醇。对BaCR1进行了催化性能表征,结果表明最适反应pH为7.0,最适反应温度为30℃,催化剂转化数(k_(cat))与米氏常数(K_M)之比(k_(cat)/K_M)为0.25 L/(mmol·s)。在100 mL的反应体系中,偶联葡萄糖脱氢酶用于辅酶再生,在底物上载量为50 mmol/L、重组大肠杆菌整细胞(干重)上载量为20 g/L的条件下,无需额外添加辅因子NADPH,反应24 h,转化率大于99%,还原产物的e.e.值为84%,实现了产物的克级制备,体现了酶法不对称还原制备(R)-四氢噻吩-3-醇的潜力。     

胆固醇-7,8-脱氢酶大肠杆菌工程菌的构建

7-去氢胆固醇在化妆品和医药领域具有较大的应用需求,但现有的生产方法为化工法,流程复杂,且易污染环境.发酵法生产7-去氢胆固醇是一条新颖且具有潜在竞争力的生产途径.以虾Y-器官微粒体的cDNA文库为模板进行胆固醇-7,8-脱氢酶基因的扩增,与质粒载体连接后转化大肠杆菌,并对该工程菌的生物催化胆固醇-7,8-脱氢能力进行检测.     

朱黄青霉α-葡聚糖酶在毕赤酵母中的高效表达

【目的】提高朱黄青霉（Penicillium minioluteum ）α-葡聚糖酶（Dextranase）基因在毕赤酵母（Pichia pastoris）中的表达水平。【方法】根据毕赤酵母的密码子偏爱对酶基因进行优化与合成。优化后的基因片段与载体 pGAPZαA 连接,转化毕赤酵母 KM71 H。【结果】获得组成型分泌表达α-葡聚糖酶的工程菌 KM71 H／pGAPZαA-dex。发酵工艺试验中,摇瓶培养144 h,酶活为153 U／mL。6．8 L发酵罐补料分批培养92 h,酶活达到1218 U／mL。【结论】该工程菌以甘油作为碳源,发酵调控简单,产酶水平较高,具有适用于大规模生产的潜力。     

双液相体系下对黑根霉C11α-羟基化16α，17α-环氧孕酮的研究

研完了双液相体系下黑根霉对16α,17α-氧孕酮C11α-羟基化的生物转化能力.考察了8种有机溶剂对16α,17α-环氧孕酮和C11α-羟基-16α,17α-环氧孕酮的溶解度的差异,比较了它们对黑根霉细胞毒性的大小.结果表明,乙酸丁酯毒性最小,乙酸丁酯与水双液相体系时转化比较有利,达到了44.2%.同时考察了氧促进剂H2O2和外加电子受体维生素K3对提高该体系转化率的影响,分别提高了8%和6%.     

绿色木霉BGL Ⅰ基因在酿酒酵母中的克隆表达及其纤维素乙醇发酵

采用反转录PCR方法从绿色木霉AS3.3711的总mRNA中获得了编码β-葡萄糖苷酶Ⅰ(BGL Ⅰ)的基因bgl1.序列测定表明该基因片段长2235 bp,编码744个氨基酸残基,与里氏木霉的bgl1序列完全相同.将其插入高拷贝数整合型表达载体PScIKP,构建了重组质粒PScIKP-bgl1.线性化后转化工业酿酒酵母AS2.489菌株,利用高浓度G418筛选高抗转化子,经SDS-PAGE蛋白电泳证明获得了能高效稳定分泌表达重组BGL Ⅰ的转化子.重组BGL Ⅰ酶能直接水解培养液中的纤维二糖,在84 h测得酶活最大值为0.978 u/mL.重组BGL Ⅰ酶最佳反应温度为60℃,最适反应pH为4.0～5.0,并且能以纤维二糖为惟一碳源发酵乙醇,发酵90h能够用重铬酸钾氧化比色法检测到乙醇的体积分数为0.51%.结果表明:成功克隆并在酿酒酵母中表达了一种高活性的β-葡萄糖苷酶,对于工业上直接利用纤维素为惟一碳源发酵生产乙醇的研究有重要意义.     

加强辅酶循环再生实现不对称合成(S)-1-苯基-1,2-乙二醇

以β-羟基苯乙酮为底物，利用羰基还原酶不对称合成(S)-1-苯基-1,2-乙二醇(PED)过程中，葡萄糖脱氢酶和6-磷酸葡萄糖脱氢酶催化NADPH再生反应与还原反应形成耦联，合成(S)PED的浓度分别达到0.78 g·L-1和0.75 g·L-1，对映体过量值(e.e.%)分别为91.84％和63.96％；连续分批还原反应后其总转化数(TTN)为26和58；经硫酸铵盐析、离子交换层析DEAE Sepharose、苯基疏水层析Phenyl Sepharose和亲和层析Blue Sepharose后得到电泳纯