人工核酸酶介导的基因靶向修饰技术

基因组靶向修饰技术是基因组改造和基因研究的重要手段,而人工核酸酶介导的基因修饰技术很大程度上提高了基因组靶向修饰的有效性、高效性和特异性,其主要工作原理是造成特异性的DNA双链断裂(DSB)诱导细胞内DNA修复,从而造成自发突变或引入人为变化,完成基因的敲入或者敲除.人工核酸酶基因修饰技术,包括了锌指核酸酶(ZFN)技术、类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)技术以及CRISPR-Cas系统,它们的分子作用机制、系统构建以及效用有一定的不同.对3种基因修饰技术的原理、研究进展和应用进行系统的阐述.通过利用人工基因修饰技术,能够精确、高效地对特定的基因实现编辑和修饰,以期在基因工程领域得到广泛的应用.     

基因编辑技术原理及其在动植物研究中的应用

自人类基因组计划开展以来,越来越多生物的基因组序列得到了测定,基因的功能逐步得到鉴定.人们期望通过对基因表达的改变,来治疗人类疾病或提高生物的产量和品质.早期突变技术对基因的改变是不定向的,近年来,锌指核酸酶(ZFN)、转录激活子样效应因子核酸酶(TALEN)和CRISPR/Cas9等技术可对某个已知基因进行编辑.特别是CRISPR/Cas9技术,由于具有操作方便、效率高等优点,因此成为对基因进行定向操作的强有力工具.本文对几种基因编辑技术的原理和应用进行简要介绍和展望.     

基因组编辑植物的监管与检测技术

 基因组编辑技术是利用人工核酸酶对生物体目标基因序列进行修饰的技术。近年来,以CRISPR/Cas系统为代表的基因组编辑技术由于高效、简单的操作发展迅速,为研究动植物基因功能、疾病治疗、植物分子育种等方面提供重要的方法。同时,由于基因编辑产品的不断出现,为政府监管提出了更高的要求。通过介绍植物基因组编辑技术及其产品的种类,重点说明了主要国家、经济体在植物基因组编辑产品的安全监管的异同,概述了科学界对基因编辑作物的基本原则,并介绍了几种植物基因组编辑产品的检测方法。     

靶向RNA的CRISPR-Cas13系统及其研究进展

CRISPR-Cas(clustered regularly interspaced short palindromic repeats-associated proteins)系统是细菌和古菌抵御外源核酸物质入侵的适应性免疫系统,发挥作用时经过3个阶段:适应阶段、表达阶段和干扰阶段.其中,靶向DNA的CRISPR-Cas9研究较为深入,在基因组编辑领域具有广泛应用.而靶向RNA的CRISPR-Cas技术仍处于初步研究阶段.CRISPR-Cas13系统(Cas13a-d)的发现为RNA编辑等领域提供了新思路.Cas13家族蛋白是RNA介导的具有RNase活性的效应蛋白,结构上有保守的HEPN结构域(higher eukaryotes and prokaryotes nucleotide-binding domain),能自我加工precursor crRNA和切割靶RNA.从Cas13家族蛋白的发现与基本功能、结构基础,以及在病毒核酸检测、RNA编辑、疾病治疗等方面的应用进行综述,旨在为CRISPR-Cas13系统的合理改造和应用奠定基础.     

心血管疾病的基因治疗

基因治疗在先天遗传性以及后天获得性心血管疾病治疗中均具有广阔的发展前景. 对心血管疾病致病机理的深入认识和疾病基因组学研究的发展, 进一步促进了临床前基因治疗的研究进展. 但基因治疗过程中存在的机体细胞免疫反应、外源基因表达水平不足、在体基因转导效率低下等因素都成为基因治疗临床应用转化的瓶颈. 近年来, 基因导入载体和基因组编辑技术的发展为上述问题的改善和解决提供了新的思路. 目前成族规律间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR)/Cas9 基因组编辑技术已经成功应用于动物模型的在体基因编辑, 达到了显著改善血脂指标的疗效. 进一步研究体内组织特异和高效的基因导入方式, 提高基因编辑的靶向效率和特异性, 并建立全面有效的安全评估实验体系, 将推动基因治疗向临床应用的转化. 针对心血管疾病基因治疗中基因导入载体的研究以及CRISPR/Cas9 基因组编辑技术的应用展开讨论.     

基因编辑技术在绒山羊育种中的应用

近年来,随着基因编辑技术发展的日趋完善,其在猪、牛、羊等家畜育种上的应用日益增多.为全面了解基因编辑技术在绒山羊育种中的研究进展,总结了锌指核酸酶(ZFNs)、转录激活类效应因子(TALENs)和成簇规律间隔短回文重复序列核酸酶(CRISPR/Cas9)三种基因编辑技术的原理和方法,阐述了其在转基因绒山羊研究中的发展现状和应用前景.     

基因修饰猪作为人类疾病模型的研究进展

 对近来有关基因修饰猪作为人类疾病模型的研究进行综述。建立疾病动物模型有利于探索疾病的致病机制,开发治疗药物和诊治途径,是人类疾病临床前研究的重要环节,对实验到临床(B2B)的转化医学研究至关重要。通过基因修饰手段获得的带有人类疾病的模型动物具有遗传稳定性和来源的可重复性,对相应人类疾病的研究更具有举足轻重的作用。由于与人类生理特征具有诸多相似性,猪可以作为良好的人类疾病动物模型,并且比传统的啮齿类疾病动物模型更具有优势。随着大动物胚胎操作技术和基因操作技术的日渐成熟,近年来对通过基因修饰猪建立的人类疾病模型的研究进展也逐步加快。     

CRISPR-Cas9系统定向编辑TCR基因的sgRNA筛选

为构建靶向T细胞抗原受体(T Cell Receptor,TCR)基因的CRISPR-Cas9基因组编辑系统,基于p X458质粒构建靶向TCR基因β链C区的CRISPR-Cas-sgRNA质粒,将其转染Hep G2细胞系,用流式细胞术检测转染效率;转染48 h后提取Hep G2细胞基因组DNA,扩增含有编辑位点的片段,测序分析该片段的峰图改变;对出现双峰的扩增片段做T-A克隆后测序分析,确定基因编辑发生的位置,并结合转染效率计算基因编辑效率.结果表明,成功构建含有3种sgRNA序列(N1、N2、S1)的p X458-sgRNA质粒,其转染效率分别为38.5%(N1)、39.7%(N2)和24.2%(S1);基因组PCR产物测序分析发现,S1组扩增片段在打靶位置出现杂峰;T-A克隆测序发现,20克隆有4个发生了基因编辑(20%),结合转染效率(24.2%)可知,编辑效率约为83%.可见,本文成功构建靶向TCR基因的CRISPR-CassgRNA质粒,并鉴定出基因编辑效率较高的一种sgRNA序列.     

人类基因组计划

以大量最新资料全面地概述了人类基因组计划(HGP)的研究状况 ,包括人类基因组计划产生的背景、任务、研究进展以及我国的人类基因组计划。HGP的主要任务是对人类基因组的 3× 10 9碱基对 (bp)进行测序 ,绘制人类基因组的工作图 ,进而破译人体遗传物质DNA上碱基对的生物学含义 ,弄清人类各种疾病与基因的关系。为从根本上预防人类疾病的发生、有效治疗疾病以及为人类历史的研究提供有力工具。至 2 0 0 0年 6月完成了覆盖人类基因组序列 97%的工作框架图 ,预计 2 0 0 3年完成基因的工作图。我国科学家完成了 3号染色体上 30 0 0万个bp的测序任务。我国基因资源丰富 ,应尽快加以保持和加快研究步伐。本文的目的就是使人们对HGP这一重大科技事件有全面的了解 ,深刻理解新成果的科技知识及意义。感受到“2 1世纪将是生命科学的世纪”这一科学家的预言已临近现实。     

敬畏与审慎——谈谈人类胚胎基因组编辑技术

 2015年生命科学领域里最热门的话题自然是基因组编辑技术,尤其是被科学家称为“基因手术刀”的CRISPR（Clustered regularly interspersedshort palindromic repeats）基因组编辑技术。CRISPR的意思是规律成簇的、间隔短回文重复序列,源自于古细菌及细菌中的后天免疫系统,能帮助细菌有效抵抗病毒等入侵者造成的损伤。当重复序列与入侵病毒“遭遇”时,细菌就会产生一段与病毒序列相匹配的RNA,它被称为“向导RNA”,能够同负责切割DNA的Cas酶结合在一起,二者的职责就是发现并“隔离”病毒序列,从而阻断病毒复制。在细菌这套“防御”系统的基础上,科学家发展出一种新技术即CRISPR基因组编辑技术--通过“修饰”Cas酶与“向导RNA”,促使二者的联合体与他们想要在细胞基因组里“剔除”的某一DNA相匹配,从而“诱导”DNA进行修复。该技术是一种能够对基因组进行精确编辑的分子生物学利器,如同我们可以在电脑上对WORD文档中的文字按照我们的需要进行编辑一样。由于CRISPR基因组编辑技术不受物种限制,因此科学家已经成功在许多动植物中实现了基因编辑。从2012年开始,已有科学家将该技术应用于成人体细胞基因组中,从而为阻断遗传病延续以及治疗基因缺陷疾病打开了通道。至2013年初,有关编辑人类干细胞基因组技术方面的论文开始陆续问世,我国科学家也积极投入到相关研究中。     

腺相关病毒介导锌指核酸酶体外切除HIV-1基因组研究

人类免疫缺陷病毒1型(Human Immunodeficiency Virus type 1, HIV-1)能够整合到宿主细胞基因组并通过基因沉默的方式逃避高效抗逆转录病毒疗法(Highly Active Antietroviral Therapy, HAART),而高效特异性的基因编辑工具的出现，有望成功切除HIV-1前病毒基因组。重组腺相关病毒(AAV)是基因治疗的重要载体系统，为了获得能够高效感染T细胞的基因编辑工具递送系统，本研究通过比较过表达增强绿色荧光蛋白的血清型2、血清型6、血清型DJ的重组腺相关病毒，筛选出T细胞系的偏好血清型为6型。通过比较CMV启动子、SFFV启动子，筛选出T细胞系的偏好启动子为SFFV启动子。最后，我们通过制备过表达靶向HIV-1长末端重复序列(Long Terminal Region, LTR)的锌指核酸酶(Zinc Finger Nuclease, ZFN)的AAV6递送载体系统，感染模拟HIV-1阳性表达的细胞系Ya, T7E1检测证实HIV-1前病毒基因组被特异性切除，流式细胞仪检测证实切除效率约为17.1%,测序分析进一步证实靶向HIV-...     

植物乳杆菌CS3全基因组分析及对己醛的转化

大豆是传统酱油酿造的主要原料,在酿造过程中容易发生氧化变质和酸败等现象,从而产生不良风味和有害物质,其原因是发酵过程中产生了不饱和脂肪醛类物质。本研究以植物乳杆菌(Lactiplantibacillusplantarum)CS3为研究对象,在对该菌株进行全基因组测序和己醛胁迫下的转录组分析的基础上,筛选出转化己醛的关键基因AdhE(双功能乙醛CoA/酒精脱氢酶)和己醛胁迫下的高表达转录因子Fru R。利用CRISPR-Cas9基因编辑技术,将基因AdhE和FruR进行基因敲除验证,敲除后的菌株在MRS培养基中代谢己醛的能力分别下降了17.72%和56.72%。这表明两个基因在己醛转化过程中都发挥重要作用。这一结果为植物乳杆菌在酱油生产中降低醛类等有害物质的应用提供了理论支持。     

锌指核酸酶技术最新进展及其在植物基因工程中的应用

锌指核酸酶(zinc finger nucleases,ZFNs)是近年来发展起来的一项定点改变基因组序列的新技术.它能够特异切开基因组中的特定序列,产生双链断裂DNA,诱导细胞启动DNA损伤修复过程,在修复过程中实现对靶基因的敲除或改变.这一技术可以通过删除某一基因或一个基因的一部分、导入点突变等,对该基因的功能进行研究,也可以定向改变基因组序列,使生物体获得新的功能.这项技术在基因功能的研究和新药的研发、新品种选育等方面有着十分广阔的应用前景,是后基因组时代基因功能研究的重要手段.介绍了ZFNs工作原理,重点阐述了该技术近几年的最新进展及其在植物学领域的应用,同时也对ZFNs存在的问题进行了深入分析.     

转基因动物在医学研究中的应用

在医学研究中，用转基因动物的方法研究基因的表达调控与疾病发生的关系、建立各种人类疾病的动物模型已经为许多疑难疾病的发病机制研究提供了十分有用的资料。随着分子生物学技术在医学研究中的应用，人类对疾病的研究已经深入到基因水平，特别是随着人类基因组计划的实...     

人类基因组计划

1　人类基因组计划产生的背景1986年 3月 7日美国科学家杜尔贝科 (Dulbec co)在美国《科学》(Science)杂志上发表一篇题为“癌症研究的转折点———测定人类基因组序列”。他提出“癌症研究最重要的成果是使我们认识到 ,癌症与其他疾病的发生都与基因有关”的观点。所以人们要征服癌症 ,要治疗疑难病就要在人体内定位基因 ,分离基因 ,研究基因的功能。这样才能预防、诊断、治疗这些疾病。在杜尔贝科等众多科学家的倡导与策划下 ,在美国整整经过 5年的讨论 ,才使政府决策者、科学家和民众一致认识到人类所有疾病 (包括遗传病、心血管病、糖…     

猪作为动物模型在生物医学研究中的应用

<正> (一) 猪作为动物模型的实用价值研究生物医学的人,日益认识到动物模型对人类疾病的贡献。已经提出来的动物模型有好几百种。天然发生的动物疾病通常比用实验方法诱发的疾病和天然的人类疾病更为相似,虽然在实用上并不需要动物模型,存各方面都和同类的人类疾病相似。动物模型对人类医学的无与伦比的贡献已经在研究疾病病理发生机理,阐明宿主防卫机理、临床研究,以及药物、化学药品、     

第二大类CRISPR-Cas系统在肿瘤研究的应用

第二大类CRISPR-Cas系统具备多重基因编辑修饰功能,仅由单效应蛋白介导完成干扰过程,包括靶向编辑双链DNA的Cas9、Cas12系统,及识别并切割单链RNA的Cas13系统.综合介绍第二大类CRISPR-Cas系统的结构与功能基础、作用机制,及其在构建肿瘤模型、肿瘤免疫治疗、耐药性研究、核酸检测等方面的应用,为进一步开发CRISPR-Cas工具并应用于临床医学研究提供参考.     

基因编辑技术在哺乳动物上的研究应用进展

基因编辑技术是近几年兴起的对目标基因组进行高效、定点、精准编辑的技术,主要通过人工核酸内切酶在基因组特定位点进行双链断裂,从而引入DNA片段插入或缺失,实现靶位点的基因敲除、基因定点突变和基因修复等.基因编辑技术被广泛运用在多种动物上,取得了重要成果,前景广阔.文章对基因编辑的发展历程以及在多种哺乳动物上的研究现状和进展进行综述,并对技术瓶颈进行讨论.     

精细突变小鼠模型的研究进展

基因打靶研究最重要的应用之一是研制人类疾病动物模型。人类的疾病许多是由于基因功能丧失引起的 ,也有许多是由于基因超表达或功能获取 (ｇａｉｎｏｆｆｕｎｃｔｉｏｎ)引起的。后者的情况就无法用基因剔除的方法获得相应的疾病模型。因此研究者发明了各种可以将诸如插入终止蜜码子或替换某个氨基酸之类的精细突变引入小鼠基因组中的方法。早期的研究者采用的方法主要有两种 ,一是将不含选择标记基因的打靶载体直接经显微注射法引入ＥＳ细胞 ,然后用ＰＣＲ分析鉴定同源重组克隆[1] ;另一种是用带有精细突变但无选择标记基因的打靶载体与仅…