文昌鱼碱性磷酸酶的动力学初步研究

从厦门文昌鱼中部份提纯一种碱性磷酸酶,并对该酶作用的动力学进行了初步的研究。该酶作用于底物磷酸苯二钠的最适pH为10.1,最适温度为40℃,测得其米氏常数值(K_m)为1.1×10~(-3)M,pH影响K_m值而不影响最大反应速度(V),表现为竞争性类型。Mg~( )有明显的激活作用,而Zn~( ),EDTA,DFP,ME及PCMB等在一定浓度范围内,表现为非竞争抑制类型。ME的抑制作用表明硫硫键是维持酶活力所必需的。从pH对酶的活力影响,测得有关酶活性基团解离的pK值为9.82,在不同温度条件下,测得该酶的活化能为3.16仟卡/克分子,其温度系数为1.15(30—40℃)。     

中华猕猴桃蛋白酶分离提纯及性质研究

以中华猕猴桃鲜果为材料,经调节pH,硫酸铵盐析,除果胶以及DEAE—纤维素(E22)柱层折纯化,获得电泳单一区带酶制剂。以牛碳氧血红蛋白为底物,酶的最适温度为45—50℃,最适pH为3.7—4.0,K_m值为2.78×10~(-5)M,K_(cat)为2.01×10~2/min,pH影响V_(max)而不影响K_m值,表现为非竞争性抑制作用。该酶的活活化能为6.84kcal/mol,ΔH为6.24—6.20kcal/mol(30—50℃),同时还进行了酶的热稳定性研究。     

文昌鱼酸性磷酸酯酶的化学修饰

用DEAE-纤维素(DE-22)并改进酶的提纯方法,聚丙烯酰胺凝胶电泳为单一蛋白区带的酶制剂比活力为359μM/mg(E)/min(Npp为底物)·用凝胶过滤法测得该酶分子量为58600,氨基酸组成有20种,共467个氨基酸残基。10~(-4)M pCMB使酶活力丧失98％;1×10~(-3)M PMSP该酶活力丧失96％,2×10~(-4)M NBS以及1×10~(-2)M BrAc酶活力均丧失90％·酶修饰失活呈一级反应,修饰过的酶紫外280nm吸收峰消失·初步判断文昌鱼AcPase分子上的Cys,Trp,His,Ser等氨基酸残基可能是酶的活力必需基团。     

僧帽牡蛎(Ostreu cucullata)碱性磷酸酶的酶学特性

本文对僧帽牡蛎(Ostrea cucullata)碱性磷酸酶的酶学特性进行了若干探索. 实验结果表明,碱性磷酸酶的最适pH与所用的废物有关,以磷酸苯二钠为底物时,酶的最适pH为10.3,而以β-甘油磷酸钠为底物时,则降为9.5.所得结果证实,pH对酶的影响有可逆和不可逆之分,在pH8.5—10.0范围内,pH对酶的影响是可逆的,而当pH大于10.5时,则为不可逆, 实验求得,僧帽牡蛎碱性磷酸酶对磷酸苯二钠作用的Km值为1.9×10~(-4)M,在10-50℃时.酶对磷酸苯二钠反应的“活化能”为9550卡/克分子。酶在30℃以下活性稳定,最适温度区在39℃附近;50℃保温一段时间,酶活力大大降低. 僧帽特蛎的碱性磷酸酶与从其它材料获得的碱性磷酸酶一样,可被镁离子激活:其最适激活浓度为8.33mM,但被汞离子,锌离子,氰化物和半胱氨酸强烈抑制.氟化物和钼酸盐对酶的影响不明显.     

文昌鱼碱性磷酸酶的热力学特征初步研究

从厦门文昌鱼中,获得提纯200倍的经聚丙稀酰胺凝胶电泳鉴定为均一的碱性磷酸酶。从热力学及热失活动力学角度初步探索了改变酶的结构对酶活力的影响。实验结果初步表明:在pH10.1时酶作用于对硝基苯磷酸钠的K_m值随反应温度的增高(25、30、35℃)而相应的增大(分别为5.81×10~(-4),8.09×10~(-4)及9.30×10~(-4)M)。其一级反应速度常数k_p分别为1.88×10~(-4),2.25×10~(-4)及2.31×10~(-4)秒~(-1)。天然第一态与变性第二态酶催化反应的活化能Ea分别为10.09 kcal/mole及4.51 kcal/mole,△H_1为24.09 kcal/mole及△s_1为74.44e.u.。在pH10.1时,酶促反应呈现一个严格的转化温度(32-35℃)。据活力计算,自然酶变性酶的二态可逆变性反应的热力学参数△S之值,认为酶局部变性,酶分子开始部分伸展,可能涉及三个氢键被破坏,但未涉及酶的总体结构。     

PNP酶固定化技术探讨

本研究采用活化CH-Sepharose 4B固定化PNP酶,发现其表现米氏常数K_m=5.13×10~(-3)mol/l,比游离酶增大(游离酶K_m=4.44×10~(-3)mol/l);固定化酶和游离酶的最适pH分别为9.6和9.0,固定化后,其酶的稳定性明显提高,半衰期为七个半月。用此酶催化聚合而成的PolyC和PolyI的分子量分别大于5S和9S。     

中国黑白花优良种公牛精子透明质酸酶的分离纯化及部分性质研究

中国黑白花优良种公牛精子透明质酸酶经硫酸铵分级沉淀和 Sephadex 柱层析分离纯化,得到一个电泳纯品,活力纯化40倍.用 sephadexG-150凝胶过滤和 SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳测得分子量为65000.该酶的最适 pH 为3.5～4.5,最适温度为37℃～45℃,在室温下较稳定,用 Limeweaver-Burk 作图法求得 Km 值为6.06×10~(-4)mol/L.     

文昌鱼的酶学研究——Ⅰ.偏碱性蛋白酶的分离提纯及其动力学的初步研究

通过硫酸铵分级分离,DEAE—交换纤维素柱层析及SephadexG-200凝胶过泸等方法,从厦门文昌鱼中部份提纯一种偏碱性蛋白酶,并对该酶的某些性质作了初步的研究.该酶作用于酪蛋白的最适pH为7.0,最适温度30℃,测得其米代常数(K_M)值为3.08×10~(-4)M,而pH不影响其K_M值。对几种蛋白质的水解速度不同,其中对血红红蛋白的水解速度最快。某些化学试剂如半胱氨酸及谷胱甘肽(都为10~(-3)M)能增进酶活力,而P-CMB及碘代乙酰胺(都为10~(-3)M)则比较明显的降低酶活力。     

球孢白僵菌017壳聚糖酶的研究I酶制剂的基本特征

球孢白僵菌017突变菌株(Beauveria bassiana 017)在CTN培养基(含0.2～1％壳聚糖,0.075％KH_2PO_4,0.05％MgSO_4,0.05％NaCl,0.001％FeSO_4,0.3％KNO_3,0,1％牛肉膏,pH5.0)中,20～30℃,200r·p·m振荡培养7天,可以分泌大量的胞外壳聚糖酶,对底物水解的最适温度为45～50℃,最适pH值为3.8～4.0。K_m值和V_(max)分别为2.17×10~(-6)M和0.45μmol/min,60℃保温1小时,剩余酶活性为10％,Ca~(2+),Mn~(2+)和Mg~(2+)对酶有激活作用,Cu~(2+)和Fe~(3+)对酶有部分抑制作用,Hg~(2+)和Ag~+则强烈抑制酶的活性。     

固定化多核苷酸磷酸化酶的特性研究

对用聚丙烯酰胺凝胶,制备的固定化多核苷酸磷酸化酶与游离酶的特性比较表明:在以CDP为底物时,游离酶的km=6.4×10~(-3)M,而固定化酶的km(表观)=9.14×10~(-3)M,比游离酶增大,固定化酶的最适温度范围扩宽,稳定性提高。     

油菜籽焦磷酸:果糖-6-磷酸1-磷酸转移酶的动力学研究

采用DEAE-Sephadex A-50及磷酸纤维素柱层析,用底物亲和洗脱法从萌发油菜(Brassica napus)种子中分离纯化了焦磷酸:果糖-6-磷酸1-磷酸转移酶(PFP).纯化倍数679.7倍,比活力为21.75 单位/毫克.蛋白,活力回收率22.9%.酶的最适pH值为7.5,Mg2+和M2+n对酶有激活作用.进行酶的初级动力学及稳态动力学研究,对果糖-6-磷酸(F6P)表现为典型的米氏规律,Km值为3.33 mmol/L;对焦磷酸(PPi)的活力变化,在PPi浓度小于1.0 mmol/L时具有部分米氏酶特点(Km＝1.0 mmol/L),大于1.0 mmol/L时,PPi对酶有抑制作用.从两底物F6P和PPi的相互作用以及产物磷酸(Pi)与底物(F6P和PPi)的相互关系分析,初步推断油菜籽PFP的催化反应为双底物双产物的有序机制.     

大肠杆菌谷氨酸脱羧酶的纯化及其性质的研究

大肠杆菌菌体经机械研磨,硫酸铵分级,sephadex G-100层析,再用聚丙烯酰胺垂直板凝胶电泳进行纯化,得到电泳均一的 L-谷氨酸脱羧酶纯品.酶作用的最适pH 为4.4,在 pH3.6～5.8稳定;最适温度50℃,50℃以下稳定;于60℃保温30min,酶活力保留65%.此酶作用于 L-谷氨酸的 K_m 值为1.39×10~(-2)mol/L,金属离子 Zn~(2+),Cu~(2+),Mg~(2+),Fe~(2+)分别不同程度的抑制此酶,EDTA 无抑制作用.该酶在280nm 处有最大光吸收,与蛋白质在280nm 处有最大光吸收值的普遍性质相一致.     

云芝漆酶理化性质及动力学研究

主要研究pH值、金属离子、温度对云芝漆酶活性和稳定性的影响,以及该酶底物浓度效应和Km值测定.实验结果表明:Cu2+、Co2+对漆酶有激活作用,而Ag+则有抑制作用;该酶最适pH为4.8,在pH4~4.8表现出较强的稳定性;最适反应温度为40℃,低于50℃时有较好的热稳定性;Km值为4.2×10-3mol/L.     

谷氨酸生产菌T6—13谷氨酸脱氢酶特性研究

本文对谷氨酸生产菌Te_(-13)谷氨酸脱氢酶的辅酶专一性、热稳定性、最适温度、最适pH、动力学参数和发酵过程中酶活力变化进行了研究。结果表明该酶属胞内酶,以NADP~+为专一性辅酶,脱氨反应的最适pH为9.5,酶的最适温度为35～40℃,酶的热稳定性试验表明50℃保温10分钟,残留活力为50%,60℃保温10分钟残留活力为4%,70℃下则完全丧失活力,对L—谷氨酸和NADP~+动力学参数分别为2.13×10.2mol/L和6.58×10~(-5)mol/L,AMP、ADP对脱氨反应有激活作用,ATP无影响。     

三角帆蚌碱性磷酸酶的初步研究

从三角帆蚌外套膜中,部分提纯了一种碱性磷酸酶(AKP),并对AKP的某些性质进行了初步研究。该酶作用于底物磷酸苯二钠,测定其最适pH值为10.1,最适温度为40℃,Km值为1.82×10~(-3)mol/L。分别测定了某些化学试剂对该酶的作用:Mg~(2 ),Ca~(2 )离子对AKP有不同程度的激活,尤以Mg~(2 )的作用明显;KH_2PO_4,L-Phe,L-Cys,ME(巯基乙醇),DFP(二异丙基氟磷酸)和EDTA-Na均对AKP有不同程度的抑制作用,其中L-Cys和ME抑制作用最为强烈。KH_2PO_4对AKP的作用属于竞争性抑制,而DFP属于非竞争性抑制。     

胞苷二磷酸胆碱酶促合成的研究

研究了胞苷三磷酸和磷酸胆碱在啤酒酵母磷酸胆碱胞苷酰转移酶催化作用下,直接合成胞苷二磷酸胆碱的反应条件,包括最适pH,底物浓度、镁离子浓度及反应时间的选择。在最适反应条件下转化率可达58%。此外,还测得了胞苷三磷酸的表观米氏常数K_M2×10~(-2)M,对酶的分离也作了初步的探索。     

背角无齿蚌酸性磷酸酶的分离、纯化及部分性质研究

从背角无齿蚌外套膜中,经盐析,ＤＥＡＥ－Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ａ－５０离子交换柱层析及Ｓｅｐｈａｄｅｘ,Ｇ－１５０凝胶过滤等步骤,分离提纯到一种酸性磷酸酶,提纯倍数８８．２５酶液比活力为２４．７Ｕ／ｍｇ,通过动力学方法测得其最适ｐＨ值为４．８,最适温度为５０℃,同样以对硝基苯磷酸二钠作底物测得其Ｋｍ值为０．７３ｍｍｏｌ／Ｌ ,Ｚｎ＾２＋对酶有激活作用,而Ｆ＾－,Ｐｂ＾２＋和Ｂａ＾２＋则对酶有一定的抑制     

玉米螟谷胱甘肽转硫酶的纯化及性质研究

以亚洲玉米螟(Ostrinia furnacalis)为材料,经Sephadex-G75、DEAE-Sepharose Fast Flow、还原型谷胱甘肽(GSH)为配基的亲和层析,分离纯化得到玉米螟谷胱甘肽转硫酶(GST)。以2,4-二硝基氯苯(CDNB)为底物测得其比活为1070U/mg蛋白,收率为22.9%,提纯1138倍。经SDS-PAGE和PAGE鉴定,得到的GST为一条带,亚基的分子量为25kD,经凝胶过滤测得其全酶分子量为50kD,说明该酶是由两个相同亚基组成的。IEF测得主带等电点为8.2。该酶最适温度为41℃,最适pH范围为6.3～6.9。经动力学测定该酶双底物反应机制为序列机制,对CDNB的K_m值为0.15mmol/L,对GSH的K_m值为0.35mmol/L,两种底物的k_cat均为783s^-1。Cl-对底物CDNB有竞争性抑制作用,对GSH是非竞争性抑制作用;3,5-二硝基苯甲酸(DNB)对CDNB有竞争性抑制作用,对GSH是反竞争性抑制作用。     

刺槐幼苗中L-亮氨酸氨基转移酶的提纯和特性

<正>刺槐幼苗中的L-亮氨酸氨基转移酶(EC2.6.1.6,LAT)经热处理、硫酸铵沉淀、Sephadex G-100和DEAE-纤维素柱层析被提纯61倍,聚丙烯酰胺凝胶电泳显示单一的带。这种酶的分子量为7×10~4,最适pH为9.0,最适温度为60℃,它对L-亮氨酸的km为2.5mM,对α-酮戊二酸的km为3.5mM;全酶的吸收光谱在230和280nm显示两个主峰,在320和425nm显示两个小峰,透析后320和425nm的小峰基本消失;这种脱辅基酶蛋白无活力,但与100μM磷酸吡哆醛保温1～4h便可恢复活力80～100％,这表示刺槐LAT的辅基是磷酸吡哆醛;一些羰基试剂和底物类似物(二羧酸)能抑制这种酶的活力,除Co~(2+)外,Mg~(2+)、Mn~(2+)、Cu~(2+)、Hg~(2+)、Fe~(3+)和Al~(3+)对酶活力都无抑制,1×10~(-4)MHg~(2+)和1×10~(-3)M金属螯合剂乙二胺四乙酸(EDTA)对酶无抑制作用暗示,刺槐LAT没有对活力所需要的硫氢基和金属离子。     

假单胞菌593多铜氧化酶CopA的漆酶活性研究

从假单胞菌593中克隆出多铜氧化酶copA基因,并将其转入大肠杆菌BL21(DE3) p Lys S过量表达和纯化.纯化的CopA蛋白展示出漆酶活性,针对漆酶的3种底物ABTS、DMP、SGZ,CopA的最适反应pH分别是3. 5、7. 5和7. 5,最适反应温度分别是50℃、50℃和42℃.pH稳定性和热稳定研究发现,在pH 7. 0条件下,CopA比较稳定,在温度大于42℃保存该蛋白,其活性降低较快.二价金属离子影响实验发现,CopA漆酶活性能被二价铜离子显著加强.酶动力学常数实验结果展示,CopA作用于底物ABTS,K_m为0. 281 mmol/L,V_(max)为3. 02×10~(-3)mmol·L~(-1)·min~(-1),k_(cat)为1. 8 s~(-1); CopA作用于底物DMP,K_m为0. 141 mmol/L,V_(max)为4. 54×10~(-3)mmol·L~(-1)·min~(-1),k_(cat)为2. 2 s~(-1); CopA作用于底物SGZ,K_m为0. 025 mmol/L,V_(max)等于0. 7×10~(-3)mmol·L~(-1)·min~(-1),k_(cat)为0. 87 s~(-1).