嗜热侧孢霉2441纤维素酶产酶条件优化及突变株选育

为了提高嗜热侧孢霉2441纤维素酶的产量,对产酶条件进行了优化,测定了酶的特性,对选育抗葡萄糖效应突变株和中温型突变株进行了探索.实验中酶活力测定以微晶纤维素、CMC-Na和水杨苷为底物,DNS法测定还原糖;产酶条件优化采用正交试验设计,以微晶纤维素酶活为指标;通过NTG诱变和UV诱变选育抗葡萄糖效应突变株和中温型突变株.结果表明:产酶条件优化后,嗜热侧孢霉2441的纤维素酶活极显著提高(P0.01);2441的微晶纤维素酶、CMC-Na酶和β-葡萄糖苷酶的最适作用温度分别为60℃、65℃、70℃,最适作用pH值均为5.5,温度高于70℃及碱性条件下,酶活力显著下降;选育的抗葡萄糖效应突变株N20-01,微晶纤维素酶活提高13.203%,CMC-Na酶活提高47.176%,β-葡萄糖苷酶活提高119.517%;选育的中温型突变株U40-03,在32℃培养时与2441在45℃培养时相比,微晶纤维素酶活提高11.411%,CMC-Na酶活提高29.484%,β-葡萄糖苷酶活提高54.759%.     

斜卧青霉纤维素酶的研究 Ⅱ.JU1菌株的生理特征和酶合成调控问题的初探

研究了各种培养基成分对斜卧青霉抗降解物阻遏突变株JU_1和野生菌株114—2生长和产酶的影响。初步确认了斜卧青霉的纤维素酶及其它几种糖苷酶均为部分组成型酶,不需要专门的诱导物。“诱导”只是增加酶的产量。降解物阻遏是菌株控制其产酶量的主要调节机制。抗降解物阻遏突变可能同产能代谢部分受阻有关。     

斜卧青霉纤维素酶的研究——Ⅰ.JU_1菌株的产酶及酶作用条件

目前国内外对纤维素酶的研究多集中于木霉。但木霉毒性嫌疑大,在食品发酵工业中的应用受到限制。我们通过筛选和诱变选育,得到了一株斜卧青霉的纤维素酶抗降解物阻遏高产突变株—JU1,产酶能力近似于国内外的一些优良木霉菌株。对它的产酶条件及酶作用条件做了进一步研究。材料和方法     

木质纤维素降解酶系的基础和技术研究进展

山东大学微生物学科从事纤维素降解研究已有五十多年的历史。在木质纤维素微生物降解机理研究的基础上,从自然界中筛选到一株能高效降解植物纤维类生物质的斜卧青霉菌株,并获得该菌的多株抗降解物阻遏纤维素酶高产突变菌株。最近,已完成了对多株斜卧青霉菌株的全基因组测序,正在利用系统生物学技术深入探讨其酶系组成和酶合成调控机理。选育出的高产突变株,已用于规模化生产工业用酶,并开发出玉米芯生物炼制生产纤维素乙醇技术。     

纸浆浓度及分批补料对里氏木霉产纤维素酶的影响

研究了摇瓶中不同浓度纸浆为碳源对里氏木霉产纤维素酶的影响.结果表明:最佳的碳源质量浓度为12g/L,在此条件下第3天的滤纸酶活、CMC酶活和β-葡萄糖苷酶酶活分别为1.68、0.96和0.28U/mL.总碳源为15g/L下采用分批补料技术可以有效提高里氏木霉分泌纤维素酶.使用起始纸浆浓度为9g/L,第2、3、4天分别加入2g/L纸浆,其第3天的滤纸酶活、CMC酶活和β-葡萄糖苷酶酶活分别为2.41、0.72和0.27U/mL,较15g/L纸浆为碳源分批培养滤纸酶活提高1.8倍.     

液态混合菌发酵优化纤维素酶组分

在里氏木霉和黑曲霉液态混合条件下培养纤维素酶,分析两个菌种的接种比和延迟黑曲霉的接种时间对产酶的影响,探讨两个菌种发挥协同作用的最佳条件。结果表明:黑曲霉延迟接种48 h及里氏木霉与黑曲霉接种质量比1∶1时,所产纤维素酶的滤纸酶活为1.163μmol/(min.mL);β-葡萄糖苷酶活为0.606μmol/(min.mL),β-葡萄糖苷酶活与滤纸酶活比值为0.521,比单一里氏木霉产纤维素酶的酶活高,并在后续的酶解效果对比中表现最佳。48 h时的酶解得率为65.61%,高于里氏木霉单一培养时所产纤维素酶的得率53.91%和商品纤维素酶的得率49.64%。说明通过混合发酵,纤维素酶的组分得到了优化。     

玉米秸秆高效糖化菌株筛选及其产酶条件研究

高产纤维素酶和半纤维素酶菌株可以有效提高木质纤维素原料制燃料乙醇的产率.研究采用刚果红羧甲基纤维素钠培养基,并结合滤纸条培养基进行初筛,以玉米秸秆粉为发酵培养基进行复筛,筛选到纤维素酶和半纤维素酶高产菌Z-7真菌.采用摇床液体发酵试验并测定纤维素酶活和半纤维素酶活以确定Z-7真菌的最优产酶条件.结果表明,250 mL三角瓶的最佳装瓶量为50 mL,接种量为3%,pH值为5.5,摇床培养温度38℃,最佳产酶时间48 h,在此条件下该菌产CMC-Na酶活达到100 u/mL,半纤维素酶活达到126.6 u/mL.     

不同预处理方法对秸秆固态发酵产纤维素酶的影响

以稻草秸秆为原料,经不同方法预处理后用于固态发酵产纤维素酶.以羧甲基纤维素酶(CMC)酶活力和滤纸酶(FPA)酶活力为指标,比较了不同预处理方法对后续绿色木酶固态发酵产纤维素酶的影响.研究结果表明,微波联合稀酸预处理秸秆最有利于发酵产纤维素酶,并通过正交试验得到了最佳的预处理条件:基质浓度7%,H2SO4浓度2%,在180W的微波功率下处理稻草5min.在此条件下得到的单位能耗的酶活增加量最高,CMC酶活和FPA酶活分别比未经处理的稻草发酵后所得酶活提高了135.6%和82.7%.     

纤维素酶的活力与棉纤维的失重

研究了纤维素酶活力与织物失重率、断裂强力、表面厚度和弯曲刚度的关系.用三种纤维素酶处理两种全棉织物,将处理结果(失重率等)与以滤纸、CMC、脱脂棉为底物测得的酶活力相比较.结果表明,脱脂棉酶活最能反映纤维素酶对棉织物的水解能力,而CMC酶活与酶的实际水解能力不存在明显的依赖关系.研究还表明,外切酶活较高的Cellu-soft L有利于使织物柔软,内切酶活较高的Cellusoft Plus有利于生物抛光.     

康宁木霉液态发酵高产纤维素酶和木聚糖酶的研究

对选育的一株康宁木霉（Trichoderma koningii）QF-02进行了液态发酵生产纤维素酶和木聚糖酶的研究。实验结果表明：碳源的种类及性质是影响产酶的关键因素,价廉易得的天然稻草是其产酶的良好碳源。在培养基组成为40目稻草粉4g、Mandels营养液100mL、起始pH值4.8的优化培养条件下,摇瓶培养120h所得3种酶的平均活力分别为：滤纸酶活（FPA）1.43IU/mL, β-葡萄糖苷酶活0.36IU/mL, 木聚糖酶活176.8IU/mL。与商品纤维素酶制剂相比,在FPA载量相同(3FPU/g原料)的情况下,自制的复合酶在水解碱预处理稻草和天然稻草时,总还原糖产量比商品纤维素酶提高55%和40%,葡萄糖产量提高33%和12%。研究结果还表明木聚糖酶和纤维素酶具有协同酶解木质纤维素的作用。     

纤维素酶产生菌——根霉的分离选育与鉴定

6月在兰州榆中县兴隆山次生林区采集潮湿的腐质土壤、枯枝落叶、腐烂的植物种子、果实和朽木等样,用羧甲基纤维素钠培养基初筛,根据水解圈与菌落直径之比大小和水解圈清晰度分离筛选出较多的产纤维素酶菌株,其中有真菌、放线菌和细菌等.进一步通过测纤维素酶活力复筛,最终筛选出滤纸酶活力FPA和羧甲基纤维素酶活力同时都较高的菌株10株。经形态学鉴定10株均为霉菌,其中酶活最高的菌株分别是58-3A,42-2A和50-2B,它们的粗酶液崩解滤纸效果快速明显.58-3A的FPA酶活是497.78 U,CMC酶活是1376.2 U.10株之中菌株50-2B和菌株50-2C的菌落形态与其他菌株区别较大,经形态学鉴定菌株50-2B和50-2C都是根霉属.菌株50-2B的FPA酶活是218.88 U,CMC酶活是1571.4 U,菌株50-2C的FPA酶活是273.78U,CMC酶活是1084.62U.     

产黄青霉菌原生质体形成、再生和融合

采用0.5％的纤维素酶和0.5％的蜗牛酶的混合液在33°c分别酶解产黄青霉菌的两株营养缺陷型突变体的菌丝体以制备原生质体,并以0.6MNaCl为渗透压稳定剂使原生质体在再生培养基上再生成菌落,以30％的聚乙二醇(分子量6,000)和0.01MCaCl_2作助融剂,获得了两株营养缺陷型突变株原生质体营养互补的融合子,融合率为0.011％     

漏斗状侧耳纤维素酶高活性变株的选育与产酶条件和酶特性研究

以漏斗状侧耳5·01为出发菌株,用NTG和UV依次对孢子、单核菌丝和双核菌丝进行处理,获得了微晶纤维素酶活和羧甲基纤维素酶活分别是出发菌株2.86倍和2.51倍的突变株HCA15。正交试验结果表明:该变株在含有棉籽壳粉、尿素、麸皮、纤维二糖的培养基中酶活高。产酶的最适pH为5.6,最适温度为28℃。酶作用的最适pH为4.6,最适温度为40℃。酶在pH5.0时最稳定,在50℃以上不稳定。     

玉米秸秆超声辅助酶水解

利用超声波技术研究了外加超声场条件下玉米秸秆的纤维素酶水解过程.结果表明:超声波可有效地提高玉米秸秆的纤维素酶水解得率,减少酶用量.在超声频率20 kHz、功率30 W、作用时间10 min的超声场下,纤维素酶的最适滤纸酶活用量为20IU/g,最适水解温度为50℃,最适pH为4.8,其48 h酶解得率达到27.3%,比未加超声波时酶解得率提高了48.3%.     

碳源对里氏木霉β-聚糖酶合成的影响

研究了里氏木霉β-聚糖酶的生物合成,并比较了以玉米芯、纸浆、粗木聚糖为碳源对里氏木霉β-聚糖酶诱导合成的影响。结果表明:里氏木霉以15 g/L的玉米芯为碳源合成β-聚糖酶,培养4 d时滤纸酶活、羧基纤维素(CMC)酶活、纤维二糖酶活和木聚糖酶活分别为1.03 FPIU/mL、0.54、0.08和149.7 IU/mL;以纸浆为碳源,可得到较高纤维素酶活、较低木聚糖酶活的β-聚糖酶;以粗木聚糖为碳源,可制备低纤维素酶活的木聚糖酶,木聚糖酶活与CMC酶活的比值高达785.4,适合于纸浆的生物漂白。     

混合菌液态发酵纤维素酶及发酵pH的优化

以优势互补为原则,采用绿色木霉、根霉混合发酵产纤维素酶.利用旋转回归法研究根霉、绿色木霉混合发酵生产纤维素酶的比例、pH两个重要的影响因素,并拟合出回归方程.回归分析表明,发酵过程中,混合菌比例、pH对滤纸酶活具有显著影响.通过岭脊分析寻优得出:绿色木霉、根霉的混合比例为1∶1、发酵初始pH为3.5,在此优化条件下滤纸酶活由优化前的2.73 IU/mL、3.15 IU/mL提高到5.418 IU/mL.     

碳源对芽胞杆菌碱性纤维素酶合成的影响

芽胞杆菌ＥＶ２３基本为组成性地合成碱性纤维素酶,以不同碳源生长时酶合成水平差别不显著。葡萄糖（Ｇｌｕ）、果糖等易代谢碳源在ρ＝１０ｇ·Ｌ－１时,不但不抑制酶的合成,还相对地促进酶的合成。以Ｇｌｕ为碳源培养,ρ＝４０ｇ·Ｌ－１时酶合成水平最高,ρ≥５０ｇ·Ｌ－１时酶合成才有部分被阻遏。ＡＴＰ、三羧酸循环中间物对酶合成有一定的阻遏作用,表明ＥＶ２３碱性纤维素酶的抗阻遏合成是有一定限度的。     

复方促进剂HH和FH对纤维素酶活力的影响

采用滤纸糖化力法,在纤维素酶Ⅰ的最适条件(t=50℃,pH=5 5)下,分别考察了两种复方促进剂HH和FH对酶活力的影响。促进剂HH在浓度为1×10-6g L时表现出最大促进作用,酶活提高率为19 96%;促进剂FH在浓度为1×10-7g L时表现出最大促进作用,酶活提高率为20 82%。将两种促进剂分别用于纤维素酶Ⅱ上,也表现出一定的促进效果,说明促进剂HH、FH对纤维素酶具有一定的普适性。     

抗高浓度葡萄糖阻遏的纤维素酶高产菌的选育

以本室保存的一株纤维素酶产量较高的拟康氏木霉为出发菌株,经紫外诱变处理,用葡萄糖( 梯度浓度) 纤维素双层平板选育,在含葡萄糖(4% ) 纤维素双层平板上获得一株葡萄糖浓度高达10% 仍能产生纤维素水解透明圈的突变株UVⅢ.培养6 d ,干曲的CMC 酶活、FP 酶活和βG 酶活分别可达1145 .7 u/g 、55 .6 u/g 和24 u/g .分别是出发株的2 .4 倍、3.4 倍和12 .6 倍.     

一株生孢噬纤维菌的纤维素酶的定位研究

生孢噬纤维细菌Sporocytophaga sp.JL-01是能够降解纤维素的滑动细菌, 通过对该菌株发酵上清液、荚膜液、超声波破碎后的上清液、破碎细胞碎片及完整细胞的CMC酶活、滤纸酶活的研究,对其所产生的纤维素酶在细胞上的定位进行了研究.结果显示:生孢噬纤维细菌Sporocytophaga sp.JL-01可通过细胞质膜向细胞外分泌CMC酶,而其滤纸纤维素酶则存在于细胞质膜上.