斜卧青霉纤维素酶的研究——Ⅰ.JU_1菌株的产酶及酶作用条件

目前国内外对纤维素酶的研究多集中于木霉。但木霉毒性嫌疑大,在食品发酵工业中的应用受到限制。我们通过筛选和诱变选育,得到了一株斜卧青霉的纤维素酶抗降解物阻遏高产突变株—JU1,产酶能力近似于国内外的一些优良木霉菌株。对它的产酶条件及酶作用条件做了进一步研究。材料和方法     

木质纤维素降解酶系的基础和技术研究进展

山东大学微生物学科从事纤维素降解研究已有五十多年的历史。在木质纤维素微生物降解机理研究的基础上,从自然界中筛选到一株能高效降解植物纤维类生物质的斜卧青霉菌株,并获得该菌的多株抗降解物阻遏纤维素酶高产突变菌株。最近,已完成了对多株斜卧青霉菌株的全基因组测序,正在利用系统生物学技术深入探讨其酶系组成和酶合成调控机理。选育出的高产突变株,已用于规模化生产工业用酶,并开发出玉米芯生物炼制生产纤维素乙醇技术。     

关于以甘油为阻遏剂选育纤维素酶高产菌株的方法

应用α-纤维素甘油平板,从一株拟青霉(Paecilomyces sp)经紫外线诱变后,篩选出21株能在过量甘油存在的条件下产生纤维素酶的突变株。以滤纸、滤纸加甘油和滤纸加磷酸甘油为碳源测定了其中4个突变株的C_1酶活、外切C_x酶活和滤纸酶活的产酶常数以及为葡萄糖所阻遏的情况,结果表明:它们的纤维素酶合成的调节机制并未发生改变。其所以能在过量甘油存在的条件下合成纤维素酶,实际上是甘油利用的缺陷型或部分缺陷型,而不是抗降解物阻遏的突变株。     

青霉菌（Penicilliumsp.91—4）合成菊粉酶的调节

探讨青霉菌（Ｐｅｎｉｃｉｌｉｕｍｓｐ．９１－４）合成菊粉酶的调节控制时发现该菌株菊粉酶合成速率与菌体生长速率呈负相关，酶的合成受菊粉诱导和菊粉降解物阻遏调控．通过放线菌素Ｄ等抑制剂对酶合成影响的研究，认为菊粉酶生物合成时降解物的阻遏发生在转录水平．阻遏条件下菌体ＡＴＰ水平比诱导条件下高１０３倍，菌体ＡＴＰ水平是反映青霉９１－４菊粉酶合成状况的重要指征     

产碱性聚半乳糖醛酸酶嗜碱细菌抗利福平高产菌株的选育

分离得到产碱性果胶酶嗜碱芽孢杆菌ＮＴＴ３３，其聚半乳糖醛酸酶的产生强烈地受葡萄糖的代谢阻遏，对利福平敏感。通过抗得福平自然突变法，从出发菌株ＮＴＴ３３中筛选抗利福平突变株。     

胆固醇氧化酶高产菌株的诱变选育及产酶条件优化

在对细脚拟青霉、玫烟色拟青霉、粉拟青霉、香菇、平菇、金针菇等胆固醇氧化酶产生菌初筛的基础上,选择以产酶较高的玫烟色拟青霉作为紫外诱变的出发菌株,筛选出一株相对高产突变菌株MFEC006,其酶活达到了0.548 3 U/mL,比出发菌株提高了154%,经8次传代培养,突变株性质稳定.对MFEC006菌株产酶条件进行优化,得出其最佳产酶条件为:pH为6.5.温度27℃,接种量10%,摇床转速180 r/min.     

灰绿曲霉高产纤维素酶突变株的选育

以一株具有较高纤维素酶活性的野生菌株-灰绿曲霉XC9为出发菌株,经过紫外线﹑氯化锂﹑甲基磺酸乙酯(EMS)等物理化学诱变剂多重诱变处理,获得了抗葡萄糖阻遏的突变株E2-26﹑E5-65﹑U6-31和EU7-22,其CMC酶活与出发菌株相比分别提高至1.7、1.4、1.3、2.0倍.突变株经PDA斜面接种传代5次后产酶性能仍然保持稳定.变株的菌丝、孢子颜色也发生了较大的改变.对突变株EU7-22的形态结构进行了观察,并与出发菌株XC9作了发酵性状的比较,发现其产酶性能有了明显提高.     

灰绿曲霉高产纤维素酶突变株的选育

以一株具有较高纤维素酶活性的野生菌株-灰绿曲霉XC9为出发菌株，经过紫外线、氯化锂、甲基磺酸乙酯（EMS）等物理化学诱变剂多重诱变处理，获得了抗葡萄糖阻遏的突变株E2-26、E5-65、U6-31和EU7-22，其CMC酶活与出发菌株相比分别提高至1．7、1．4、1．3、2．0倍．突变株经PDA斜面接种传代5次后产酶性能仍然保持稳定．变株的菌丝、孢子颜色也发生了较大的改变．对突变株EU7-22的形态结构进行了观察，并与出发菌株XC9作了发酵性状的比较，发现其产酶性能有了明显提高．     

鼠李糖脂对两株木质素降解菌产酶能力的影响

研究了生物表面活性剂鼠李糖脂对黄孢原毛平革菌、简青霉产木质素降解酶能力的影响．结果表明,鼠李糖脂对酶活性的影响与鼠李糖脂的浓度、投加形式、菌种及酶的种类有关．0．0065％的鼠李糖脂不同程度地促进了黄孢原毛平革菌产LiP,MnP,简青霉产LiP,漆酶,0．013％的鼠李糖脂可以促进黄孢产LiP,简青霉产漆酶,但却明显抑制了另外两种酶的活性;鼠李糖脂可以使简青霉产MnP的高峰期提前,但不能提高酶活性．通过影响产酶能力,鼠李糖脂使两株菌对木质素的降解率均高于对照样．此外,接种鼠李糖脂产生菌——铜绿假单胞菌的效果达到甚至超过添加鼠李糖脂的促进效果．     

点青霉高产葡萄糖氧化酶菌株的诱变选育

以产葡萄糖氧化酶的点青霉(Penicilium notatum)No.8312为出发菌株,经紫外线诱变处理,对单菌落进行摇瓶选育,在193个突变株中初筛选定3株.进一步对培养基和发酵条件优化试验,复筛得到了一株(No.T111)高产葡萄糖氧化酶的菌株,连续12次对其传代试验,该突变株遗传性状稳定,摇瓶产酶水平达到55.7U/mL,比出发株(36.2U/mL)提高了53.9%.     

洛巴口蘑突变株抑制真菌作用的研究

采用平板和液体试管培养方法,对洛巴口蘑突变株分泌的胞外物质进行抗灰绿青霉、产黄青霉、黑曲霉的测定.结果显示:洛巴口蘑突变菌株具有明显的抗真菌作用,而原始菌株不具此活性,抗真菌物质的应用价值有待进一步研究.     

一株溶磷真菌的筛选及相关促生特性初探

磷是植物生长发育不可缺少的营养元素之一，由于土壤的固定化作用而含量极低，成为限制作物产量的主要因素.溶磷菌能够帮助植物从土壤中将难溶性磷转变为可溶性有效磷.笔者从胡枝子根际土壤中分离筛选出一株高效的溶磷真菌X1,对其菌种进行鉴定，同时对其溶磷能力及其他促生能力进行了测定.结果表明：该株高效溶磷真菌X1经鉴定为斜卧青霉菌属(Penicillium decumbens);对不同难溶性磷酸盐均具有溶解能力，对磷酸钙的溶磷量可达2 003.95 mg·L^-1;具有分泌IAA、ACC脱氨酶及产氨的能力，且具有一定的固氮和降解纤维素的能力，纤维素酶活力为34.41 U·mL^-1.该株高效溶磷真菌斜卧青霉X1具有作为溶磷微生物菌剂的开发潜力.     

聚己内酯降解真菌DSWJ1201的筛选、鉴定及产酶条件优化

采用唯一碳源法从土壤中分离了一株具有聚己内酯(PCL)降解能力的真菌DSWJ1201,对其进行了形态学和分子生物学鉴定,结果表明该真菌为短密青霉(Penicillium brevicompactum);结合单因素实验和正交试验对菌株产PCL解聚酶的条件进行了优化,结果显示出当培养温度为20℃、培养基初始pH值为7.0、装液量为250mL三角瓶装液100mL、PCL质量的浓度为0.6g/L、诱导物(吐温80)体积分数为2.5mL/L、发酵时间为5d时,菌株所产粗酶的酶活力最高.同时还发现菌株DSWJ1201具有耐冷菌的特性,且能够降解表面活性剂吐温80,因此在常温和低温条件下的废弃物处理中具有潜在的应用价值.     

铜绿假单胞杆菌调节基因突变株的分离及特性

铜绿假单胞杆菌ＰＡＯ１经过亚硝基胍诱变获得了弹性蛋白酶缺失的突变株。经弹性蛋白营养琼脂平板法，从１０次独立处理的６００００个菌落中得到７１株该酶缺失的突变株，其突变株对Ｎ－３－氧代己酰－Ｌ－高丝氨酸内酯（ＨＳＬ）诱导物有无反应分成２组。ＰＡＮＯ６７菌株在加入诱导物后能恢复该酶产生，经过菌落形态、生化特征和细胞膜蛋白质成份的分析，除该酶产生缺失外，突变株ＰＡＮＯ６７与亲本菌株ＰＡＯ１相同，结果表明，ＰＡＮＯ６７是弹性蛋白酶操纵子的调节基因发生突变的诱变菌株。     

嗜热侧孢霉2441纤维素酶产酶条件优化及突变株选育

为了提高嗜热侧孢霉2441纤维素酶的产量,对产酶条件进行了优化,测定了酶的特性,对选育抗葡萄糖效应突变株和中温型突变株进行了探索.实验中酶活力测定以微晶纤维素、CMC-Na和水杨苷为底物,DNS法测定还原糖;产酶条件优化采用正交试验设计,以微晶纤维素酶活为指标;通过NTG诱变和UV诱变选育抗葡萄糖效应突变株和中温型突变株.结果表明:产酶条件优化后,嗜热侧孢霉2441的纤维素酶活极显著提高(P0.01);2441的微晶纤维素酶、CMC-Na酶和β-葡萄糖苷酶的最适作用温度分别为60℃、65℃、70℃,最适作用pH值均为5.5,温度高于70℃及碱性条件下,酶活力显著下降;选育的抗葡萄糖效应突变株N20-01,微晶纤维素酶活提高13.203%,CMC-Na酶活提高47.176%,β-葡萄糖苷酶活提高119.517%;选育的中温型突变株U40-03,在32℃培养时与2441在45℃培养时相比,微晶纤维素酶活提高11.411%,CMC-Na酶活提高29.484%,β-葡萄糖苷酶活提高54.759%.     

赖氨酸对果胶酶产生菌Asp.3.396白孢子突变株生长及产酶的影响

果胶酶产生菌Asp,3.396经辐射诱变,筛选出一株白色孢子突变株,该突变株孢子为白色,酶液的色泽较浅,此种突变株性状有利于果品加工工艺,可提高果汁果酒等产品质量,但该突变株生长周期较长,产酶性能不稳定,当培养基内加入赖氨酸后,此突变株生长发育好,产酶期提前,产酶性能稳定,其酶液加入到苹果等五种果实后,显著提高了出汁率,并对草莓和柑桔果实的果汁澄清度也有所提高。     

青霉T24-2降解甘蔗渣产糖试验的条件优化研究

青霉（Penicillium sp.T24-2）能利用甘蔗渣固态发酵产纤维素降解酶。介绍了在影响青霉T24-2降解甘蔗渣产糖实验的条件下,用方差分析对实验的数据进行分析和处理,确定最佳实验条件,从而达到优化实验条件的目的。     

青霉素G酰化酶调节基因定点诱变的研究

构建了大肠杆菌中青霉素G酰化酶（PAC）的调节基因（pacR）翻译起始密码定点突变株。对突变后PAC的表达调控特征进行了研究，结果表明：突变株的pac基因表达后能正常加工成24ku、65ku的α亚基和β亚基；突变后，虽然PAC表达仍需要苯乙酸诱导，但是，可诱导性提高，形成低组成型表达，无葡萄糖有分解代谢物阻遏效应，因而pacR对PAC表达水平存在着影响，pacR基因是葡萄糖以及它的分解代谢物在分子水平上影响PAC表达的另一作用因素。采用突变株进行发酵生产中，PAC产量较亲株提高3倍，而且可以采用葡萄糖作为碳源，有利于改善PAC的生产。     

脂肪嗜热芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)的耐糖突变研究

1981年我们报导了一株能诱导产生α-半乳糖苷酶的脂肪嗜热芽孢杆菌T59,发现在含有0.5%以上的葡萄糖的牛肉膏培养基上培养时,不但α-半乳糖苷酶的诱导合成受到阻遏,而且细菌的生长也受到抑制.我们通过亚硝基胍对T59的诱变处理,选出了N-34菌株.N-34对葡萄糖仍为敏感.从N-34再进行诱变,获得了一株在含有1%葡萄糖的牛肉膏培养基上能很好地生长的菌株N-3468.在含葡萄糖的牛肉膏培养基上生长时,α-半乳糖苷酶的诱导合成并不受到阻遏.葡萄糖对细菌的生长抑制以及耐糖突变过去未见文献报导.本文对这一现象的本质进行了研究,比较了N-34和N-3468两菌株在形态及生理性质上的异同.     

斜卧青霉P6木素过氧化物酶的褐煤降解活性及cDNA克隆

对纯化得到的斜卧青霉P6分泌的木素过氧化物酶的褐煤降解活性进行了研究,发现纯酶的褐煤降解活性依赖于 H₂O₂ 的激活。降解后产物中小分子黄腐酸含量显著提高,褐煤及降解产物的经验分子式分别为 C₁₀₀H_86.5O_36.5N_2.09 和 C₁₀₀H_103.9O_48.6N_11.4,降解产物比原褐煤具有更高的 H、O、N 含量,而 C 含量明显下降。并且降解产物可提高豌豆种子的发芽率并明显缩短发芽时间。根据 N 末端氨基酸序列设计特异性引物,利用 RT-PCR 方法扩增得到一条约 2000 bp 的 cDNA 片段,序列测定的大小为 1956 bp,通过序列比对,与已报道的 Piloderma croceum 菌的 mnp2 基因具有 45％ 的同源性,具有过氧化氢酶的保守氨基酸残基。