蓝藻基因表达载体系统的构建和应用

蓝藻是一类具植物型放氧光合作物特性的原核生物。多数蓝藻富含营养物质,无毒,是表达外源目的基因的独特受体系统。因此,构建适用于蓝藻表达外源目的基因的载体系统,并用于表达药物活性肽基因,已成为当前蓝藻基因工程研究的热点之一。本课题组10多年来率先在国内开展蓝藻基因工程研究,从蓝藻Plectonema botyanum中分离得到了约1.5kb的小质粒,以此为出发质粒,构建了蓝藻穿梭质粒pPRS-1和穿梭质粒表达载体pPKE2;同时根据DNA片段同源重组的性质,构建了蓝藻Calothrix sp.PCC7601、Synechococcus sp.PCC7942的基因整合平台系统。在国家863项目经费资助下,利用构建的蓝藻质粒载体和基因整合平台系统,把人源胸腺素基因转入蓝藻Calothrix sp.PCC7601和Synechoccus sp.PCC7942,并能高效表达,首次获得了可直接口服的含人源胸腺素的转基因蓝藻,这对研究和开发基因工程口服药物具有重大的科学意义和经济、社会效益。     

新型免疫增强蓝藻作为日本鳗鲡黑仔饲料添加剂的实验研究

免疫增强蓝藻是把胸腺素α1(Tα1)基因转移到蓝藻-聚球藻PCC 7942(Synechococcus sp.PCC7942)染色体上后获得稳定表达的转基因蓝藻,经小鼠实验初步表明其有生物学活性并且口服有效.本实验采用该免疫增强蓝藻饲喂日本鳗鲡(Anguilla japonica)黑仔,并采集分离了一种养殖鳗鱼流行性发病弧菌(Vibrio sp.),对饲喂了免疫增强蓝藻的黑仔鳗进行感染试验.实验表明饲喂添加免疫增强蓝藻的饲料后,黑仔鳗各检测组织器官Tα1含量显著提高,免疫增强蓝藻提高了试验鱼的免疫能力,增强了抗逆、抗病菌感染能力,并具有一定的促生长作用.免疫增强蓝藻作为鱼类饲料添加剂适口性好,适宜添加量为(0.5～1)×10-6左右.     

集胞藻PCC6803基因ssl1690缺失突变株的构建

使用BLAST软件对聚球藻PCC7002的裂合酶基因cpcT进行了同源搜索分析,在集胞藻PCC6803中获取了相似程度达68%的同源基因ssl1690.为进一步探讨ssl1690功能,构建了同源缺失突变载体,将其转入蓝藻细胞中,筛选得到基因缺失突变株,并将基因缺失突变株培养于BG11液体培养基中,观察了其生长情况和表型变化.结果表明:基因缺失突变株与野生株相比,生长有所延迟,有漂白现象.通过分离和比较SDS-PAGE电泳突变株与野生株的藻胆体蛋白,发现缺失株存在藻胆体组分蛋白的缺失.故认为集胞藻PCC6803 ssl1690基因功能与光合作用有关,其所编码的蛋白对藻蓝蛋白正常的体内生物合成具有重要作用.     

蓝藻光合基因psaC在酵母中的转化和表达

聚球蓝藻（Synechococcus sp.PCC 7002）的psaC是光系统I的FA/FB脱辅基蛋白基因,其分子量8.9kD蛋白中含有2个4Fe-4S中心,构建了psaC基因的表达载体pYES2-psaC,将表达载体转化到酵母（Saccharomyces cervisiae）中,Southern杂交证明psaC基因已被转化,诱导培养后的蛋白电泳显示psaC基因获得高效表达。     

含Cry1Ab/Ac基因的白僵菌工程菌的构建

以来源于苏云金芽孢杆菌的Bt-Cry1Ab/Ac基因为目的基因,以潮霉素Hyg为抗性标记基因,以绿色荧光蛋白基因GFP为报告基因的真菌表达载体,采用农杆菌介导真菌遗传转化(ATMT)法,将Cry1Ab/Ac基因插入白僵菌基因组中,先后用潮霉素B抗性筛选、荧光检测、真菌基因组PCR分子检测法、Bt-Cry1Ab/Ac基因检测试纸条多种方法进行转基因工程菌株鉴定,结果证实了目的基因成功插入白僵菌基因组,为白僵菌杀虫活性的深入研究奠定了基础.     

趋磁螺菌AMB-1磁小体合成相关基因的克隆及功能分析

为了更清楚的了解趋磁螺菌产磁小体的合成机理和调节途径,用Tn5转座子诱变的方法筛选得到了2株磁小体合成降低的突变株,并克隆了突变株中被插入失活的基因,分别为编码ABC型Fe3+转移系统中的离子结合蛋白的amb3385基因和功能未知的锄b3672基因.互补实验表明携带amb3385和amb3672基因的广宿主载体可以不同程度地恢复突变株中磁小体的合成,证明了D.schuler关于磁小体合成假说的第一个步骤,即Fe3+从胞外向经由Fe3+转运蛋白运输至了胞内.由于amb3672基因比对时未发现特殊相似基因,其功能尚需进一步研究.     

lat基因的失活在提高棒状链霉菌棒酸产量中的应用

利用lat基因突变的重组质粒pKCLHS对紫外诱变的克拉维酸（Clavulanic acid）高产菌株Streptomyces clavuligerusB71—14的胁基因进行了插入失活，对获得的基因突变子进行了PCR验证、菌体生长测定、发酵特征测定，并对发酵液申的克拉维酸进行了初步提取和含量测定．结果表明，突变菌株的lat基因申插入了含有阿泊拉抗性的基因片段，突变菌株的生长速度与原始菌株无明显变化，甜突变菌株的克拉维酸产量最高能达到其原始菌株的1，11～1．29倍，产头霉素C的能力显著降低．     

基于转座子策略提高链霉菌中landomycin E产量的研究

【目的】对影响放线菌链霉菌Streptomyces globisporus产landomycin E(laE)的代谢网络进行研究,以提高次生代谢物的产量。【方法】通过构建含强启动子和抗性标记的转座子Tn7为基础的转座子,整合至S.globisporus的染色体产生突变库,筛选高产量的突变株并对其代谢网络进行研究分析。【结果】利用构建好的Tn7-转座子连续转化链霉菌S.globisporus,经过数轮的突变和筛选,得到6株产量有较大改变的突变株,对整合位点的亚克隆和测序结果表明,该位点整合导致编码类似细菌的某些调节因子如TetR和GntR家族的蛋白的基因失活。【结论】所构建的经过修饰的微型Tn7-转座子不仅带有抗性标记且有启动子,可插入链霉菌染色体产生突变,进而提高次生代谢物laE的产量,同时也证明,转座子基载体可应用于非模式菌链霉菌。     

趋磁螺菌AMB-l磁小体合成相关基因的克隆及功能分析

为了更清楚的了解趋磁螺菌产磁小体的合成机理和调节途径,用Tn5转座子诱变的方法筛选得到了2株磁小体合成降低的突变株,并克隆了突变株中被插入失活的基因,分别为编码ABC型Fe3+转移系统中的离子结合蛋白的amb3385基因和功能未知的amb3672基因.互补实验表明携带amb3385和amb3672基因的广宿主载体可以不同程度地恢复突变株中磁小体的合成,证明了D.Schüler关于磁小体合成假说的第一个步骤,即Fe3+从胞外向经由Fe3+转运蛋白运输至了胞内.由于amb3672基因比对时未发现特殊相似基因,其功能尚需进一步研究.     

三角褐指藻PPDK基因RNAi载体的构建和基因枪转化

三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)的全基因组序列已经公布,为了把RNAi的技术应用于三角褐指藻的相关研究中,以C4途径关键酶丙酮酸磷酸二激酶基因(PPDK)为试验对象,构建了用于表达与PPDK部分序列同源的发夹RNA(hpRNA)的载体pPPDKi,并用基因枪方法成功将PPDKi和Zeocin抗性基因sh ble共转化到三角褐指藻细胞中.摸索出的较优基因枪转化的条件为:使用50%海水f/2培养基预培养的藻进行微粒轰击,轰击压力10.5 MPa,钨粉直径1.0 μm,轰击距离6.5 cm.PCR 检测结果表明,在Zeocin筛选的阳性藻株中约有60%同时整合了PPDKi序列.将其中6株共转化的转基因藻与野生型藻的生长速率进行比较,发现它们的生长受到4.6%～10.7%的抑制.这可能是PPDKi的表达影响了丙酮酸磷酸二激酶(PPDK)的活性,从而进一步影响了三角褐指藻的生长,但也有可能是外源片段的插入影响了其他基因的正常表达,导致细胞活动异常.     

外源基因的导入对Synechococcus sp.PCC7942 SOD活性和同工酶谱的影响

外源DNA导入Synechococcus sp．PCC7942后．通过NBT光化还原和PAGE电泳检测发现转基因藻Synechococcus sp．PCC7942的SOD活性和同工酶谱发生了改变．若外源基因整合在受体细胞染色体DNA上，根据整合位点的不同则能提高或减弱Synechococcus sp．PCC7942的SOD活性，同时增加同工酶谱带．若外源基因不是整合在染色体上而是以质粒的形式存在，则只改变Synechococcus sp．PCC7942 SOD活性而不影响其同工酶谱．     

Polycistronic strategy for cyanobacterial expression vector construction: Co-transcription of a human gene and a selective marker gene

A polycistronic expression vector, pKGA-NTF1, was constructed for the cyanobacterium. Within this vector, the spectinomycin/streptomycin resistance gene (aadA) facilitated the selection of transformants when co-transcribed with favorite genes. A natural glnA gene was selected as the platform to introduce the plasmid into a neutral site of the Synechococcus sp. PCC 7002 chromosome. Function of the vector was demonstrated by the insertion of a modified human Trefoil factor 3 gene (NTF1) to upstream of the aadA gene and by the analyses of the transformed strains. Antibiotics resistance assays showed that the dicistronic expression cassette conferred high spectinomycin resistance to both the E. coli cells and the Synechococcus cells. PCR analysis and Western-blot analysis were carried out to confirm the integration and expression of the NTF1 gene, respectively. Through simple molecular manipulations, the artificial polycistronic structure described here can be conveniently used to express other favorable genes or operons in cyanobacteria, and to study the cyanobacterial gene expression as well.     

铁限制诱导对聚球藻转录组的影响

为探究Fe元素限制对聚球藻转录组的影响,该文以聚球藻Synechococcus sp. PCC 7002为研究对象,采用高通量测序技术对经过铁限制处理的聚球藻Synechococcus sp. PCC 7002进行转录组分析.以铁的3种摩尔浓度进行处理,其中每组数据重复3次实验,一共获得9组实验数据; 对照组摩尔浓度为10.900 nmol·L^-1,铁限制组摩尔浓度分别为0.410、0.003 nmol·L^-1.实验发现:在铁限制环境下,聚球藻通过增加对胞外铁摄取、上调光合作用相关蛋白的表达和调整代谢通路来应对缺铁环境,且铁限制程度与差异基因数量成正相关关系.此外,在强缺铁时通过下调CRISPR系统中某些核酸酶的表达来影响聚球藻抵御外源病毒感染的能力,其转运磷酸基团ABC转运蛋白表达水平下降,从而极大地影响了聚球藻的生存.     

根癌农杆菌介导的异角状拟盘多毛孢菌转化系统研究

以携带潮霉素B磷酸转移酶抗性基因(hph)的pBHt1作为转化载体,根癌农杆菌AGL-1作为转化介体,实施转化异角状拟盘多毛孢菌。研究发现,异角状拟盘多毛孢菌的最优转化体系为:异角状拟盘多毛孢菌分生孢子悬浮液浓度为1×106个/mL,根癌农杆菌OD600为0.3,共培养时间48 h,共培养温度为25℃,诱导培养基中乙酰丁香酮(AS)浓度为200μmol/L,选择培养基添加250μg/mL潮霉素B、250μg/mL头孢噻肟钠。1×106个异角状拟盘多毛孢菌分生孢子可以产生200～300个转化子,随机挑选10个转化子进行PCR检测,均能扩增出预期条带,且在不含潮霉素B的PDA培养基平板上转化子连续培养5代后,hph基因仍能稳定遗传,这表明T-DNA已经插入到异角状拟盘多毛孢菌的基因组中。此次建立的异角状拟盘多毛孢菌的转化体系可为该病菌的功能基因研究和寄主与病原菌的互作研究提供有效的工具。     

鱼腥藻铁吸收调节蛋白基因(alr0957)的克隆和表达

依据CyanoBase提供的鱼腥藻PCC7120 furC基因(alr0957)的序列信息设计了一对特异性引物,用Touch-down PCR的方法从基因组DNA中扩增得到大小约450bp的目的片段.通过TA克隆的方法将该片段连接到pMD18-T载体上筛选出重组质粒pMD18-T-fur,然后进行双酶切,纯化furC基因,再连接到原核表达载体pET-28a(+)上,转化表达菌株BL21(DE3).经PCR、双酶切和测序鉴定,对阳性菌株进行IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测重组蛋白.结果表明:在25℃条件下经1mmol/L IPTG诱导20h,融合蛋白被成功表达,其分子量约为19 000,为进一步纯化蛋白和对基因的调控功能方面研究奠定了基础.     

B群脑膜炎球菌lpxL2基因敲除突变株的构建及初步鉴定

 应用基因敲除技术的方法和原理,通过PCR扩增B群脑膜炎球菌lpxL2基因及载体pGBK T7上的Kan抗性片段,lpxL2片段与puc-18载体连接得到重组质粒msb-puc,以重组质粒msb-puc为基础,分别通过反向PCR和酶切2种方法构建lpxL2基因中间片段的缺失,并在缺失位点连入Kan抗性表达盒,从而得到重组质粒mpK,mpK转化B群脑膜炎球菌,并用PCR的方法对转化子进行初步筛选鉴定,初步确定突变株1株.本研究通过基因敲除MenB中LPS合成途径相关基因lpxL2的方法,降低LPS毒性,为B群脑膜炎球菌OMV疫苗的研发做了铺垫.     

鱼腥藻PCC7120α质粒上的parD/E同源基因all7155/asl7156的克隆及表达

为研究鱼腥藻PCC7120质粒上毒素抗毒素系统的蛋白质性质和相互作用,根据NCBI中PCC7120的α质粒上的all7155和asl7156基因数据,通过降落PCR克隆了目的基因(all7155/336 bp,asl7156/258 bp).将目的基因片段连接至p MD18-T构建了克隆载体,蓝白斑筛选了阳性克隆,经双酶切纯化后将目的基因连接至表达载体p ET30a(+),并转入表达菌BL21中,测序后证实构建成功,并利用IPTG诱导进行了表达.通过NCBI的BLAST蛋白比对,发现了all7155和asl7156与已知的Par D/E毒素抗毒素系统同源,可通过对此基因的克隆,表达和蛋白性质来进一步认识Par D/E系统.     

Effects of Chlorophyll Availability on Fluorescence Components of Photosystems in the ORF469-Deletion Mutant of Cyanobacterium

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