利用KS基因筛选Ⅱ型聚酮类化合物产生菌的方法研究

根据酮基合酶编码基因(ketoacyl synthase,KS)的同源性设计简并引物,并利用PCR技术快速筛选携带聚酮类化合物编码基因的放线菌菌株.试验筛选了33株放线菌菌株,检测获得PKSⅡ型阳性菌株16株.克隆并测序获得16条KS基因序列,进行BLAST同源性比对,与GenBank中已知的KS基因序列的相似度在89%~99%之间.提交GenBank,获得的各菌株KS基因登录号为FJ620885~FJ620889,FJ620892,FJ878801~FJ878810.抑菌实验表明,携带KS基因的16株放线菌中,13株具有抑制真菌活性,2株具有抑制革兰氏阳性细菌活性.系统进化树分析表明16株放线菌可以分为7个类群,其中,具有产生新型聚酮类化合物潜力的菌株8株,说明筛选出的KS基因具有一定的多样性.结果表明,利用PCR技术可以快速有效筛选Ⅱ型KS基因,为生物资源的开发利用奠定基础.     

内生放线菌A00122中germicidin生物合成基因的克隆

在植物和细菌中,Ⅲ型聚酮合酶能够产生种类多样的次生代谢产物.在药用植物内生放线菌A00122的发酵产物中,分离到了一个已知的Ⅲ型聚酮类化合物germicidin.对A00122菌株建立了基因组文库,根据已知的同源基因Sco7221设计引物作为探针对文库进行PCR筛选,并通过Southern杂交的方法从阳性克隆5-3-10中定位了包含germi-cidin基因的片段,经测序得到长度为1 185 bp的完整合成基因.该基因的获得为深入研究Ⅲ型聚酮合酶的底物选择性,通过定向改造的方法获得非天然Ⅲ型聚酮类化合物提供了重要基础.     

曲张链菌素产生菌壮观链霉菌NRRL2494菌株遗传操作体系的建立

曲张链菌素属于安莎类抗生素,具有显著的生物活性.在从壮观链霉菌NRRL2494菌株的发酵产物中分离和鉴定了多组分曲张链菌素的基础上,探索和优化了外源DNA通过接合转移进入壮观链霉菌NRRL2494菌株的操作方法和培养条件.以游离型质粒pJTU1278为载体,在体外构建了一个曲张链菌素酰胺合酶基因svaF敲除的质粒,通过接合转移转入到壮观链霉菌NRRL2494野生型菌株中,所获得的svaF基因缺失突变株失去了产生曲张链菌素的能力.该遗传操作体系的成功建立和优化,使得在体内分析和鉴定曲张链菌素生物合成基因的功能成为可能,同时也为建立其他类似放线菌的遗传操作体系提供了参考.     

菌落PCR方法的建立及其与常规PCR方法的比较

为建立一种快速、经济、敏感的PCR检测方法,以直接检测出环境、海产品等中的靶基因,通过PCR扩增已知携带tlh和tdh基因的副溶血弧菌标准菌株,并和常规PCR方法比较,初步建立了菌落PCR技术;再以副溶血弧菌标准菌株为阳性对照,以本实验室自海洋环境中分离得到的数株野生菌株为检测对象,采用新建立的菌落PCR以及常规PCR方法对它们进行扩增比较,进一步证明了菌落PCR技术检测携带相关基因菌株的可靠性．通过比较,发现菌落PCR和常规PCR的结果相当一致,两种方法均能扩增出阳性对照标准菌株中tlh和tdh基因．     

抗农作物病原真菌微生物的筛选及其聚酮合酶基因的分析

以5种农作物病原真菌为指示菌,从湖北省神农架地区的土壤中筛选得到1株抗真菌放线菌,命名为ⅡR21菌株.经过形态观察、培养特征、生理生化分析和16S rDNA序列同源性分析,初步鉴定该菌株属于链霉菌属.发酵液稳定性研究表明：ⅡR21菌株发酵液在－20℃～80℃范围内具有较强的稳定性;在pH 4.0～7.0范围内,ⅡR21菌株发酵液的抑菌活性比较稳定;紫外光照射对发酵液的抑菌活性没有影响.对放线菌ⅡR21菌株中Ⅰ型PKS基因族中KS基因进行PCR扩增和分析,与其他KS序列相似性比较低,与其系统分类最近的Streptomyces natalensis相似性达77%.     

Geobacillus sp. POT5 α-淀粉酶基因的克隆及表达

从高温环境土壤中分离到1株能在75℃生长并产生α-淀粉酶的菌株(POT5),扩增了其16Sr DNA核苷酸序列,序列分析表明该菌属于Geobacillus属.根据该属全基因序列测定数据中推定的α-淀粉酶基因,利用PCR方法从G.sp.POT5基因组中扩增得到该菌α-淀粉酶基因(amyP).序列分析表明该基因全长1.545 kb、G+C含量51.33%,编码514个氨基酸.构建重组表达质粒pET22b(+)-amyP,转化Escherichia coliBL21系统,表达产物经SDS-PAGE分析、活性染色及淀粉酶活力分析,表明amyP基因得到了表达,且产物具有生物学活性.     

喀斯特地貌高海拔自然保护区土壤放线菌多样性研究

为了揭示贵州喀斯特地貌高海拔读取土壤放线菌多样性,通过在贵州喀斯特地貌高海拔自然保护区采集土壤,对放线菌进行分离、提纯和培养;并对已获得的放线菌菌株的16Sr DNA、18Sr DNA、ITS以及26S通过引物进型PCR扩增,扩增后行进DNA序列测定以及菌株鉴定。结果表明:该区域土壤中包含了1株为疑似新型放线菌、1株为链孢囊菌属,为较稀有菌属。4株为拟诺卡氏菌属,11株为链霉菌属、为常见菌属。此次研究初步揭示了贵州喀斯特地貌高海拔地区土壤中放线菌多样性。     

3-酮基嘌呤还原酶(TSC10)表达载体的构建及其在毕赤酵母中的表达

目的：Tsc10基因所编码的3-酮基嘌呤还原酶是酵母中神经酰胺合成的重要因子,本文研究从酵母中提取神经酰胺经济、便捷、高效的方法。方法：1.利用构建含有tsc10基因的毕赤酵母GS115表达载体pPIC3.5K-tsc10。2.电转化法将该表达质粒转化到GS115感受态细胞中。3.用G418筛选以及PCR鉴定。4.使用qRT-PCR和SDS-PAGE进行检测。结果：经过G418筛选以及PCR鉴定后确定获得了包含tsc10基因的毕赤酵母转化子,经过qRT-PCR和SDS-PAGE进行检测后发现tsc10基因在20个阳性菌株中均可以稳定、高效表达。结论：本方法成功构建了3-酮基嘌呤还原酶高表达的毕赤酵母菌株,并为后续获得高收率神经酰胺奠定了基础。     

利用抗生素耐药性突变技术筛选抗菌活性放线菌

利用抗生素耐药性突变,从12株天然无抗菌活性或活性微弱的放线菌中筛选活性菌株,共获得752株突变菌株.通过抑菌活性测定,筛选得到一株野生放线菌J22耐庆大霉素突变菌株,编号为J22-G6.该突变菌株具有强烈的抗细菌活性和较好的传代稳定性.该突变菌株在菌株形态方面与原始菌株有一定的差异.试验证明突变菌株J22-G6具有更强的耐受庆大霉素的能力.分析初步推定J22-G6所产生的抗菌活性物质为聚醚类化合物.     

21日龄鸡胚中金黄色葡萄球菌的PCR检测

为检测某鸡场21日龄鸡胚金黄色葡萄球菌感染情况, 针对其特有的耐热核酸酶基因(Nuc)设计并合成1对引物进行PCR扩增, 建立特异性检测金黄色葡萄球菌的PCR方法. 对18个21日龄鸡胚培养、分离, 获得18株疑似金黄色葡萄球菌菌落. 用建立的PCR方法对18份疑似样品进行扩增获得4份金黄色葡萄球菌的阳性扩增, 证实该鸡群21日龄鸡胚中金黄色葡萄球菌的感染率为22%(4/18). 本文中基于Nuc基因建立的PCR检测方法是检测鸡胚中金黄色葡萄球菌快速、特异的分子生物学方法.     

5S及16S rDNA序列PCR扩增用于环境军团菌检测

军团菌病（Ｌｅｇｉｏｎｎａｉｒｅｓ’ｄｉｓｅａｓｅ）是一种严重的空气传播疾病,在世界各地都常有报道,是由军团菌（Ｌｅｇｉｏｎｅｌａ）引起,该菌迄今已鉴定出了４４个种,其中１８种具致病性,最常见的导致严重病症的种有嗜肺军团菌（Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ...     

广西北部湾局部海域海洋沉积物细菌多样性及生物活性评估

为有效探究海洋新型天然微生物资源,本研究以广西北部湾局部海域海洋沉积物样品为研究对象,采用高通量测序技术和纯培养分离方法分析海洋沉积物样品中细菌群落组成及多样性,利用双层琼脂扩散法检测纯培养菌株的抗菌活性,通过PCR扩增法筛选基因组中含有7种功能基因的阳性菌株。高通量测序结果显示：海洋沉积物中检测到1407个操作分类单元（Operational Taxonomic Units,OTUs）;在门水平上,变形菌门（Proteobacteria）的物种丰度最高,其次是厚壁菌门（Firmicutes）和酸杆菌门（Acidobacteria）。纯培养分离纯化鉴定出278株菌,分布在3门5纲16目24科31属,其中YIM 150853为1个潜在新分离单元。生物活性评估实验表明,76.34%的纯培养菌株至少对1种指示菌有抑制作用,其中链霉菌YIM 150601、YIM 150634抑菌谱广、抑菌活性强,放线菌的功能基因检出率高于非放线菌。广西北部湾局部海域海洋沉积物中蕴藏着丰富的细菌资源,纯培养菌株具有抗菌及合成生物活性产物的潜力,是开发新型天然产物的新菌源。     

实验动物常见支原体荧光定量PCR检测方法建立

目的 建立能对实验动物常见支原体进行检测的荧光定量PCR方法。方法 针对多种大、小鼠易感支原体的16 s rRNA基因中较保守的区域设计1对引物和探针,建立荧光定量PCR方法并检测其特异性、灵敏性及重复性。结果 该方法在模板浓度为5×100～5×106 copies/μL之间呈良好的线性关系(R2=0.9972)且扩增效率为98.11%;特异性强,能够区分检测金黄色葡萄球菌等常见的病原菌;灵敏性高,检测下限为5 copies/μL,比常规PCR的检测灵敏性高100倍;重复性好,对不同浓度模板进行组内和组间重复性试验的变异系数均低于2%。用荧光定量PCR和普通PCR方法对不同来源不同类型的120份临床样品进行检测,结果表明小鼠支原体检测阳性率分别为3.33%(2/60)、1.67%(1/60),细胞样品支原体检测阳性率均为5%(3/60)。结论 本研究建立的荧光定量PCR方法快速、特异强、灵敏性高、重复性好,可用于实验动物常见支原体的快速诊断。     

曲霉属产毒真菌DNA的制备及其毒素相关基因aflR的PCR 检测

 研究了用改良的CTAB 法提取曲霉属产毒真菌DNA 的方法,并与试剂盒提取法进行比较。经过改良的CTAB 法能够成功提取出曲霉属产毒真菌的DNA,且浓度和纯度均可达到PCR 扩增的标准。根据合成黄曲霉毒素的aflR 基因设计两对引物,运用PCR 方法进行扩增鉴定,结果表明黄曲霉、寄生曲霉和溜曲霉基因中可检出aflR 基因,烟曲霉和杂色曲霉中并未检出,达到对黄曲霉毒素产生菌进行鉴定的目的。这种方法可为产毒真菌的快速检测提供参考。     

错配PCR对牛X染色体相关基因杂合子的检测

利用DNA测序技术,在荷斯坦奶牛胎儿中找到X染色体基因GLRA2 3'端的杂合位点(C/T),设计错配引物在该位点对胎儿及其父本、母本基因组进行PCR扩增,建立起GLRA2基因的错配PCR技术,该技术可以快速在群体基因组中检测这一杂合位点.     

半套式PCR技术在植物基因克隆中的应用

常规ＰＣＲ方法在分离克隆已知序列的基因中发挥着重要的作用，但要求目的基因片段与引物间的同源性几乎是１００％，一旦引物序列与目的基因间存在有差异，便往往会导致扩增的特异性不强，扩增效率不高，给克隆带来很大的困难．在常规ＰＣＲ基础上，若所分离的基因在不同植物间存在保守序列，依据这一序列再合成一对引物，进行半套式ＰＣＲ则能大大提高扩增的特异性及扩增效率．对于较长的基因片段而言还能同时完成亚克隆．本文依据南瓜ＧＰＡＴ（甘油－３－磷酸酰基转移酶）基因ｃＤＮＡ序列及比较拟南芥菜、豌豆间在该基因内的保守区段序列合成相应引物来分离克隆黑子南瓜及西瓜ＧＰＡＴ基因的ｃＤＮＡ片段为例来说明半套式ＰＣＲ技术在植物基因克隆中的应用     

应用聚合酶链式反应检测犬细小病毒

将具有犬细小病毒病典型症状的病犬肠溶物经ＳＤＳ－酚裂解法提取总ＤＮＡ,并以此ＤＮＡ为模板,通过人工合成的两条２０ｍｅｒ引物进行ＰＣＲ扩增,该对引物扩增的片段为犬细小病毒结构蛋白ＶＰ２基因中间１／３区段,ＰＣＲ产物经琼脂糖凝胶电泳,试验结果表明：用ＰＣＲ扩增检测犬细小病毒具有良好的特异性,应用该方法检测的２７份病犬肠溶物样品块获得了预计长度的ＤＮＡ片段（５３１ｂｐ）,而健康犬的肠溶物样品ＰＣＲ结果为     

番木瓜环斑病毒复制酶基因的克隆和序列分析

用ＲＴ－ＰＣＲ技术从ＰＲＶ－ＡＬ中分离到复制酶（ＲＰ）基因，将基因克隆进载体ｐＵＣ１８，用双脱氧链终止法测定了基因序列，表明其全长为１６０２ｂｐ，与国内外报道的ＨＡ５－１、ＹＫ和Ｓｍ的ＲＰ基因相比，同源性分别达８２．８０％，９５．０７％和９１．８３％．     

32例肿瘤组织中p53基因突变的PCR-SSCP、银染色检测

目的　检测肿瘤组织中 p5 3基因的突变率 ,探索其在肿瘤发展过程中的作用 .建立PCR SSCP检测 p5 3突变的常规方法 .方法　检测 32例癌组织和癌旁组织 .用盐沉淀制备样品DNA ,以p5 3基因exon7设计引物 ,用PCR SSCP结合银染色显示结果 .结果　 32例肿瘤标本检出阳性 9例 ,阳性率 2 8.1% .4例癌组织和癌旁组织均为阳性 .其中 2 2例胃癌 ,检出 4例阳性 (占 18.2 % ) ,双阳性者 2例 .结论　p5 3基因突变在肿瘤中具有普遍性 ,癌组织和癌旁组织双阳性者 ,与肿瘤的扩散有关 .该检测方法简便易行 ,有助于对 p5 3基因突变的扫描检测 .