棉铃虫单粒包埋型核型多角体病毒诱发草地贪夜蛾细胞株Sf的程序性死亡

棉铃虫单粒包埋型核型多角体病毒（ＨａＳＮＰＶ）能够诱发草地贪夜蛾Ｓｆ细胞株发生早期死亡现象．依据死亡过程的细胞形态变化，ＤＮＡ降解的梯状电泳特征以及对不同抑制剂敏感性的差异，可以初步断定该死亡现象为程序性死亡．早期死亡伴随着病毒ＤＮＡ复制与子代病毒生成的中止．同时发现野生型ＡＣＭＮＰＶ的共感染能够有效地抑制早期死亡的发生，并对抑制作用的可能性机制进行了探讨．     

中国锦铃虫核多角体病毒（HeliothisarmigeraNPV）VHA273毒株 …

ＶＨＡ２７３毒株原为ＭＮＰＶ型，经纯系中国棉铃虫扩增而得出约１０％的ＳＮＰＶ，高度纯化两型多角体，温和碱解后，酚法抽提ＳＮＰＶＤＮＡ和ＭＮＰＶＤＮＡ，限制性内切酶ＢｇｌⅡ，ＢａｍＨＩ，ＥｃｏＲＩ和ＨｉｎｄⅢ分别平行酶切两种ＤＮＡ，依次均得出１１，８，１４和１３条电泳带。     

斜纹夜蛾核多角体病毒egt基因的克隆和部分序列分析

用ＡｃＭＮＰＶｅｇｔ基因中的保守区部分片段为探针,通过Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交确定ＳｌＭＮ－ＰＶｅｇｔ基因的位置在ＰｓｔⅠ４９７０ｂｐ和ＸｂａⅠ２６００ｂｐ的片段上．采用双链ＤＮＡ序列分析方法测序,在２６００ｂｐ片段上的ＥｃｏＲⅠ位点两侧得到５９４ｂｐＤＮＡ碱基序列,用计算机ＤＮＡＳＩＳ和ＰＲＯＳＩＳ软件,将５９４ｂｐＤＮＡ碱基序列所推测的氨基酸序列与ＡｃＭＮＰＶ和ＳｌｉＭＮＰＶ的ｅｇｔ基因氨基酸序列进行同源比较,其同源性分别为４５％和８６．５％．     

家蚕核型多角体病毒gp64基因的定位及克隆

以苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒ＡｃＭＮＰＶ的膜表面糖蛋白基因ｇｐ６４作为探针，对经不同内切酶酶切的家蚕核型多角体病毒基因组ＤＮＡ进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交分析，发现ＢａｍＨⅠ酶切产生的４．２ｋｂ和７．６ｋｂ片段呈阳性杂交，经ＤＮＡ片段回收，将４．２ｋｂ片段进行了克隆     

电击法转移含人凝血因子Ⅸ基因重组质粒的影响因素

反转录病毒载体在基因治疗中可能会产生野生型病毒而引起安全性问题，本文研究含ＦＩＸｃＤＮＡ重组质粒基因治疗血友病Ｂ的可能，构建了不具反转录病毒载体结构的两重组质粒ｐＳＣＩＸＴＮ和ｐＣＩＸＴＮ，前者含ＳＶ４０早期启动子和ｈＣＭＶ启动子共同控制的ＦＩＸ ｃＤＮＡ，后者仅含ｈＣＭＶ启动子控制的ＦＩＸｃＤＮＡ，它们都含有ＴＫ启动子驱动的ｎｅｏ基因，通过电击法将基因转移到ＰＡ３１７和ＨＴ１０８０细胞，在ＨＴ１     

硫鱼精蛋白去除OPV中Vero细胞基质DNA的研究

以不同浓度的硫鱼精蛋白（ＰＳ）对Ｖｅｒｏ细胞制备的Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ型脊髓灰质炎口服活疫苗（ＯＰＶ）病毒悬液进行后处理去除细胞基质ＤＮＡ研究．ＰＳ浓度大于１ｍｇ／ｍＬ,纯化后疫苗中ＤＮＡ残余含量低于１００ｐｇ／剂量．随着病毒液中ＰＳ浓度的增加,ＤＮＡ残余含量减少,但病毒回收率亦降低．结果表明ＰＳ沉淀法,病毒回收率高,ＤＮＡ残余含量能达到ＷＨＯ规程ＤＮＡ限量要求,对脊灰病毒ｒｃｔ／４０特征及病毒壳蛋白等生物学性状无显著影响,是Ｖｅｒｏ细胞制备ＯＰＶ简便的纯化方法     

棉铃虫细胞系SFE—HA—8212的克隆化及对HaSNPV受纳性提高的克隆系的建立

用细胞临界生长密度法对棉铃虫蛹卵巢细胞系ＳＦＥ—ＨＡ—８２１２进行克隆化，获得８株克隆细胞系．各株克隆细胞系各自的形态较为均一，但相互间在形态、生长特性、对病毒受纳性等方面有很大差别，其中一株ＣＳ细胞对棉铃虫单粒包埋型核型多角体病毒（ＨａＳＮＰＶ）的受纳性明显高于ＳＦＥ—ＨＡ—８２１２细胞，形成多角体的细胞比率、多角体的产量、游离病毒粒子的产量及多角体蛋白的产量均有提高，是研究和应用ＨａＳＮＰＶ的有效系统．     

芹菜夜蛾核型多角体病毒感染5种昆虫细胞系的研究

用０．５ＭＯＩ的ＳｆａＭＮＰＶ病毒感染液感染５种昆虫细胞系：Ｂｍｅ、Ｐｘ、Ｈｖ、Ｔｎ和ＬｅＨ。结果表明：这５种细胞系对ＳｆａＭＮＰＶ都敏感，感染１４４ｈ后，受染细胞百分率分别是２．８４％、１１．８３％、８％１、６．６５、６．２２和７．０２。电镜观察可见感染细胞核中出现病毒发生基质、病毒粒子和多角体，病毒形态大小分别是：多角体１．４５±０．１０μｍ，病毒粒子３８．１±２．０９×３０６±１４．５ｎｍ，     

棉铃虫细胞系SFE—HA—8212的克隆化及对HaSNPV受纳性提高的…

用细胞临界生长密度法对棉铃虫蛹卵巢细胞系ＳＦＥ－ＨＡ－８２１２进行克隆化，获得８株克隆细胞系。各株克隆细胞系各自的形态较为均一，但相互间在形态，生长特性，对病受毒纳性等方面有很大差别，其中一株Ｃ８细胞对棉铃虫单粒包埋型多角体病毒（ＨａＳＮＰＶ）的受纳性明显高于ＳＦＥ－ＨＡ－８２１２细胞，形成角体的细胞比率，多角体的产量，游离病毒粒子的产量及多角体蛋白的产量均有提高，是研究和应用ＨａＳＮＰＶ的有效系     

人肿瘤细胞株中细小病毒H—1的DNA扩增与非结构蛋白NS—1基因的表达

研究三株人癌细胞和两株对照细胞对细小病毒Ｈ－１杀伤作用敏感性的分子机制．表明了在感染复数ｍｏｉ（ｍｕｌｔｉｐｉｃｉｔｙｏｆｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）为５ｐｆｕ（ｐｌａｑｕｅｆｏｒｍｉｎｇｕｎｉｔ）／细胞的情况下，作为Ｈ—１病毒复制受纳细胞的人肝癌细胞株ＯＧＹ－７７０３和人胃癌细胞株ＳＧＣ—７９０１，能够支持病毒ＤＮＡ扩增和非结构蛋白ＮＳ—１基因的表达，这和作为阳性对照的由ＳＶ４０转化的新生儿肾细胞株ＮＢ—Ｋ一样，但对Ｈ—１病毒感染有抗性的人肾癌细胞株ＯＵＲ—１０和它的对照人胎肾细胞株ＨｕＫ—１，并不支持病毒ＤＮＡ扩增和ＮＳ—１蛋白的表达．本文结果指出，细小病毒Ｈ—１的杀伤作用与细胞中的病毒ＤＮＡ扩增及ＮＳ—１基因表达的程度相关．     

斜纹夜蛾NPV多角体基因的克隆和部分测序

本文对ＳＩＮＰＶ基因组作了酶解分析，测得其基因组大小为１４５ｋｂ，并用双酶法确定了ＳＩＮＰＶ基因组的ＨｉｎｄⅢ和ＰｓｔⅠ物理图谱。以含ＡｃＮＰＶ多角体基因的质粒ｐＡＣ－Ⅰ的ＳａｌＩ－Ｃ片段为探针，对ＳＩＮＰＶＤＮＡ酶切片段ｓｏｕｔｈｅｒｎ转印杂交结果，初步判断多角体基因定位于ＰｓｔＩ－Ｂ／Ｃ／Ｄ片段、ＢｇｌⅡ－Ｃ／Ｄ片段、ＢａｍＨＩ－Ｂ／Ｃ片段和ＥｃｏＲＩ－Ａ／Ｂ片段上，且ＳＩＮＰＶ与ＡｃＮＰＶ多角体蛋白基因有６４％的同源性，而以大肠仟菌质粒ｐＵＣ１９为载体对ＳＩＮＰＶ的多角体基因试克隆，得到带有ＢｇｌⅡ－ＰｓｔⅠ双酶切片段的２个克隆子。对这两个杂交阳性克隆子之一的核苷酸序列测定，表明插入片段与ＢｍＮＰＶ多角体基因上游序列亦有一定同源性。     

中国棉铃虫核多角体病毒VHA273毒株病毒粒子结构蛋白及超微结构的研究

ＨａＮＰＶＶＨＡ２７３毒株的ｓＮＰＶ与ｍＮＰＶ病毒粒子大小为２８０～２７５×６０～１５０ｎｍ,核衣壳大小为３１０～４００ｎｍ×６０ｎｍ．ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析显示,该病毒粒子含有２３种结构蛋白,分子量为１．０～９．２×１０４道尔顿．虽然浓度梯度超离心显现病毒粒子有５条沉降带,但各沉降带的电泳图谱非常一致．说明ＶＨＡ７３的ｓＮＰＶ与ｍＮＰＶ的结构蛋白在分子及亚分子水平上是一致的．     

大肠杆菌β－半乳糖苷酶基因在小菜蛾细胞中的表达

用携带大肠杆菌β－半乳糖苷酶（β－ｇａｌ）基因的杆状病毒转移载体．ｐＡｃ３６０－β－ｇａｌ与苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（ＡｃＮＰＶ）ＤＮＡ经钙磷沉淀法共转染小菜蛾细胞系（ＢＣＩＲＬ－ＰＸ２－ＨＮＵ２,Ｐｘ）,利用Ｘ－ｇａｌ空斑检测分析,β－ｇａｌ基因成功地插入ＡｃＮＰＶ基因组中,得到重组病毒Ａｃ－β－ｇａｌ,重组病毒在Ｐｘ细胞中表达出受ＡｃＮＰＶ多角体蛋白基因启动子控制的具有生物活性的外源基因表达产物──β－ｇａｌ．     

斜纹夜蛾NPVp74基因的克隆及部分序列分析

以含ｐ７４基因的ＡｃＮＰＶＥｃｏＲⅠ－Ｐ片段作探针,与ＳｌＮＰＶ基因组在非严格条件下进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交,将ＳｌＮＰＶｐ７４基因定位于４９００ｂｐ的ＳｌＮＰＶＸｈｏⅠ－Ｐ片段．对ＳｌＮＰＶＸｈｏⅠ－Ｐ片段中的一段９４０ｂｐ的ＤＮＡ片段进行序列测定,通过ｉｎｔｅｒｎｅｔ经ＢＬＡＳＴ与Ｇｅｎ－Ｂａｎｋ中的ｄａｔａｂａｓｅ比较分析发现,序列中的一段２４３ｎｔ序列与ＡｃＮＰＶｐ７４基因有６０％的同源性,一段８１ｎｔ序列与ＡｃＮＰＶｐ７４基因的同源性高达７９％．与ＣｆＮＰＶｐ７４相比,２段２６４ｎｔ和１００ｎｔ序列分别有６０％和７１％的同源性．测得序列中的部分序列与ＢｍＮＰＶ、ＯｐＮＰＶｐ７４基因也有高达５８％～７８％的同源性．同时,这部分序列编码的氨基酸与ＡｃＮＰＶ及ＯｐＮＰＶＰ７４蛋白的氨基酸序列也有很高的同源性．结果表明所测序列的一部分为ＳｌＮＰＶＰ７４蛋白Ｃ－端的编码序列．     

具全期启动子盒的杆状病毒高效表达载体的组建与应用

通过ＰＣＲ扩增，得到苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒（ＡｕｔｏｇｒａｐｈａｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａＮｕｃｌｅａｒＰｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓＶｉｒｕｓ，ＡｃＮＰＶ）具早晚期启动子元件的ｐ３５基因启动子，将其插入到杆状病毒转移载体质粒ｐＳＸＩＶＶＩ＋Ｘ３多克隆位点上游，使之与ｐＳＸＩＶＶＩ＋Ｘ３质粒中的人工合成后期启动子（ＰＳｙｎ）、多角体ＸＩＶ启动子（ＰＸＩＶ）串联构成早期、晚期、极晚期能持续启动外源基因表达的转移载体质粒ｐＳＸ３５．将ｐＳＸ３５用于组建含ＨＢｓＡｇ基因并形成多角体的重组ＴｎＮＰＶ，ＨＢ－ｓＡｇ基因的表达量显著提高，表达时间亦明显提前，从而实现了外源基因在杆状病毒表达系统的全期、高效表达．ｍＲＮＡ引物延伸试验结果显示，Ｐｐ３５在重组病毒中可产生２套转录本，分别于病毒感染的早期和晚期起始ＨＢｓＡｇ基因的表达．     

AcNPV增强子hr5增强HBsAg基因表达的研究

用形成包涵体（ＯＯＣ＋）并能利用人工合成启动序列和多角体ＸＩＶ启动子表达外源基因的转移载体质粒ｐＳＸＩＶＶＩ＋Ｘ３将多角体基因、乙型肝炎病毒表面抗原（ＨＢＳＡｇ）基因和苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒（ＡｃＮＰＶ）的增强子ｈｒ５部分序列同时插入无包涵体的粉纹夜蛾核型多角体病毒ＴｎＮＰＶ－ＳＶＩ－Ｇ基因组中，得到两株高效表达ＨＢｓＡｇ基因又形成包涵体的重组病毒ＴｎＮＰＶ－ｓｈｒ３５－ＯＣＣ＋和ＴｎＮＰＶ－ｓｈｒ２６－ＯＣＣ＋．对重组病毒的酶切鉴定、ＤＮＡ斑点杂交和Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ分析证实，外源基因及其相应的启动子和增强子序列已正确插入病毒基因组中．插入顺序中，ｈｒ５增强子是插入ＨＢｓＡｇ基因下游，多角体基因与ＨＢｓＡｇ基因方向相反．１２５Ⅰ－固相放射免疫检测和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ结果表明，ＨＢｓＡｇ基因在昆虫离体细胞中得到高效表达并保留了抗原活性．ＴｎＮＰＶ－ｓｈｒ２６－ＯＣＣ＋和ＴｎＮＰＶ－ｓｈｒ３５－ＯＣＣ＋表达的ＨＢｓＡ吕蛋白与没有插入增强子序列的重组病毒ＴｎＮＰＶ—ＨＢｓ８５－ＯＣＣ＋的比较，分别提高了４０％和４６％．     

Bcl—2基因加强表达对OA诱发的细胞编程死亡的效应

ＯＡ能诱发人神经母细胞瘤ＳＫ细胞编程互亡，死亡细胞缩小为圆，细胞质凝聚，ＤＮＡ有控降解成约２００ｂｐ左右的片段，且这一过程可由蛋白南合成抑制剂环己酮抑制将编码Ｂｃｌ－２全长蛋白质的ｃＤＮＡ植入ｐＸＪ４ｌｎｅｏ载体中，使其表达由ＨＣＭＶ病毒启动子控制。     

电击法转移含人凝血因子IX基因重组质粒的影响因素

反转录病毒载体在基因治疗中可能会产生野生型病毒颗粒而引起安全性问题，本文研究含ＦＩＸｃＤＮＡ重组质粒基因治疗血友病Ｂ的可能，构建了不具反转录病毒载体结构的两重组质粒ｐＳＣＩＸＴＮ和ｐＣＩＸＴＮ，前者合ＳＶ４０早期启动子和ｈＣＭＶ启动子共同控制的ＦＩＸｃＤＮＡ，后者仅含ｈＣＭＶ启动于控制的ＦＩＸｃＤＮＡ，它们都含有ＴＫ启动于驱动的ｎｅｏ基因，通过电击法将基因转移到ＰＡ３１７和ＨＴ１０８０细胞，在ＨＴ１０８０细胞中的ＦＩＸ表达量分别为２２０、２１２ｎｇ／（１０６细胞·２４ｈ）通过与ｐＣＭＶＩＸ共转染靶细胞，可以增加人ＩＸ因子表达１．５～３．５倍，显示了用质粒载体转染靶细胞在血友病Ｂ基因治疗中是一条潜在可行的途径．本项研究用自制的电击仪转移ＰＡ３１７和ＨＴ１０８０等细胞，最高的转移效率达１０－３，并探讨了细胞种类，ＤＮＡ量，ＤＮＡ结构，电压，脉冲时间与转移效率及表达量的关系．     

利用叶圆片法获得CMV_（CP）转基因烟草植株

利用叶圆片法得到ＣＭＶＣＰ转基因烟草植株ＤＮＡ，ＲＮＡ与ＣＭＶＣＰ放射性标记探针点杂交及Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹杂交的结果表明：ＣＭＶＣＰ基固可整合到烟草转基固株并且表达．叶面病毒接种后，转基因植株对ＣＭＶ病毒具有高抗性．     

人肿瘤细胞株中细小病毒H—1的DNA扩增与非结构蛋白NS—1基因…

研究三株人癌细胞和两株对照细胞对细小病毒Ｈ－１杀伤作用第三性的分子机制，表明了感染复ｍｏｉ（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙｏｆｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）为５ｐｆｕ（ｐｌａｑｕｅｆｏｒｍｉｎｇｕｎｉｔ）／细胞的情况下，作为Ｈ－１病毒复制受纲细胞的人癌细胞株ＱＧＹ－７７０３和人胃癌细胞株ＳＧＣ－７９０１，能够支持病毒ＤＮＡ扩增和非结构蛋白ＮＳ－１基因的表达，这和作为阳性对照的由ＳＶ４０转化的新生儿肾细胞株ＮＢ－Ｋ