P53亚细胞定位变化对POLD1基因启动子活性的影响

POLD1基因编码DNA聚合酶δ（pol δ）的催化亚基．体外实验表明p53能够抑制POLD1基因启动子活性．文中探讨p53是否在细胞内直接与POLD1启动子结合调节POLD1基因表达. 在瞬时转染pEGFP-p53重组质粒的人乳腺癌MCF7细胞中，p53表达增强; RT-PCR结果显示POLD1基因mRNA表达受到抑制． 染色体免疫共沉淀和荧光素酶报告基因实验证明p53在细胞内与POLD1启动子直接结合抑制其启动子活性．荧光显微镜观察发现EGFPp53在G1期进入细胞核而在S期和G2期则被转运至细胞质．在稳定表达的pEGFP-p53细胞系中，细胞周期同步化后POLD1启动子活性在细胞周期各时相均处于较低水平．证明了细胞内p53高表达后通过直接与POLD1启动子结合而抑制POLD1基因表达，且这种抑制作用不受细胞周期进程的影响．     

G1期细胞周期相关蛋白对POLD1基因启动子活性的调控

POLD1基因编码DNA聚合酶δ的催化亚基.然而作为最重要的复制蛋白,目前并不清楚其表达的细胞周期调控机制.研究中运用细胞周期同步化及荧光素酶报告基因测定了POLD1启动子在细胞周期不同时相的活性,结果显示启动子活性随着细胞周期进程而变化,在早S期最高.为进一步确定调控POLD1表达的细胞周期相关因子,应用不同质粒转染MCF7细胞,分别筛选得到稳定细胞系.荧光素酶实验表明增强p53或p21的表达,抑制CyclinE或CDK2的表达都能抑制POLD1启动子活性;而抑制CDK4或Cyclin D1的表达对启动子活性没有明显影响.瞬时共转染实验进一步验证Cyclin E或CDK2受到抑制后能够降低POLD1启动子活性.研究初步探讨了POLD1基因表达的细胞周期调控通路,进一步了解细胞周期因子对DNA复制体调控的复杂机制.     

p21对DNA聚合酶δ表达的抑制及其对MCF7细胞增殖和恶性表型的影响

细胞周期抑制因子p21能影响G1/S期转换和G2/M期进程，进而抑制细胞增殖．p21表达增高可以抑制多个DNA复制相关基因表达．DNA聚合酶δ是DNA复制中最为重要的复制酶，p21是否抑制它的表达，并通过这种作用影响细胞增殖及细胞恶性表型的变化，至今还没有报道．本研究观察到p21表达增强的MCF7p21细胞生长速率变慢，血清依赖性增强，细胞的锚定和非锚定依赖性增殖都受到抑制，表明p21表达增加对细胞增殖和细胞恶性表型的产生有重要作用．而Western blot检测发现在p21表达增高的MCF7p21细胞中，聚合酶δ（p125亚基）表达下降．p21高表达抑制POLD1启动子活性，这种抑制作用具有p21剂量依赖效应．这表明p21表达增高对细胞增殖的抑制和细胞恶性表型的影响可能是通过抑制在DNA复制中最重要的聚合酶δ（p125）的表达来实现的．这可能是p21对细胞增殖及恶性表型影响的一个新的调控机制．     

HMBA对人成骨肉瘤MG-63细胞增殖和相关基因表达的影响

研究了环六亚甲基双乙酰胺对人成骨肉瘤MG-63细胞的增殖和相关基因表达的影响.实验结果表明HMBA可明显抑制MG-63细胞的增殖,细胞生长抑制率达50.69%,分裂指数抑制率达58.8%,增殖细胞核抗原的表达降低,细胞周期被阻滞在G0/G1期.免疫细胞化学染色结果显示,经HMBA处理之后,与增殖分化调控有关的癌基因c-myc、c-fos、c-erbB-2、mtp53的表达降低、抑癌基因p21WAF1/CIP1、p16、rb的表达升高.研究结果表明,HMBA能够有效抑制人成骨肉瘤MG-63细胞的增殖活动,其对细胞增殖的抑制作用与HMBA下调c-myc、c-fos、c-erbB-2、mtp53等癌基因以及上调p21WAF1/CIP1、p16、rb等抑癌基因的表达,从而调控细胞周期有重要关系.     

牡蛎低分子活性肽BPO-L对人肺腺癌A549细胞周期和相关癌基因、抑癌基因表达的调控作用

采用酸抽提、凝胶柱层析等方法,从僧帽牡蛎体内分离提取到牡蛎低分子活性多肽组分BPO-L,以HMBA处理组为平行对照,流式细胞仪检测细胞周期变化及以免疫细胞化学方法检测相关癌基因、抑癌基因表达变化.研究BPO-L对人肺腺癌A549细胞分化的生物学效应,探索其对肺癌细胞的作用机理.实验结果显示,BPO-L能有效抑制A549细胞增殖活动,促使细胞阻滞于G0/G1期.在此过程中,A549细胞c-myc,MTp53等癌基因蛋白表达减弱,p21WAF1/CIP1和Rb等抑癌基因蛋白表达活性的增强.本研究证实BPO-L对肺癌细胞具有显著的诱导分化作用.其诱导癌细胞分化机理与其调节和干预c-myc、MTp53等癌基因与p21WAF1/CIP1和Rb等抑癌基因的表达有关.     

T细胞蛋白p80调控c-Myc表达的机理

为了解p80在正常T细胞以及T细胞癌变过程中的作用,在缺失p80的T淋巴瘤细胞中重新表达p80,其结果显示:原癌基因c-Myc的表达受到显著抑制,且细胞周期在G1期出现了停滞.定量PCR的结果表明:p80对c-Myc表达的抑制是转录水平的抑制.双荧光素酶报告基因试验表明:p80对c-Myc的抑制作用定位于c-Myc启动子上相对于转录起始位点的-1042bp～-630bp区域.运用TFSEARCH软件对这一区域的分析发现存在多个c-Myb结合位点.在稳定表达p80的T淋巴癌细胞中敲低c-Myb,表明p80对c-Myc的转录抑制是通过c-Myb来实现的.免疫共沉淀实验表明p80和c-Myb在细胞中存在相互作用.进一步的研究显示p80对c-Myc的转录抑制依赖于组蛋白去乙酰化酶的活性.研究结果表明p80有可能通过与c-Myb的相互作用将组蛋白去乙酰化酶募集至c-Myc启动子区域,并通过组蛋白的去乙酰化抑制c-Myc的表达.     

乳腺癌中hsa-miR-17-92基因簇及其旁系同源体的共调控作用

hsa-miR-17-92基因簇高度保守,可以作为抑癌基因抑制乳腺癌细胞的增殖.包括2个旁系同源体:miR-106a-363和miR-106b-25基因簇,其序列高度相似,可能通过调控共同靶基因而具有相似的功能.探讨3个基因簇转录的15条microRNA的序列特征,以及共调控靶基因在人类乳腺正常和癌细胞系中的表达;并进一步就显著差异表达基因进行GO和Pathway(KEGG)分析.结果表明,超过75%(178/236)的共调控靶基因表达具有显著差异性,这些基因可能与生物体的细胞代谢、转录后调控、生物合成等多种生物学过程有关,参与细胞周期,癌症等信号通路.分析发现乳腺特异基因PTPN4在乳腺癌中的低表达影响蛋白磷酸化水平和细胞周期,SMAD4、CCND1和E2F1作为与细胞周期相关基因在细胞的G1期起重要作用,它们的低表达阻止细胞从G1期进入S期,从而抑制癌细胞的生长,起到抑癌作用.特别是,一方面基因簇调控CCND1和E2F1使其低表达,另一方面它们作为转录因子结合到基因簇的启动子区诱导基因簇表达,从而形成负反馈调控循环调控下游基因表达.     

p53基因调控网络研究进展

肿瘤抑制基因p53表达的p53蛋白是一个通用转录因子,与其上、下游功能相关基因组成了一个复杂的基因调控网络,在这个基因网络中p53基因起着关键作用;DNA损伤、缺氧、原癌基因的激活等均能刺激p53基因表达;p53表达升高后,可通过p53-MDM2反馈环路与泛素系统等对p53表达水平进行精确调节;p53通过调控多种下游/靶基因表达完成多种生物学功能,主要包括阻滞细胞周期、促进细胞凋亡、维持基因组稳定性等;认识p53基因调控网络的功能有助于理解p53及其下游/靶基因间的具体作用机制。     

KLF4沉默与阿霉素诱导的DNA损伤协同抑制肝癌HepG2细胞的生长

探究KLF4沉默与经不同作用浓度阿霉素处理诱导的DNA损伤对肝癌HepG2细胞增殖凋亡的影响及其作用机制.应用RNA干扰技术,采用siRNA转染HepG2细胞以沉默KLF4基因.采用MTT法检测KLF4沉默前后对HepG2细胞增殖的影响,使用流式细胞术检测KLF4沉默前后对HepG2细胞周期变化影响,应用Western blot法检测转染前后HepG2细胞中KLF4蛋白及细胞周期相关蛋白表达变化.Western blot检测到高浓度的阿霉素促进KLF4的表达,并且低浓度的阿霉素可使得细胞停滞在G2/M期,高浓度的阿霉素则使部分细胞凋亡(19.31%).将KLF4沉默后,发现细胞生长变缓,低浓度的阿霉素处理后,细胞随时间增加而出现更多的细胞凋亡;高浓度的阿霉素处理后,细胞数明显减少,更多的细胞发生凋亡(28.89%),且在KLF4沉默前后均发现低浓度阿霉素促进p53与p21表达,高浓度阿霉素抑制其表达.阿霉素诱导的DNA损伤可提高KLF4的表达,KLF4依赖于DNA损伤激活的p53促进p21的表达,进而引起G1/S期细胞周期阻滞.沉默KLF4与阿霉素诱导的DNA损伤可协同抑制肝癌细胞的增殖、促进凋亡,其在肝癌细胞 HepG2中扮演十分重要的角色.     

AhHDA1影响花生毛状根生长的研究

花生组蛋白去乙酰化酶AhHDA1转到花生毛状根中超表达后,短侧根的毛状根比例增加. 基因表达检测结果显示,AhHDA1超表达后上调了细胞周期相关基因AhCYCD4和生长素信号转导相关基因AhIAA28的表达水平,而AhARF19的表达水平被显著抑制. 进一步通过LUC实验发现, AhHDA1激活AhCYCD4和AhIAA28启动子的活性. 说明AhHDA1可能通过调控生长素信号转导和细胞分裂影响花生毛状根侧根的生长.     

Killin介导p53信号通路的机理与其在细胞周期不同时期特异性分布的相关性研究

本研究中,通过检测killin在其它p53下游相关基因缺失的情况下能否激活细胞凋亡,证明了p53通过killin介导的S期抑制以及细胞凋亡与p21、puma和bax通路没有直接关系.另外通过将EGFP-PCNA和RFP-killin表达质粒共同转染到cosE5细胞中,并观察细胞处于不同时期时Killin蛋白的分布情况,发现在细胞S期中Killin与PCNA的核定位呈现相互排斥的点状分布,与先前BrdU标记结果吻合.这一结果再次印证了Killin在S期可能抑制DNA复制.同时Killin被观察到在非S期时聚集于核仁内,从而可能影响核糖体RNA的合成.这些发现意味着killin作为主要的p53靶基因之一,可能在细胞周期不同检查点进行调控.     

芒果多酚对宫颈癌Hela细胞的抑制作用及机制

用芒果多酚处理人宫颈癌细胞(Hela)后,采用MTT法检测细胞的存活率;Hoechst 33258荧光染色和流式细胞术检测细胞凋亡、细胞周期分布,同时用Western blot检测p53,p21,c-myc,cyclin D1蛋白质水平变化.结果显示：0.025,0.05, 0.1,0.2,0.4 mg/mL的芒果多酚溶液能明显抑制Hela细胞的增殖,并呈剂量和时间依赖性;荧光染色后,大多数细胞内可以看见浓密的荧光颗粒,并出现核收缩;流式细胞术分析发现,与未处理组比较,芒果多酚作用后的G1期Hela细胞数显著增多,G2期细胞数逐渐减少;凋亡率明显高于对照组;Western blot检测显示芒果多酚上调p53,p21蛋白水平,下调c-myc,cyclin D1蛋白水平. 以上结果表明芒果多酚能明显抑制人宫颈癌Hela细胞的增殖,诱导其凋亡.     

血清对人脑胶质瘤细胞株U251基因表达的影响

利用分子原位杂交和定量PCR技术分析新生小牛血清培养和无血清培养的人脑胶瘤细胞株U2 5 1的基因表达 ,发现血清对细胞周期正调控基因cdc2基因和PCNA基因的表达有激活作用 ,而对细胞周期负调控基因 p2 1和 p16基因的表达有抑制作用 .这些事实表明 ,血清刺激细胞生长时 ,一方面要激活促进细胞增殖的基因 ,另一方面要抑制或关闭抑制细胞增殖的基因     

pGL3-4×PRE-E4-luc报告基因质粒的构建及在p44信号通路中的应用鉴定

p53基因是一种重要的抑癌基因,其产物能够与靶DNA特异性结合并激活转录参与诱导细胞凋亡,调控细胞周期,控制细胞的增殖与分化.p44蛋白主要定位于前列腺癌细胞的细胞质,促进癌细胞的增殖.通过shRNA沉默p44的表达后,LNCaP细胞的生长受抑制, p53靶基因TIGAR和GLIPR1的表达增加.为探寻p53是否介导p44对TIGAR和GLIPR1的作用,本研究构建了pGL3-4×PRE-E4-luc报告基因质粒,并将其分别转染经NT-shRNA慢病毒和p44-shRNA慢病毒感染的LNCaP细胞,比较两者荧光素酶活性.结果显示,重组质粒pGL3-4×PRE-E4-luc构建成功,为进一步研究p53在肿瘤发生发展过程中的作用通路提供了新的手段.但LNCaP细胞中p44并非通过p53作用于TIGAR和GLIPR1基因,具体机制仍有待进一步研究.     

MdmX在Axin-p53信号通路中的调控机制

鼠双微体基因X(MdmX)是肿瘤抑制因子p53信号通路中重要的负调控蛋白,它能与p53直接结合,抑制p53的转录活性.体轴发育抑制因子Axin作为构架蛋白与p53及同源结构域互作蛋白激酶2(HIPK2)等相互作用形成复合物,诱导p53的转录活化,共同促进细胞的凋亡.本研究将MdmX引入Axin-p53信号通路的调控中,发现MdmX通过竞争Axin与p53的结合,抑制Axin诱导p53的转录激活.p53结合区域缺失的MdmX突变体MdmXΔp53则不能抑制Axin对p53的激活.这些实验结果为进一步深入研究Axin-p53信号通路在细胞凋亡及肿瘤发生发展中的作用提供了重要的理论依据.     

异丹叶大黄素抑制膀胱癌细胞增殖的功能研究

利用不同浓度的异丹叶大黄素(Isorhapontigenin,ISO)处理膀胱癌细胞株5637后,通过MTT 细胞毒性实验检测细胞增殖活性;用荧光定量RT-PCR 方法检测UCA1 基因表达;采用流式细胞术检测细胞周期的变化以及细胞划痕法检测细胞迁移活性;应用Western blotting检测ISO处理组与对照组细胞的迁移相关蛋白E-cadherin和N-cadherin的表达,最终揭示了ISO抑制膀胱癌的细胞株5637增殖与迁移的分子机制.结果表明:20 μmol/L ISO对膀胱癌细胞株5637增殖具有明显抑制作用,与10 μmol/LISO相比抑制作用显著提高.ISO可抑制膀胱癌细胞株5637 迁移,并通过下调UCA1基因表达诱导G0/G1 细胞周期阻滞从而抑制细胞增殖,且具有剂量依赖性.     

CPUY013对胰腺癌Capan2的生长抑制与诱导凋亡作用

探讨CPUY013对体外培养人胰腺癌细胞Capan2生长抑制及诱导凋亡作用.采用MTT法、克隆原形成法检测CPUY013对Capan2细胞生长的抑制作用,采用流式细胞仪分析CPUY013对细胞周期的影响,Western Blot法检测TopoⅠ、野生型p53、caspase-3、bcl-2和bax蛋白表达的变化.MTT法、集落形成试验结果显示,CPUY013对体外培养的人胰腺癌细胞Capan2有明显的生长抑制作用,处理72 h的IC50值为7.3×10^-7mol/L（MTT法）,CPUY013在8.0×10^-8mol/L浓度可以明显抑制Ca-pan2细胞的集落形成,抑制率为69.6%.同时,CPUY013可剂量依赖地降低Capan2细胞G1期细胞的比例,升高S期细胞的比例,呈现明显的S期阻滞.CPUY013可下调TopoⅠ蛋白的表达,上调细胞中p53、caspase-3、bax蛋白表达,下调bcl-2蛋白表达,并呈剂量依赖性.CPUY013对Capan2细胞具有明显的生长抑制作用,阻滞细胞周期进程,诱导Capan2细胞凋亡,其可能与降低细胞内TopoⅠ蛋白表达,增加p53、caspase-3、bax蛋白表达,降低bcl-2蛋白表达有关.     

PI3K等5条信号通路对NIH3T3细胞周期进程的调节作用研究

为从基因转录水平解析信号通路对NIH3T3细胞周期进程的调控作用,用小鼠基因表达谱芯片Mouse Genome 4 302.0检测信号通路相关基因表达丰度发现,PI3K,STAT3,钙蛋白酶,Rho家族鸟苷酸激酶和VEGF等5条信号通路的105个基因在该细胞的细胞周期中发生有意义的表达变化.分析基因表达变化预示的信号通路作用表明,上述5条信号通路依次促进G1期、G1/S转换期、S期、G2/M转换期和M期进程.结论:上述5条信号通路促进NIH3T3细胞的细胞周期进程.     

对香豆酸抑制肺癌细胞增殖、迁移并诱导其凋亡的机制研究

探究了对香豆酸（p-coumaric acid,p-CA）对人肺癌细胞细胞A549和H1299增殖、凋亡和迁移的影响及作用机制.结果显示,添加0～10 mM p-CA能显著抑制两种肺癌细胞的生长和迁移,并呈剂量和时间依赖性（P<0.001）. p-CA显著抑制了细胞周期发生,并将细胞周期阻滞在G1期,且细胞凋亡发生明显增加（P<0.05）. p-CA显著抑制了CDK2、CDK6、Cyclin D1等周期正调控因子表达,并诱导细胞周期负调控因子p21、p27等基因的表达上调;与此同时,p-CA还诱导了促凋亡因子Bax表达上升和抗凋亡因子Bcl-2表达水平的降低且caspase-3和caspase-9的表达上调,而对迁移相关基因表达的检测结果也显示p-CA抑制了β-连环蛋白（β-catenin）的表达并促进钙粘附蛋白E(E-cadherin)表达上升.上述结果表明,p-CA具有抑制肺癌细胞生长、诱导凋亡并抑制其迁移的作用,它主要是通过促进Bax、caspase-3、caspase-9、p21、p27、E-cadherin等蛋白的表达而抑制Bcl-2、Cyclin D1、β-ca...     

干扰FOS表达对KSHV感染的神经元细胞增殖的影响

目的探讨在卡波氏肉瘤相关疱疹病毒(Kaposi's sarcoma associated herpesvirus,KSHV)感染的神经元细胞中干扰FOS基因表达,对细胞增殖和KSHV病毒的影响。方法采用强力霉素和丁酸钠诱导islk.219细胞的病毒r KSHV.219进入裂解态并提取病毒,采用病毒提取液感染SH-SY5Y细胞,采用荧光显微镜观察GFP确定感染成功,采用real time-PCR检测KSHV感染与未感染SH-SY5Y细胞FOS基因的表达;构建FOS基因的干扰质粒;并与KSHV感染的SH-SY5Y细胞中干扰FOS的表达,采用real time-PCR和Western blot确定干扰效率,采用real time-PCR检测干扰与未干扰细胞中KSHV病毒因子LANA、RTA以及K8. 1的mRNA表达情况,采用MTT法检测细胞增殖能力,PI染色结合流式细胞技术检测细胞周期;结果重组病毒r KSHV. 219能够成功感染SH-SY5Y细胞,FOS基因在KSHV感染的SH-SY5Y细胞中表达上调(P0.05);干扰FOS基因后,FOS基因的mRNA和蛋白表达水平明显降低(P0.05); KSHV病毒因子LANA、RTA以及K8. 1的mRNA表达水平均有降低(P0.05); MTT结果提示,干扰FOS表达抑制了KSHV感染的SH-SY5Y细胞增殖(P0.05);干扰48 h后感染细胞周期被阻滞在G0/G1期(P0.05)。结论 KSHV能够感染神经元细胞SH-SY5Y,干扰FOS表达能抑制感染细胞的增殖,阻滞细胞周期G0/G1期的进程,靶向干扰FOS在KSHV感染引起的神经系统疾病的治疗中具有一定的价值。