TeLCYB基因的番茄遗传转化分析

万寿菊(Tagetes erecta L.)中含有类胡萝卜素,不仅可用于天然色素提取,还是研究类胡萝卜素合成代谢的植物材料。番茄红素β-环化酶(lycopene beta cyclase, LCYB)是类胡萝卜素合成代谢途径中的一个关键酶,文章通过对万寿菊中TeLCYB基因克隆、植物表达载体构建、并利用农杆菌介导法进行番茄遗传转化,获取TeLCYB基因转化番茄植株。分子鉴定和表型分析结果表明,万寿菊TeLCYB基因在番茄中表达,并改变转基因番茄果实颜色。高效液相色谱测定显示,TeLCYB基因的表达显著增加了番茄果实中β-胡萝卜素的量。该文研究结果表明TeLCYB基因具有功能活性,可用于改良植物果实的色素营养品质。     

番茄中一个抗病基因功能的研究

植物中最大的一类抗病基因(R)编码的蛋白质含有卷曲螺旋结构(coiled-coil,CC)、核苷酸结合位点(nucleotide-binding site,NBS)和富含亮氨基酸的重复序列(leucine-rich repeat,LRR)结构域。R基因以抗病著称。文章通过酵母双杂筛选方式获得了DDI3基因,该基因与番茄中重要功能基因DDB1具有相互作用,而又含有CC-NBS-LRR结构,预测具有R基因抗病性,参与植物抗病。研究中构建了DDI3过表达载体并通过根瘤农杆菌介导转化到野生型番茄中,筛选获得DDI3高表达的阳性转基因株系。通过病菌接种实验,观察植株发病情况和统计细菌菌落数,结果发现,转基因植株的抗病性明显高于野生型番茄。DDI3基因对提高番茄的抗病性有很高的价值,为采用基因工程方法改良番茄植株抗病性做出新的尝试,同时又与番茄DDB1基因具有相互作用,对研究DDB1基因在参与植物抗病途径中的功能研究提供新的方向。     

以提高乙肝病毒表面抗原表达量和免疫原性为目的的番茄果实特异表达载体的构建

为了提高乙肝病毒表面抗原基因在番茄果实中的表达量和免疫原性,采用克隆的E8番茄果实特异表达启动子和乙肝病毒表面抗原M蛋白基因构建了植物表达载体pBIES2, 及只含有乙肝病毒表面抗原S蛋白的表达载体pBIES,并将它们分别导入根癌农杆菌LBA4404中.最后对该载体的优越性进行了讨论.     

番茄CDT2同源基因RNA干涉载体的构建及遗传转化研究

真核生物CDT2是CUL4-DDB1 E3泛素复合体的组成部分,在细胞周期调控、DNA复制与损伤修复中起到重要作用.本研究克隆了番茄CDT2同源基因片段并构建了CDT2基因RNA干涉植物表达载体pBI121-CDT2-RNAi.通过根癌农杆菌介导转入番茄子叶,经组织培养成功获得转基因植株.半定量RT-PCR分析显示,转基因植株叶片内CDT2的表达量明显低于野生型植株.转基因植株叶片叶绿素含量比野生型明显升高.该研究结果揭示番茄CDT2基因的功能做出了新的尝试.     

番茄UVR8基因对果实采后贮藏品质的影响

紫外线抗性位点8(UV resistance locus 8,UVR8)编码光受体蛋白，负责UV-B感知和信号转导，被认为参与调控其他的生理反应。文章对UVR8过表达和基因沉默植株的果实进行分析，结果表明：与对照组相比，UVR8过表达转基因番茄果实有着更长的贮藏期，其果实硬度显著高于野生型；对UVR8转基因番茄果实的过氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶(POD)活性进行测定，结果发现过表达番茄果实的CAT、POD的酶活与野生型相比均显著提高，分别是野生型的2.5、2.3倍，而基因沉默番茄果实的酶活与野生型相比显著下降；同时对脂质过氧化指标的丙二醛(MDA)进行分析，表明每g过表达番茄果实中MDA物质的量有所降低，仅为野生型的1/2,而且每g基因沉默番茄果实中MDA物质的量与野生型相比明显升高。由以上结果可推测，UVR8基因在延长番茄果实采后贮藏期中发挥了作用。     

番茄SlWRKY1转录因子在植物生物和非生物胁迫中的调控

克隆番茄SlWRKY1基因,构建植物过量表达载体pBI121-35S∷SlWRKY1并通过农杆菌介导的遗传转化法转化番茄,成功获得3株过量表达的转基因植株.研究发现:转基因植株对丁香假单胞菌番茄变种(Pst DC3000)的感染表现出敏感性,表明SlWRKY1基因可以减弱由Pst DC3000引起的植物防御反应,在相关信号通路中起到负调控作用.同时SlWRKY1转基因植株对盐胁迫表现出抗逆性,在胁迫条件下转基因植物中积累了大量的脯氨酸.推测SlWRKY1基因可能参与番茄脯氨酸代谢调控.     

番茄ACC合成酶基因的反义RNA—核酶嵌合基因植物表达载体的构建及对番茄的转

将克隆的番茄ACC合成酶基因的反义RNA－核酶联合的DNA序列用Hind Ⅲt KpnI切割后重组于植物表达载体pGA643中,用三亲融全导入农杆菌LBA4404中,采用叶盘法转化茄子叶,诱导出再生小植株,获得了卡那霉素的抗性植株。提取植物总DNA,用pGA643作探针,通过斑点杂交,已筛选出整合有外源基因的工程植株。为进一步研究该嵌合基因对ACC合成酶基因表达的影响及获得商品化的转基因番茄奠定了基础。     

丙型肝炎病毒E2基因在转基因番茄植株中的表达

以T-E1E2为模板扩增得到丙型肝炎病毒包膜蛋白基因E2,构建该基因的植物表达载体p35s-E2．通过农杆菌介导的叶盘法转化番茄子叶．转基因番茄植株叶片总DNA的PCR、Southern blot检测结果表明,E2基因已整合进了转基因番茄植株基因组中;RT-PCR,Western blot分析证实E2基因在转基因番茄植株叶片中表达．     

农杆菌介导的抗病基因对番茄的遗传转化

通过农杆菌介导法将含有几丁质酶基因和β-1,3-葡聚糖酶基因的双价植物表达载体pBLGC转入番茄子叶外植体。经过共培养、卡那霉素筛选和分化再生,获得了23株卡那霉素抗性植株。PCR检测和Southern Blot检测结果表明,有7株呈阳性检测反应。通过病原真菌接种试验证明,有3株转基因植株表现出较强的抗病性反应。实验结果为进一步研究番茄抗病性和培育抗病番茄新品种奠定了重要基础。     

农杆菌介导的双价抗虫基因对番茄遗传转化的研究

采用农杆菌介导法将含有苏云金芽孢杆菌毒蛋白基因(CryIAc)与半夏凝集素抗虫基因(Pta)的高效植物表达载体pCAMBIA3300转入番茄品系Micro Tom的子叶外植体中。经过共培养、除草剂筛选和分化再生,获得了24个具有除草剂抗性的株系。再将转化后的番茄植株经过PCR检测和Southern Blot检测,确定检测后呈阳性反应的株系为8个。通过小菜蛾幼虫初步抗性试验证明,转基因株系表现出较强的抗虫性。实验结果为进一步研究番茄抗虫性和培育抗虫番茄新品种奠定了重要基础。     

番茄Pti基因瞬时表达与互作检测

丁香假单胞菌所导致的细菌性斑点病是影响番茄产量和品质的重要病害,而番茄色氨酸苏氨酸激酶(Pto)是植物识别、防御这一病原菌的重要抗性蛋白。文章通过克隆番茄Pti(Pto interaction protein)基因Pti4、Pti5和Pti6,分别构建植物表达载体,利用农杆菌介导方法在烟草叶片中进行瞬时表达和western blotting检测,并进一步利用免疫共沉淀技术,在植物体系中检测了它们与番茄Pto蛋白的相互作用。实验结果表明,利用所构建Pti4、Pti5和Pti6基因植物表达载体,在烟草中获得了预期大小Pti4、Pti5和Pti6蛋白,并在植物体系中验证了它们与Pto蛋白的相互作用。该工作为深入研究Pti基因在番茄分子免疫途径的功能奠定了基础。     

利用番茄U3snRNA基因上游启动区构建植物表达载体及对烟草的转化

利用番茄U3snRNA基因上游启动区和ACC合成酶反义RNA-核酶嵌合基因DNA片段,构建含U3snRNA基因上游启动区-ACC合成酶的反义RNA-核酶嵌合序列的表达载体,重组于植物双元表达载体pGA643中,得到pGU3R.用三亲融合法导入农杆菌LBA4404中,采用叶盘法转化烟草,诱导再生小植株,获得了卡那霉素的抗性植株.提取抗性植株总DNA,通过PCR、PCRSouthern杂交检测并分别用启动区序列和ACC合成酶的反义RNA-核酶嵌合序列作探针,通过Southern杂交检测,已筛选出整合有外源基因的转化植株.为进一步研究U3snRNA上游启动区增强反义RNA-核酶基因的表达奠定了基础.     

Mi基因过表达载体和16D10基因RNAi载体的构建及转化

文中采用PCR技术从番茄中克隆获得了Mi基因,采用反转录PCR(RT-PCR)技术从来源于红橘（Citus reticulate）的根结线虫中克隆获得了16D10基因,采用DNA重组技术构建了Mi基因的过表达载体和16D10基因的RNAi载体,分别命名为pB-Mi和pB-16DR. 通过根瘤农杆菌介导的遗传转化,获得了经PCR检测为阳性的沙田柚转基因植株. 这一结果将为研究Mi基因过表达和16D10基因的RNA干扰对柑橘根结线虫病的抗性影响提供试材和技术支持.     

果实特异表达芪合酶基因的表达载体构建及农杆菌重组

本研究利用基因工程技术构建了附加果实特异表达启动子的芪合酶基因植物表达载体，并通过农杆菌直接转化技术将其转入LBA4404、EHA105，并采用PCR及限制性酶切分析对所获得的农杆菌工程菌株进行鉴定。为利用芪合酶基因转化植物并在食用果实中产生白藜芦醇做准备。     

杀虫晶体蛋白基因CryIA（c）表达载体构建与表达研究

为了检测改造后的ＣｒｙＩＡ（Ｃ）基因在植物中的表达，将其构建成表达载体并采用膛杆力介导的方法导入蕃茄，通过对转基因番茄植株的ＰＣＲ，Ｓｏｕｔｈｅｍ和Ｎｏｒｔｈｅｍ ｂｌｏｔ分析，证实外源ＣｒｙＩＡ（ｃ）基可整合到番茄基因组中，并能顺利表达，为该基因在其它农作物上的提供了依据。     

小白杏自交不亲和S-RNase基因RNAi表达载体的构建及遗传转化

为了应用RNAi技术调控杏自交不亲和性状,根据自交不亲和S66-RNase基因序列(Gen Bank登录中)设计特异引物,通过RT-PCR扩增S66-RNase基因(Gen Bank登录中)高变区及下游(63 bp)作为靶基因,构建RNAi表达载体的ihp RNA。以植物表达载体p CAMBIA为骨架载体,利用农杆菌介导的方法转化本氏烟,利用子房转化法转化小白杏。结果显示:获得了长度为439 bp的ihp RNA。表达载体酶切检验表明S66-RNase基因的RNAi表达载体构建和转入农杆菌LBA4404成功。通过抗性筛选和GUS染色检测,获得了16株阳性植株。结论:获得转基因烟草植株证明了本研究构建的RNAi植物表达载体有效,为诱导杏S-RNase基因转录后基因沉默、获得自交亲和的杏提供参考。     

提高番茄品质的番茄去泛素化酶基因AMSH3

AMSH3酶是去泛素化酶中MPN(+)/JAMM蛋白酶家族的一员,能结合泛素化蛋白上的泛素分子。文章在番茄中发现了一去泛素化酶基因SlAMSH3,与拟南芥去泛素化酶基因AtAMSH3在核酸水平和蛋白水平分别有81%和71%的相似性。拟南芥中去泛素化酶AtAMSH3会影响植物液泡的形成和液泡蛋白的运输途径。文章构建了SlAMSH3果实特异表达的过表达载体,并通过根瘤农杆菌介导转化到野生型番茄中,通过筛选获得SlAMSH3在果实中高表达阳性株系,实时荧光定量聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)分析显示,转基因番茄果实中SlAMSH3的表达量明显高于野生型果实(p0.05)。文章测定了阳性番茄株系绿熟期果实叶绿素质量浓度及红熟期果实的单果质量、果实糖度、果实硬度、番茄红素质量浓度和β-胡萝卜素质量浓度。结果表明,转基因番茄果实的叶绿素总质量浓度、番茄红素和β-胡萝卜素比野生型分别提高178.61%、40.53%和74.86%,其他指标无显著差异。因此,SlAMSH3果实特异过表达的方法能够改良番茄果实品质,为基因工程方法改良番茄果实品质做出了新尝试。