人全长Notch1基因的克隆及其在HEK293 T细胞中的表达

目的:克隆人全长Notch1基因,构建人全长Notch1/p CMV6-Entry真核重组质粒并在HEK293 T细胞中进行瞬时表达.方法:采用PCR公知不认方法扩增人全长Notch1基因并克隆到真核表达载体p CMV6-Entry中并用限制性内切酶分析和DNA测序鉴定重组质粒.将该重组质粒转染HEK293 T细胞24h后,通过实时荧光定量PCR(q-PCR)和Western blot检测鉴定人全长Notch1的表达.结果:成功构建了人Notch1/p CMV6-Entry重组真核表达质粒,人全长Notch1基因在mRNA和蛋白水平上的表达显著高于p CMV6-Entry载体对照组和HEK293 T细胞对照组.结论:克隆获得人全长Notch1基因并验证在HEK293 T细胞中表达.     

DLL3蛋白在人小细胞肺癌细胞中的功能及其机制

为探讨DLL3(human notch ligand delta-like 3)过表达对人小细胞肺癌细胞的影响及可能的作用机制,通过PCR方法扩增人DLL3基因全长序列,并克隆至慢病毒表达载体Lenti-EFS-FLAG-puro而构建人DLL3基因过表达慢病毒表达质粒,酶切及测序鉴定质粒正确。通过慢病毒包装及感染,构建DLL3稳定过表达的人小细胞肺癌细胞株,并通过Western blot验证DLL3蛋白的表达。采用CCK-8法检测DLL3过表达对人小细胞肺癌细胞的增殖的影响。采用平板克隆实验检测DLL3过表达对人小细胞肺癌细胞的克隆形成的影响。Western blot检测DLL3过表达对细胞周期相关蛋白Cyclin D1,Cyclin D3的表达水平的影响。结果表明:人DLL3过表达慢病毒表达质粒构建成功; CCK-8实验显示DLL3过表达促进人小细胞肺癌细胞的增殖。平板克隆实验显示DLL3过表达提高人小细胞肺癌细胞的克隆形成能力。Western blot结果表明DLL3过表达增加细胞周期蛋白Cyclin D1,Cyclin D3的表达水平。可见DLL3过表达对人小细胞肺癌细胞的增殖具有促进作用。     

DJ-1真核表达载体构建及其转染口腔癌细胞的表达

目的:构建人DJ-1真核表达载体pcDNA3.1(+)/DJ-1,并转染人口腔癌细胞系Tca8113,建立含有DJ-1真核表达载体的口腔癌细胞模型。方法:以人HEK293细胞为模板,应用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)法扩增人DJ-1基因全长,与真核表达载体pcDNA3.1(+)重组,经酶切鉴定和测序分析后,通过脂质体介导法转染人口腔癌细胞系Tca8113,并设立空质粒对照组(转染pcDNA3.1空载体)和未转染组,最后采用RT-PCR法检测Tca8113细胞中DJ-1基因的表达情况。结果:RT-PCR法获得长度为500 bp左右的阳性产物,重组质粒后经酶切鉴定和序列分析证实真核表达载体pcDNA3.1(+)/DJ-1构建成功。转染Tca8113细胞后RT-PCR法证实与空质粒组和未转染组相比,转染真核表达载体pcDNA3.1(+)/DJ-1的细胞系中DJ-1基因表达明显增高。结论:成功构建人真核表达载体pcDNA3.1(+)/DJ-1,并建立含有该载体的口腔癌细胞模型,为进一步研究DJ-1基因在口腔癌中的功能及应用DJ-1进行基因治疗奠定基础。     

DLL1-ICD基因真核表达载体的构建及转染鉴定

通过克隆DLL1-ICD(Delta-like1细胞内区域)的cDNA及测序鉴定,构建pEGFP-C1-DLL-ICD真核表达载体并进行细胞转染,为研究Notch信号通路与Neuritin的关系奠定基础。首先根据小鼠全长DLL1 cDNA序列,设计DLL-ICD PCR引物,以小鼠胎脑cDNA文库为模板,利用PCR技术扩增DLL1-ICD cDNA。将扩增出的基因片段克隆至pEGFP-C1载体,进行DNA序列测定。并进一步将测序正确的pEGFP-C1-DLL1-ICD真核表达载体转染HEK293细胞。结果显示:成功克隆了DLL1-ICD的cDNA片段,测序结果与基因文库中的DLL1-ICD序列一致,并在转染真核细胞后获得了较好地表达。表明pEGFP-C1-DLL1-ICD真核表达载体构建成功,并在293细胞中成功表达了DLL1-ICD-EGFP融合蛋白。研究结果为进一步探讨Notch信号通路与神经系统疾病的分子机制奠定基础。     

LC3真核表达载体构建及其在293T细胞中自噬诱导研究

【目的】构建pEGFP-N1-LC3真核表达载体,并将其转染进人胚肾细胞293T,通过Earle's盐平衡液(Balanced salt solution,EBSS)饥饿诱导观察细胞自噬现象。【方法】RT-PCR扩增LC3基因,并将其插入pEGFP-N1真核表达载体构建重组质粒。将重组质粒转染至人胚肾细胞293T,显微镜观察、Western blot检测GFP-LC3融合蛋白表达情况。对转染细胞进行Earle's盐平衡液饥饿诱导,通过Western blot验证自噬指标,激光共聚焦显微镜观察自噬泡形成。【结果】成功构建pEGFP-N1-LC3真核表达载体,并在293T细胞中成功表达目的蛋白,在进行Earle's盐平衡液饥饿诱导后观察到自噬泡的形成,Western blot检测到LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的转化。【结论】本实验为研究自噬在癌细胞病理进程中的机制提供了实验素材。     

pEGFP-C1-MCH真核表达载体的构建及其在HEK293 细胞系中的表达

目的:构建pEGFP-C1-MCH真核表达载体,并将其转染入HEK293细胞中,筛选阳性细胞克隆,为研究MCH基因在能量代谢中的功能及机制提供细胞模型.方法:提取脑组织总RNA,反转录为cDNA,参照Genbank中提供的序列设计引物扩增MCH基因全长.再将该基因全长cDNA克隆至质粒pEGFP-C1,经菌落PCR筛选及双酶切和DNA测序鉴定,成功构建了含有目的基因MCH的重组质粒pEGFP-C1-MCH.并利用脂质体2000介导其转染HEK293细胞,用荧光显微镜和RT-PCR检测EGFP和MCH在细胞中的表达.结果:克隆的pEGFP-C1-MCH质粒序列中的MCH与Gen Bank相符;细胞转染72 h后,转染成功的细胞在荧光显微镜下表达较强的绿色荧光,MCH基因稳定表达.结论:pEGFP-C1-MCH真核表达载体的构建及其在HEK293细胞中的稳定表达,为研究MCH基因在能量代谢中的功能及作用机制提供了实验模型.     

人annexin A2基因真核表达的构建及活性

为了构建人Annexin A2基因真核表达载体。通过TRIzol法提取Hela宫颈癌细胞中总RNA,采用RT-PCR技术(逆转录-聚合酶链反应)扩增Annexin A2的基因片段,并成功构建成VR1012-Annexin A2-HA重组质粒。经酶切、测序检测其构建的正确性,将质粒瞬时转染到293T人胚肾细胞,使用免疫荧光和蛋白印迹(Western blot)法检测基因表达,使用流式细胞术检测转染后细胞凋亡率。结果表明实验成功构建了具有表达活性的Annexin A2真核表达质粒,为进一步研究Annexin A2的抗凋亡作用奠定了基础。     

脑心肌炎病毒pCMV-HA-VP2表达载体的构建及在HEK293细胞中的表达

目的:构建脑心肌炎病毒(Encephalomyocarditis Virus,EMCV)衣壳蛋白VP2基因的真核表达载体pCMV-HA-VP2,并在HEK293细胞中表达.方法:提取EMCV的总RNA,RT-PCR扩增VP2基因,酶切后构建带HA标签的真核表达质粒pCMV-HA-VP2,运用脂质体介导法将其转染至HEK293细胞中,分别进行过表达检测、Westernblotting分析及IFA检测来验证VP2基因的转录及表达情况.结果:重组表达载体pCMV-HA-VP2构建成功,转染至HEK293细胞中,VP2蛋白和HA标签融合表达成功.结论:EMCV衣壳蛋白VP2基因的真核表达载体pCMV-HA-VP2在HEK293细胞中的成功表达,为EMCV衣壳蛋白的功能研究提供理想的实验材料,同时也为EMCV感染机制及其受体研究奠定基础.     

抗人PD-L1单克隆抗体的瞬转表达

利用HEK293 6E细胞瞬转表达抗人PD L1单克隆抗体. 将HEK293 6E细胞无血清悬浮培养, 筛选最佳生长培养基; 考察HEK293 6E细胞的筛选表达培养基、 DNA和PEI质量比及转染时细胞密度等转染条件, 并对收获的抗体进行SDS PAGE和ELISA鉴定. 结果表明: 在A无血清表达培养基中, 以2×106个/mL的细胞密度和m(DNA)∶m(PEI)=1的条件转染, 第4天收获抗体的产量最高, 为170.9 μg/mL; 收获PD-L1抗体的重链分子量约为50 000, 轻链分子量约为25 000.     

HEK293F细胞瞬时表达PDGFR-β/Fc蛋白的条件优化

为优化HEK293F细胞瞬时转染条件,提高PDGFR-β的蛋白表达量,采用聚乙烯亚胺(Polyetherimide,PEI)为转染试剂,将质粒p XLG-PDGFR-β/Fc与PEI混匀聚合后加入到细胞悬液,37℃,φ=6%CO2,180 r/min悬浮振荡培养,培养7 d后收集样品,ELISA检测PDGFR-β蛋白的浓度。对细胞密度、DNA浓度和m(DNA):m(PEI)、聚合时间以及添加物(丙戊酸钠、葡萄糖和蛋白胨)进行优化。结果显示,HEK293F细胞瞬时转染的最佳条件为:细胞密度4×106cells/m L、DNA浓度2.0μg/106cells、m(DNA):m(PEI)为1:2、聚合时间5 min。同时,48 h内添加3 mmol/L丙戊酸钠,第3天补加葡萄糖和1 g/L的蛋白胨TN1可使PDGFR-β/Fc的蛋白表达量明显提高。实验表明,经过对HEK293F细胞瞬时表达PDGFR-β的转染条件的优化,蛋白表达量可达55 mg/L,为更大规模瞬时转染生产PDGFR-β/Fc蛋白奠定了基础。     

PEI介导pCEP4/EGFP瞬时转染293-F细胞条件优化

为构建真核表达载体pCEP4/EGFP,PEI介导瞬时转染293-F细胞,观察转染效率,优化转染条件.通过NotI和Hind III酶切位点将增强型绿色荧光蛋白基因(EGFP)插入真核表达载体p CEP4中,并转化Trans5α感受态细胞,氨苄青霉素筛选培养,挑取阳性克隆扩增后提取质粒,酶切鉴定正确后,PEI介导转染293-F细胞,流式细胞仪检测转染效率.实验结果表明,成功构建了真核表达载体pCEP4/EGFP,当N/P(PEI/DNA)为25,悬浮培养模式下转染293-F细胞,48 h转染效率为77.57%,重组载体p CEP4瞬时转染293-F细胞,可获得理想转染效果.     

大鼠中性氨基酸转运蛋白SNAT1-HA融合蛋白的构建和表达(英文)

Na+偶联的中性氨基酸转运蛋白SNAT1是一种膜蛋白,属于转运蛋白第38家族(SLC38),在中枢神经系统(CNS)中起到重要的生理学作用.为了更容易地检测SNAT1在细胞膜上的表达,以pBK-CMVΔ-SNAT1为模板,用PCR,双酶切和T4连接酶连接的方法在SNAT1的C端加上了一个HA标签蛋白,构建了一个新质粒pBK-CMVΔ-SNAT1-HA.用该质粒瞬时转染人胚胎肾细胞(HEK293T),转染36 h以后,融合蛋白SNAT1-HA可以用HA抗体检测.Western blot结果显示在约54 kDa处有一条特异性条带,与预期分子量大小一致.利用重组质粒pBK-CMVΔ-SNAT1-HA可以更方便地检测到SNAT1在细胞膜上的表达与定位,为进一步研究SNAT1结构与功能奠定了基础.     

表达大鼠FoxA1的慢病毒制备和鉴定

通过PCR扩增获得大鼠FoxA1的cDNA,构建慢病毒重组载体plv-rFoxA1-IRES-EGFP,并瞬时转染293T细胞观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达及Western blot检测FoxA1的表达.通过钙转将该重组载体与辅助质粒△8.91,pVSV-G共转染293T细胞制备慢病毒.研究结果表明,大鼠FoxA1慢病毒质粒成功构建,并且证实所制备的慢病毒能感染细胞,使细胞有效表达FoxA1蛋白,为FoxA1的功能研究奠定了材料基础.     

人IGFBP-1基因真核表达载体的构建及其对胃癌细胞BGC-823增殖的影响

目的构建IGFBP-1真核表达载体,观察IGFBP-1基因真核表达载体转染胃癌细胞株BGC-823后基因的表达及其对BGC-823细胞增殖的影响.方法以GES-1细胞基因组为模板,PCR技术扩增人IGFBP-1的基因片段,克隆人pc DNA3-His-Flag真核表达载体,重组载体pc DNA3-IGFBP-1-His-Flag,并通过PCR、双酶切和测序鉴定.重组质粒经阳离子脂质体法转染BGC-823细胞,RT-PCR和Western blot检测细胞IGFBP-1的表达情况,并通过CCK8法观察IGFBP-1过表达对BGC-823细胞增殖的影响.结果经PCR、双酶切和测序鉴定证明IGFBP-1真核表达载体构建成功,并在胃癌细胞株BGC-823高效表达.CCK8实验显示:IGFBP-1过表达对BGC-823细胞增殖无影响.结论成功构建IGFBP-1真核表达载体,IGFBP-1过表达对BGC-823细胞的增殖无影响,可为进一步研究IGFBP-1生物学功能奠定基础.     

HIV-1病毒样颗粒真核表达系统的建立

目的 利用哺乳动物细胞表达HIV-1病毒样颗粒,为HIV-1病毒的生物学研究和进一步设计HIV-1中和优势表位预防性疫苗奠定基础.方法 以293T细胞作为宿主细胞,利用磷酸钙沉淀法将带有HIV-1病毒被膜蛋白gp160基因的pcDNA3.1/BaL gp160真核表达载体和带有HIV-1核心蛋白(gag)的pVRC3900真核表达载体共转染至293T细胞中,收集培养上清,经蔗糖不连续梯度离心,收集病毒样颗粒,经磷钨酸负染,透射电镜观察结果 .结果 以磷酸钙沉淀DNA转移技术,EGFP真核表达质粒为靶基因,293T细胞为宿主细胞,最佳转染效率达30%以上;将peDt NA3.1/BaL gp160(env)和pVRC3900(gag)真核表达质粒共转染,宿主细胞成功表达目的 蛋白,转染细胞培养上清经蔗糖密度梯度离心,电镜观察可见自行装配的HIV病毒样颗粒.结论 在真核细胞中表达HIV-1病毒样颗粒.     

HEK293 PEAK瞬转快速表达抗体蛋白平台的建立

将HEK293 PEAK细胞用Gibco FreeStyleTM293表达培养液进行无血清悬浮驯化培养,获得无血清悬浮培养的HEK293 PEAK细胞,并经有限稀释法获得细胞亚克隆,建立抗体瞬转表达的工程细胞株.用转染试剂PEI将质粒转入该细胞株中表达抗体.通过优化质粒DNA与转染试剂PEI的比例,质粒与转染试剂的比例为1∶2时,转染效率最佳,并对瞬转表达抗体进行鉴定和活性分析,确认获得具有生物活性的抗体(Herceptin),抗体分子量约150 kD,结果表明已成功建立了以无血清悬浮培养的HEK293 PEAK细胞为宿主细胞的瞬转快速表达抗体蛋白平台.     

人PSF真核表达载体构建及其在CHO细胞中的表达

目的是构建人PSF基因真核表达载体pEGFP-N1-PSF,并在检测其在CHO细胞株中的表达情况。应用DNA重组技术和PCR方法从人宫颈癌Hela细胞中扩增PSF基因,插入pEGFP-N1真核表达载体,构建重组质粒pEGFP-N1-PSF并测序鉴定。将pEGFP-N1-PSF瞬时转染CHO细胞,通过Western blot和RT-PCR方法检测PSF的表达,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达。结果 CHO细胞转染pEGFP-N1-PSF真核表达载体后,RT-PCR和Western blot实验发现,在RNA和蛋白水平有PSF的表达,在荧光显微镜下可以观察到融合蛋白EGFP/PSF的表达。成功构建pEGFP-N1-PSF真核表达载体,证实其在CHO细胞中可以表达。     

柔嫩艾美耳球虫Serpin基因在293T细胞中的表达

为了检测柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella,Et)丝氨酸蛋白酶抑制剂(Serine protease inhibitor,Serpin)基因(EtSerpin)在真核细胞293T中的表达情况,以Et孢子化卵囊cDNA为模板,经PCR扩增含完整Serpin开放阅读框的序列,将其克隆至pGEM-Teasy载体,构建pGEM-Teasy-EtSerpin质粒,双酶切回收目的片段后与相应酶切的真核表达载体pCAGGS连接,构建真核重组表达质粒pCAGGS-EtSerpin.该重组质粒经酶切和测序鉴定正确后转染293T细胞,用间接免疫荧光法和Western blot鉴定EtSerpin基因的表达情况,间接免疫荧光实验可以检测到红色荧光,Western blot结果显示出大小约45.5kDa的目的蛋白条带,结果表明构建的EtSerpin可以在293T细胞中获得表达.     

293T细胞转染表达ARG1及其对砷代谢的影响

研究含有ARGI基因的真核表达载体PcDNA3.1-IE-ARG1转染真核细胞后,在细胞中的表达及对细胞砷代谢的影响。由脂质体介导将PcDNA3.1-IE-ARG1转染入293T中,用real-timePCR方法检测ARG1基因的表达,用原子吸收分光光度法测定24h砷染毒后细胞内砷含量及细胞排砷量。重组质粒成功转入293T细胞中且表达良好;与转染前细胞比较,转染重组质粒的细胞在不同浓度砷染毒下细胞内砷含量明显降低(P0.05),并且细胞的排砷量也高于转染前的;此外,转染表达ARGI基因的细胞在砷染毒48h后其内GSH及GST的含量高于转染前细胞。这些表明,ARG1基因在真核细胞中相对高表达后在砷代谢排出中发挥了一定的作用。     

汉坦病毒G1S0.7嵌合基因真核载体的构建及表达

构建含汉坦病毒嵌合基因G1S0.7的真核重组质粒,并在真核细胞中有效表达.从本室前期构建并经测序的重组质粒pShuttle-G1S0.7上双酶切回收得到片段G1S0.7后,克隆入真核表达载体pVAX,并将其通过脂质体介导转染HEK293细胞,表达产物用ELISA和Western-blot进行鉴定.酶切鉴定结果表明,成功构建了含汉坦病毒嵌合基因G1S0.7的重组质粒pVAX-G1S0.7; ELISA检测结果和Western-blot结果显示,汉坦病毒G1S0.7嵌合基因在HEK293细胞中得到了表达,所表达的融合蛋白分子量约90kD,与预期大小一致,并且表达产物可与抗汉坦病毒NP mAb特异性结合.说明所构建的表达载体可在真核细胞中表达出与汉坦病毒抗体有特异性结合活性的融合蛋白,为下一步基因免疫及进一步筛选HFRS基因疫苗候选组分提供实验依据.