抑癌基因FHIT的克隆和序列分析

用ＰＣＲ方法，从人脑ｃＤＮＡ库中克隆ＦＨＩＴ基因，扩增得到５５３ｂｐ片段克隆于ｐＧＥＭ－Ｔ载体，测定了其ＤＮＡ序列。该序列包括ＦＨＩＴ ｃＤＮＡ编码区全部４４４ｂｐ，以及５‘端５２ｂｐ和３’端５７ｂｐ非编码区序列。编程区有二处位点发生突变，第９２位密码子中的Ｃ突变成Ｇ，是同义突变，不导致氨基酸改变；     

TNF—α诱导的蛋白质因子与淋巴毒素基因5‘端上游区特异性…

淋巴毒素（ＬＴ）是由活化的Ｔ淋巴细胞分泌的一种糖蛋白，凝胶迟滞电泳分析发现，ＴＮＦ－α诱导３０ｍｉｎ的Ｊｕｒｋａｔ细胞核抽提物下ＬＴ基因５＇上游片段可形成多种ＤＮＡ－蛋白质复合物。ＤＮａｓｅⅠ足迹法实验发现，ＬＴ基因５＇端上游－１０６￣－８３ｂｐ（共２４ｂｐ）序列具有蛋白保护足迹；此２４ｂｐ的序列中存在一个ｋＢ样结合位点：－１００￣－９０ｂｐ（５＇－ＧＧＧＧＧＣＴＴＣＣＣ－３＇）。以此蛋白保护足迹     

A型口蹄病毒VP1免疫活性肽基因串联片段的化学合成及克隆…

Ａ型口蹄疫病毒（ＦＭＤＶ）ＶＰＩ蛋白的１４１－１６０位和２００－２１３位氨基酸序列是决定ＦＭＤＶ免疫原性的抗原决定簇片断，人工合成一个免疫活性肽基因的串连片段（２０ＡＡ－１４ＡＡ－２０ＡＡ），全部选用２大肠杆菌偏爱密码子，在５端带有有ＥｃｏＲ１位点和一个起始密码子ＡＴＧ，在３端带有ＢａｍＨＩ位点和一个终止密码子ＴＧＡ，利用这两个酶切位点把该基因连接到ＰＷＲ５９０质粒上，并筛选高表达的菌株，结果表明     

TNF－α诱导的蛋白质因子与淋巴毒素基因5’端上游区特异性结合的研究

淋巴毒素（Ｌｙｍｐｈｏｔｏｘｉｎ，ＬＴ）是由活化的Ｔ淋巴细胞分泌的一种糖蛋白，凝胶迟滞电泳分析发现，ＴＮＦ－α诱导３０ｍｉｎ的Ｊｕｒｋａｔ细胞核抽提物与ＬＴ基因５＇上游片段可形成多种ＤＮＡ－蛋白质复合物．ＤＮａｓｅⅠ足迹法实验发现，ＬＴ基因５＇端上游－１０６～－８３ｂＰ（共２４ｂＰ）序列具有蛋口保护足迹：此２４ｂｐ的序列中存在一个ｋＢ样结合位点：－１００～－９０ｂＰ（５＇－ＧＧＧＧＧＣＴＴＣＣＣ－３＇）．以此蛋白保护足迹区序列而设计合成的寡核苷酸探针进行的凝胶迟滞电泳分析及竞争反应表明，ＮＦ－ｋＢ类蛋白因子参与了此序列的ＤＮＡ－蛋白质的特异性结合，提示ＴＮＦ－α可能通过激活ＮＦ－ｋＢ类蛋白质因子参与ＬＴ基因的表达调控．     

黑曲霉（Aspergillus niger）三磷酸甘油醛脱氢酶基因（GPD …

ｐＡＮＧＰＤ是用构巢曲霉ＧＰＤ基因片段为探针,从黑曲霉基因组文库中筛选到的一个三磷酸甘油醛脱氢酶基因阳性克隆。作者对该阳性克隆进行了亚克隆和序列测定,结果表明,基因片面总长２４４１个核苷酸,其中５’－端非编码区９８１ｎ．ｔ,编码区（从起始密码子ＡＴＧ到终止密友子ＴＡＧ０长１４４６ｎ．ｔ．３‘－端非编码区长２４ｎ．ｔ,基因启动子区含有盒和ＣＴ－盒序列,但无明显的ＣＡＡＴ盒和ＴＡＴＡ盒序列。     

dna Y基因产物提高人尿激酶原cDNA在大肠杆菌中的表达

对提高人水激酶原ｃＤＮＡ在大肠杆菌中的表达水平进行了研究。通过ＰＣＲ方法在其结构基因５‘端添加起密码子ＡＴＧ，用人工合成的不依赖于ρ因子的终止序列替换 ３’端非翻译区，得到完整的人尿激酶原结构基因。将其克隆在表达质粒ｐＫＫ２３３－２中，转化大肠杆菌Ｅ．ｃｏｌｉＪＡ２２１，人尿激酶原得到初步表达，但表达水平很低，原因可能是人尿激酶原ｃＤＮＡ富含真核细胞偏爱的密码子，而大肠杆菌中识别这些密码子的ｔＲＮ     

黑曲霉(Aspergillus niger)三磷酸甘油醛脱氢酶基因(GPD)的序列测定与同源性分析

ｐＡＮＧＰＤ是用构巢曲霉ＧＰＤ基因片段为探针,从黑曲霉基因组文库中筛选到的一个三磷酸甘油醛脱氢酶基因（ＧＰＤ）阳性克隆．作者对该阳性克隆进行了亚克隆和序列测定,结果表明,基因片段总长２４４１个核苷酸（ｎ．ｔ）,其中５’－端非编码区长９８１ｎ．ｔ,编码区（从起始密码子ＡＴＧ到终止密码子ＴＡＧ）长１４４６ｎ．ｔ,３’－端非编码区长２４ｎ．ｔ,基因启动子区含有ｇｐｄ－盒和ＣＴ－盒序列,但无明显的ＣＡＡＴ盒和ＴＡＴＡ盒序列．ＧＰＤ基因由７个外显子和７个内含子构成,外显子全长１００８ｎ．ｔ,编码的蛋白质长３３６个氨基酸残基．通过序列比较分析,发现该基因与构巢曲霉的ＧＰＤ基因有许多相似之处;它们的基因启动子序列都含有ｇｐｄ－盒和ＣＴ－盒,其同源性分别为９６％和６５％;推测的两个ＧＰＤ蛋白的氨基酸同源性高达９０％;两个基因所含内含子数目及位置相同．     

去B链羧端三肽人胰岛素原的基因构建和表达

用改进的寡苷酸诱导 突变法将人胰岛素原基因（ＢＣＡ）删除编码Ｂ链羧端三肽的碱基片段，得到去Ｂ链羧端三肽胰岛素原的基因（Ｂ＾－３ＣＡ）。为了便于表达产物的蛋白质后加工，又用ＰＣＲ的方法在Ｂ链Ｎ端起始Ｍｅｔ与Ｐｈｅ密码子之间增加了编码Ｌｙｓ的３个碱基，得到改造后基因ＬＢ＾－３ＣＡ，将ＬＢ＾－３ＣＡ克隆到表达质粒ｐＢＶ２２０上，在大肠杆菌系统中热诱导表达，表达率为１２％。表达产物经蛋白质后加工，得到的去     

重组人粒细胞集落刺激因子在Escherichia coli中的表达研究

根据人天然粒细胞集落刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）基因序列设计出引物,通过ＲＴ－ＰＣＲ从人外周血单个核细胞ｍＲＮＡ获得Ｇ－ＣＳＦｃＤＮＡ片段,将该片段与原核表达载体ｐＴ７构建成重组体,导入大肠杆菌后发现天然Ｇ－ＣＳＦｃＤＮＡ表达量并不理想,这可能是由于天然ｈＧ－ＣＳＦ５’端Ｇ＋Ｃ的比例过高,使转录后的ｍＲＡ很容易形成二级结构而影响翻译起始,因此在大肠杆菌中很难获得高效表达,根据密码子简并性原则,在不改变编码氨基酸顺序的前提下,通过重新设计ＰＣＲ引物,将ｈＧ－ＣＳＦ的前３个氨基酸密码子中的几个ＧＣ碱基作了改动,获得了新的ｃＤＮＡ突变体,将其与ＰＴ７的重组导入大肠杆菌,获得了高效表达。     

用PCR法构建乳腺特异性表达非乳蛋白基因的研究

将ＰＣＲ法分别从绵羊和人血基因组ＤＮＡ中扩增出的绵羊β－乳球蛋白基因（ＢＬＧ）５＇端调控区８９８ｂｐ的片段和人骨髓单核细胞表面分化抗原ＣＤ１４基因（ｈＣＤ１４）成熟肽１２４５ｂｐ的片段连接。连接片段插入ｐＵＣ１９ ＥｃｏＲＩ－ＫｐｎＩ位点，构建成ｐＢＬＧ－ｈＣＤ１４质粒。该质粒经ＫｐｎＩ及ＣｃｏＲＩ－ＨｉｎｄⅢ酶切、ＰＣＲ法扩增ＢＬＧ和ｈＣＤ１４分析后，进一步用＾３２Ｐ－ＢＬＧ探针杂交确证。用Ｅｃ     

牛α—s1酪蛋白基因3‘端DNA的PCR扩增,克隆及鉴定

本研究以牛血总ＤＮＡ为模板，用ＰＣＲ技术扩增牛α－ｓ１酪蛋白基因的５＇端３．６ｋｂＤＮＡ片段和３＇端１．５ｋｂＤＮＡ片段的调控区序列，得到了相应的特异性扩增片段．用Ｋｌｅｎｏｗ处理后，将两个扩增片段分别与经Ｓｍａｌ酶切的ｐＵＣ１８质粒载体用Ｔ４ＤＮＡ连接酶连接，转化大肠杆菌ＪＭ１０９．在含有Ｘ－ｇａｌ，ＩＰＴＧ和Ａｍｐ的选择培养基上培养．从白色菌落中提取质粒ＤＮＡ，进行限制酶切鉴定．结果得到一个插入有１．３ｋｂＤＮＡ片段的阳性克隆．对其进行部分序列分析表明，该片段为５＇端缺失约１７０ｂｐ的牛α－ｓ１酪蛋白基因３＇端及下游区序列．     

用加端PCR技术改造h－IGF－1cDNA

用ＤＮＡ合成仪合成了分别带有ＰｓｔＩ位点和ＳａｌＩ位点及终止密码子的２个用于扩增ｈＩＧＦ－１ｃＤＮＡ的ＰＣＲ引物．利用合成的引物，７００ｂｐ长的ｈＩＧＦ－１ｃＤＮＡ模板和Ｔａｑ聚合酶进行ＰＣＲ扩增．扩增产物经电泳鉴定后克隆进Ｍ１３ｍｐ１８载体，进行核苷酸序列分析．结果显示：ＰＣＲ产物含已发表的ｈＩＧＦ－１成熟蛋白的编码序列和５＇端的ＰＳｔＩ位点及３＇端的ＳａｉＩ位点及终止密码ＴＡＧ．用加端ＰＣＲ技术成功地扩增和改造了ｈＩＧＦ－１的编码序列．     

还原糖法测定多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白活性的研究

研究了一种测定ｅｎｄｏ－ＰＧ和ＰＧＩＰ活力的方法－３，５－二硝基水杨酸试剂定糖法，并发现硫酸铵、ＥＤＴＡ对３，５－二硝基水杨酸试剂显色反应有抑制作用，ＮａＣｌ对ｅｎｄｏ－ＰＧ有抑制作用，同时还研究了某些因素对还原糖法测定ＰＧＩＰ活力的影响。     

P48L和D74N突变影响P16基因功能

应用ＰＣＲ技术，对Ｐ１６抑癌基因进行体外定突变。在Ｐ１６ｃＤＮＡ中引入第４８位密码子ＣＣＧ（Ｐｒｏ）→ＣＴＧ（Ｌｅｕ）和第７４位密码子ＧＡＣ（Ａｓｐ）→ＡＡＣ（Ａｓｎ）突变，构建了ｐ１６－Ｐ４８Ｌ和ｐ１６－Ｄ７４Ｎ突变体，并把它们导入纯合缺失Ｐ１６基因的人肺癌细胞株Ｈ４６０。     

混合法合成二阶氯化铁-石墨层间化合物的研究

在前期合成纯一阶ＦｅＣｌ３－ＧＩＣ工作的基础上,设计了混合法合成二阶ＦｅＣｌ３－ＧＩＣ的实验方案,考察了反应温度、Ｃ和ＦｅＣｌ３摩尔比ｎ（Ｃ）／ｎ（ＦｅＣｌ３）,保温时间对产物阶结构的影响。首次用混合法合成了纯二阶Ｆｅ－Ｃｌ３－ＧＩＣ,确立了其最佳反应条件。     

产生乳腺定位表达人CD14的转基因小鼠研究

将来自ＰＣＲ法合成的绵羊β－乳球蛋白基因（ＢＬＧ）５’端８９８ｂｐ上游区和人单核细胞表面分化抗原基因（ｈＣＤ１４）成熟肽１２４５ｂｐ片段构建的ＢＬＧ－ｈＣＤ１４融合基因纯化后,注入小鼠受精卵原核。实验共注射受精卵１１４９枚,经体外培养发育到２－细胞期的胚胎计９６８枚,发育率为８４．２％。从发育的胚胎中选择６３４枚移植到４６只假孕受体。其中１４只妊娠产仔,妊娠率３０．４％。妊娠受体共移植胚移２０７枚     

靶序列三链DNA对质粒pBR322的Ampr基因表达的抑制

利用ＣａＣｌ２法成功地将寡核苷酸导入大肠杆菌ＪＭ１０９细胞。质粒ｐＢＲ３２２转化结果表明,寡革酸片段５’－ＡＧＣＧＧＧＡＡＴＡＡＧＧＧＡＡ－３’在转化前（或后）与靶序列结合均能抑制β－内酰胺酶基因的表达,细菌生长受到抑制。体外聚丙烯酰胺凝胶电泳结果表明,该片段能与靶序列形成三链结构。这些结果表明多聚嘌呤寡核苷酸是通过与靶序列形成三链ＤＮＡ来抑制β－内酰胺酶基因的表达。     

修饰合成冬鲽抗冻肽基因的设计和克隆

动物界和植物界密码子使用频率不同,冬Ｄｉｅ抗冻肽中丙氨酸占６０％而且偏爱ＧＣＣ,３８个Ａｌａ密友子中２３个为ＧＣＣ。我们设计合成抗冻肽基因时采用了植物基因常用密码子,用甘薯信号肽序列取了抗冻肽的ｐｒｅ序列,省略了Ｐｒｏ序列,并 信号肽下游二、四、八拷贝正向串联的成太的修饰基因,经测序证实与设计完成一致。利用ＱＩＡ表达系统,在大肠杆菌中实现了ＤＨＦＲ－成熟抗冻肽单体和二体的融合表达。     

^3H—GLY对家蚕蛋白质生物合成参入活性的研究

氚标记甘氨酸（＾３Ｈ－Ｇｌｙ）对家蚕蛋白质生物合成参入试验的研究结果表明,＾３Ｈ－Ｇｌｙ对家蚕５龄幼虫的标记剂量和标记时间以每头蚕５μＣｉ和３０ｍｉｎ为宜;＾３Ｈ－Ｇｌｙ对家蚕几个主要器官的蛋白质参入活性有很大差异,进入蚕体的＾３Ｈ－Ｇｌｙ大部分参入到后部丝腺蛋白质合成中。     

以潮霉素B磷酸转移酶基因为遗传标记的启动子探针型载体的 …

用来自大肠杆菌的潮霉素Ｂ磷酸转移酶基因作为遗传标记构建了启动子探针型载体ｐＳＵＰＶ８，该基因的转录和翻译起始区以及５‘－端编码区两个密码子均被除去，载体骨架为大肠杆菌质粒ｐＵＧＶ２该标记基因的终止子来自Ｐｈａｎｅｒｃｈａｅｔｅ ｃｙｓｏｓｐｏｒｉｔｍ的ＬＩＰ６基因。