日本血吸虫天然抗病分子疫苗的结构与功能分析I.未成熟卵28KDa分子的快速分离纯化与鉴定

为了进一步研究日本血吸虫天然抗病分子（SIEA28KDa）的结构与功能,采用SDS-PAGE制备电泳和电洗脱法从日本血吸虫未成熟卵可溶性抗原（SIEA）中快速分离纯化了SIEA28KDa抗原分子,纯化后抗原分子经梯度凝胶电泳分离,重复测定其分子量,同时,采用Western blot和ELISA检测SIEA28KDa分子的免疫活性及其生化纯度。证实获得的提取物SIEA28KDa抗原分子的纯度高、活性好;用该抗原分子免疫家兔获得的单特异性抗血清可同时识别日本血吸虫未成熟虫卵、雌虫和雄虫的28KDa抗原组分,说明该分子与日本血吸虫成虫（AWA）28KDa组分具有部分交叉抗原性。     

日本血吸虫天然抗病分子疫苗的结构与功能分析 Ⅱ.SIEA 28kDa分子的高效液相色谱分离及薄层等电聚焦分析

采用高效液相离子交换法对电泳纯SIEA28kDa抗原组分进一步分离纯化。对获得的色谱纯SIEA28kDa抗原分子进行薄层等电聚焦分析,测定其等电点。结果证明电泳纯SIEA28kDa抗原分子经高效液相离子交换法纯化后,280nm,220nm波长色谱图均为一个两侧对称,光滑的高峰曲线,色谱洗脱液对其免疫活性光密度图也为一个两侧对称,光滑的高峰曲线,色谱纯化证明SIEA28kDa抗原组分可能为单一分子,其等电点范围在pi5-pI7之间。     

基于转录本组和蛋白质组数据的日本血吸虫候选疫苗分子序列的预测和分析

预测了可能模拟致弱疫苗免疫保护性效果的日本血吸虫抗原分子,为实验鉴定抗日本血吸虫候选疫苗分子提供基础.实验基于已发表的辐照尾蚴转化的童虫的特征性转录本组(曼氏血吸虫)和蛋白质组(日本血吸虫)序列,用BLASTP算法等搜寻来源于正常日本血吸虫童虫和成虫的转录本组和蛋白质组中的序列;应用在线软件、相关数据库及文献对这些序列进行序列注释分析.结果获得了与辐照尾蚴转化的童虫特征性表达的分子同源或一致的日本血吸虫序列131条,它们较高比例地出现在正常童虫高表达的分子集类中;进一步文献分析预测得到了52个日本血吸虫候选疫苗分子,它们的序列特征与存在于血吸虫体被的一些分子和已知的抗血吸虫疫苗分子的相类似.用数据挖掘技术获得了一批日本血吸虫候选疫苗分子,为进一步实验研究奠定了基础.     

日本血吸虫Sj23与IL-12多价DNA疫苗的构建

构建能共同表达日本血吸虫23kDa膜抗原(Sj23)与细胞因子IL-12的多价DNA疫苗．RT-PCR的方法从日本血吸虫成虫获得Sj23的基因片段,克隆到载体pVIVO2-mIL12／mcs上,进行酶切和测序鉴定．采用免疫荧光的方法检测多价DNA疫苗pVIVO2-Sj23-IL12在小鼠骨骼肌细胞的表达．成功地构建了能共同表达日本血吸虫23kDa膜抗原(Sj23)与细胞因子IL-12的多价DNA疫苗．此多价DNA疫苗在免疫小鼠肌细胞的细胞膜和细胞浆均获得了Sj23的表达．     

日本血吸虫病人群同种型抗体应答的特征及其流行病学意义

该研究通过对我国日本血吸虫病流行区人群的免疫流行病学调查,确定年龄相关的优势血吸虫抗原特异性抗体应答的同种型特征及与化疗后再感染状态相关的优势血吸虫特异性抗体应答的分子机理,进而确定其抗原特异性,为日本血吸虫病免疫流行病学研究和疫苗的研制提供基本信息.     

血吸虫膜相关抗原基因的克隆

目的:筛选日本血吸虫(Schistosoma japonicum,S.japonicum)新的疫苗候选抗原基因.方法:以S.japonicum成虫DNA为模板,PCR扩增相关基因,然后将其克隆XpBS-T载体,通过菌落PCR对产物进行检测,对阳性克隆子测序,与GeneBank中的已知相关序列进行比对分析.结果:菌落PCR获得一条与PCR产物一致的DNA片段,序列测定结果表明PCR产物与S.japonicum 22.6 kDa抗原分子核苷酸序列具有高度同源性.其目的基因大小636 bp,具有一个189 bp的ORF,能编码63个氨基酸.ORF不是全长的阅读框,只获得部分编码区.表达产物可含有一个包含9个氨基酸残基的潜在螺旋跨膜片段(25～33位)和一个酪氨酸激酶磷酸化位点(38～39位).讨论:成功克隆出一个与S.japonicum 22.6kDa抗原编码基因有高度同源性的基因.预测该基因为膜相关蛋白基因,可编码血吸虫体表膜相关蛋白.在生理机能上,该膜相关蛋白可能是信号传递分子.     

日本血吸虫童虫在东方田鼠和昆明小鼠中的蛋白差异初探

东方田鼠具有天然抗日本血吸虫活性,为了筛选抗日本血吸虫疫苗分子,通过日本血吸虫尾蚴感染东方田鼠和昆明小鼠,感染11天后收集东方田鼠和昆明小鼠肝童虫．肝童虫经组织匀浆收集蛋白质并进行蛋白质定量后SDS-PAGE分离,切取差异蛋白条带进行蛋白质鉴定．发现差异蛋白主要为日本血吸虫结构蛋白,能量代谢相关蛋白以及热休克蛋白等．为进一步研究抗日本血吸虫疫苗奠定了基础．     

曼氏血吸虫28kDa谷胱甘肽S-转移酶的有效抗原肽P141结构与活性研究

以曼氏血吸虫28kDa谷胱甘肽S-转移酶的有效抗原肽P141为先导肽,通过分别改变在结构上、Chou-Fasman构象参数上和亲水性上相似的氨基酸残基设计并合成了4个类似物,通过ELISA法测定了它们对血吸虫表膜抗原多克隆抗体的抗原性,通过类似物与P141的活性比较讨论了构效关系。     

家蚕浓核病毒BmDNV-1(伊那株)结构蛋白基因VP4的克隆、表达及抗体制备

为研发新的日本血吸虫(Schistosoma japonicum)疫苗候选抗原基因,为血吸虫诊断和疫苗研制提供依据,提取和纯化S.japonicum成虫DNA,PCR扩增相关基因,然后将其克隆入pBST载体,对菌落PCR阳性克隆子测序和分析.菌落PCR获得一条与PCR产物一致的DNA片段,PCR产物与S.japonicum 22 600抗原分子DNA序列具有高度同源性,636 bp大小,oRF189 bp,ORF小是全长的蒯读框,只获得部分编码区,能编码63个氨基酸,表达产物含有一个包含9个氨基酸残基的潜在螺旋跨膜片段(25～33位)和一个酪氨酸激酶磷酸化位点(38～39位).本研究所获取的阳性克隆是与S.japonicum 22 600抗原编码基因有高度同源性的基因.通过Blastn和BLASTP分析,预测该基因为体膜相关蛋白基因,可编码血吸虫体壁相关蛋白,可能是信号传递分子.     

东方田鼠抗日本血吸虫病机制研究

本文报道了在东方田鼠抗日本血吸虫机制研究方面的研究成果。经多次重复感染试验 ,证实来源于血吸虫疫区 (洞庭湖 )和非疫区 (宁夏青铜峡 )的东方田鼠均具有抗日本血吸虫病能力 ,这种能力是可遗传的 ,与获得性免疫关系不大 ;体内外的检测与杀伤试验显示东方田鼠体内存在的抗日本血吸虫童虫和成虫抗原的天然抗体IgG3和补体可能在其抗血吸虫病方面具有很重要的作用 ;东方田鼠和腹腔巨噬细胞 (Mф)、嗜酸细胞 (Eos)对血吸虫童虫具有天然的黏附能力 ;用东方田鼠血清筛选日本血吸虫成虫cDNA文库 ,获得了 5个阳性克隆 ,其中 4个克隆为新基因 ,…     

黑胸大蠊免疫兔血清的制备与应用

按常规动物免疫方法用黑胸大蠊不同发育阶段可溶性抗原对新西兰兔进行免疫,并通过SDS-PAGE和酶联免疫印迹(EL IB) 技术分析黑胸大蠊不同发育阶段抗原的免疫学特性,同时用黑胸大蠊若虫和雄虫免疫兔血清筛选美洲大蠊若虫cDNA 文库,对阳性克隆进行PCR 鉴定和序列测定,结果显示：卵抗原、若虫抗原、雄成虫抗原、雌成虫抗原分别可见13,28,26 和41 条蛋白区带,4种抗原组分相互之间有交叉抗原存在,用黑胸大蠊若虫免疫兔血清筛选出1个新基因,用黑胸大蠊雄虫免疫兔血清筛选出6个新基因.     

长角血蜱不同龄期虫体免疫原性研究

用酶联免疫吸附技术,用长角血蜱三个龄期的虫体蛋白检测其幼虫、若虫和成虫多次叮咬后的兔血清效价.结果表明不同生活阶段的虫体之间存在免疫交叉反应.用SDS-PAGE方法分析了几种蜱类的蛋白质,结果表明长角血蜱不同发育期虫体共有的主要蛋白质有5种,分子量分别为97.4、94、63、37和32kDa;越南血蜱幼虫和微小牛蜱幼虫与长角血蜱不同发育期虫体共有的蛋白质有2种,分子量为97.4、94kDa.用酶联免疫印渍技术研究发现:长角血蜱三个龄期虫体分别叮咬兔产生的抗血清与长角血蜱不同发育期虫体蛋白质印渍,显示出共同蛋白质带,分子量为94kDa.三种抗血清与越南血蜱幼虫印渍显示出的蛋白质,其分子量为97.4、94kDa;与微小牛蜱幼虫蛋白反应显示的蛋白质带,分子量为83、63kDa.实验结果表明不仅长角血蜱三个龄期虫体之间存在免疫交叉反应,而且与微小牛蜱幼虫和越南血蜱幼虫之间也存在免疫交叉反应.     

RH株弓形虫抗原及高效价多克隆抗体的制备

通过制备和分析弓形虫抗原蛋白，并以此抗原制备高效价的兔抗弓形虫多克隆抗体，为弓形虫的免疫检测和诊断提供有效的方法和途径，同时也为基因工程产物的鉴定提供方便有效的检测手段．速殖子主要来源于感染后72～74h获得的腹水，通过常规方法制备和提纯弓形虫可溶性抗原，采用SDS-AGE方法分析抗原蛋白的分子量．以抗原和福氏佐剂制备成完全和不完全福氏佐剂通过脊柱两旁皮下多点免疫的途径免疫新西兰大白兔，制备兔抗弓形体多克隆抗体，间接ELISA法检测血清中抗体的效价．经过观察所获得的虫体阶段主要处在宿主细胞巨噬细胞内而尚未逸出阶段，通过对结果的分析，所制备的弓形体抗原的分子量主要集中在17～156ku之间，与文献报道有差异，兔抗弓形体抗体效价在60000以上．该研究结果将为弓形体的蛋白质研究，免疫诊断、预防及有效治疗奠定基础．     

含铀土壤中苏云金芽胞杆菌的分离与鉴定

从新疆某铀矿厂采集土样,通过光学显微镜观察其伴胞晶体,并经生理生化特征和cry基因的鉴定确认为苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis,简称Bt）,将其命名为BRC-ZYR4。利用PCR．RFLP方法和SDS—PAGE方法对该菌株进行了cry基因型和杀虫晶体蛋白（Insecticidal Crystal Proteins,简称ICPs）的鉴定。结果表明,BRC-ZYR4可能含有crylAd、crylcb和crylEa基因,含有约130、75、50、30和25kDa ICPs。     

Molecular analysis of the association of HLA-B53 and resistance to severe malaria.

The protective association between the human leukocyte antigen HLA-B53 and severe malaria was investigated by sequencing of peptides eluted from this molecule followed by screening of candidate epitopes from pre-erythrocytic-stage antigens of Plasmodium falciparum in biochemical and cellular assays. Among malaria-immune Africans, HLA-B53-restricted cytotoxic T lymphocytes recognized a conserved nonamer peptide from liver-stage-specific antigen-1 (LSA-1), but no HLA-B53-restricted epitopes were identified in other antigens. These findings indicate a possible molecular basis for this HLA-disease association and support the candidacy of liver-stage-specific antigen-1 as a malaria vaccine component.     

HLA-DQ is epistatic to HLA-DR in controlling the immune response to schistosomal antigen in humans

Antigens that produce an antibody response in some members of a species may fail to do so in others. The response to an antigen is controlled by a gene termed the immune response (Ir) gene, which is transmitted as a single dominant trait. We have provided evidence for similar immune suppression (Is) genes which control non-responsiveness through the antigen specific suppressor T cell. The non-responsiveness is also dominantly inherited and the Is genes are linked to the histocompatibility (HLA) antigen system. Here we report that the HLA-DR2 molecule from a non-responder haplotype (HLA-Dw12-DR2-DQwl) is required for the proliferative T cell response to schistosoma japonicum (Sj) antigen, as a restriction element, indicating that the HLA-DR2 is the product of the Ir gene, and that the HLA-DQwl molecule of the non-responder haplotype is important in the antigen-specific suppression of the response to this antigen, suggesting that it is the product of the Is gene. We therefore conclude that the HLA-DR and DQ molecules, which are controlled by the distinct genes in the MHC multigene family, regulate immune response and immune suppression and that the gene for HLA-DQ is epistatic to that for HLA-DR in controlling the immune response to schistosomal antigen in humans.     

细粒棘球绦虫重组pET30a-EgA31疫苗的构建和诱导表达

克隆细粒棘球绦虫EgA31抗原基因,构建pET30a-EgA31原核表达载体,并在大肠埃希菌宿主系统中表达EgA31重组蛋白,对表达产物进行SDS-PAGE分析.从细粒棘球绦虫成虫组织中提取总RNA,反转录生成cDNA,以此cDNA为模板RT-PCR 克隆获得EgA31抗原基因,将其克隆至pUCm-T载体,测序确定其正确性.利用定向克隆技术将EgA31抗原基因片段克隆至原核表达质粒pET30a上,转化E coli DH5α,根据选择标记的卡那霉素抗性基因筛选到阳性克隆,通过PCR分析和酶切鉴定筛选出阳性克隆.IPTG初步诱导和表达pET30a-EgA31重组蛋白,SDS-PAGE电泳检测,并经凝胶图像分析确定目的蛋白的表达水平.测序表明选取的pET30a-EgA31阳性克隆均为正确连接EgA31抗原基因的重组质粒.经IPTG诱导后重组蛋白得到成功表达,在相对分子量约为31 kDa处有表达条带,表达量约占菌体总蛋白质的26%.成功克隆并构建了pET30a-EgA31原核表达质粒.初步诱导表达出EgA31重组蛋白,为进一步研究其免疫特性奠定了基础.     

Ruminobacter amylophilus 70细胞膜淀粉酶的纯化和分析

一种Ruminobacter amylophilus 70细胞膜联的新支连淀粉酶被4％ Triton X-100提取．其新支连淀粉酶活性存在于70％的硫酸铵沉淀组分中．通过等电聚焦纯化，根据SDS凝胶电泳测定，其新支连淀粉酶的分子量是91．2kDa，其等电点是5．8-5.9.根据另一种淀粉酶活性凝胶电泳的方法测定，其新支连淀粉酶的分子量大约是92．6kDa．在R.amylophilus 70细胞中存在着两种类型的淀粉酶(可溶性淀粉酶和膜联淀粉酶，比如新支连淀粉酶)共同承担分解淀粉的作用．