木糖发酵重组酿酒酵母研究进展

近年来针对木质纤维素类原料生物转化乙醇的研究引起了广泛关注。乙醇的高产依赖于木质纤维素水解液中六碳糖和五碳糖的共同发酵。但是,传统产乙醇酵母酿酒酵母 Saccharomyces cerevisiae 既不能发酵木糖, 也不能利用该五碳糖生长。因此, 研究人员尝试各种方法构建重组酵母菌以提高木糖发酵能力。作者综述了木糖发酵重组酿酒酵母菌的研究进展,包括天然木糖发酵微生物、木糖代谢途径、S. cerevisiae 的代谢工程、原生质体融合以及基因组改组技术, 同时也对目前研究存在的问题及研究前景进行了讨论。     

双细胞体系木糖协同发酵产氢特性研究

采用自主筛选的两株蜡样芽胞杆菌（A1）和短波单胞菌属（B1）,构建人工双细胞体系,重点研究了该双细胞体系利用木糖协同发酵产氢的能力,实验结果表明：单一的A1、B1菌种均能有效利用木糖产氢,而两株菌形成的双细胞体系显示出更高的产氢效率,以及更加充分的底物利用率;发酵产氢过程属于丁酸型发酵。人工双细胞体系混合培养的产氢得率达到1 mol木糖产生1.33 mol氢气,与A1、B1单菌体系木糖发酵产氢相比,产氢得率分别提高了10.7%与32.7%,其原因可能是两菌种互相提供营养来源,也可能是通过利用对方的代谢产物或中间体解除了降解物造成的抑制。说明以木糖作为底物时,人工双细胞体系能有效提升产氢速率,增加氢气产量,缩短发酵周期,具有较大的应用潜力。     

酿酒酵母中的嗜热细菌木糖异构酶活性表达及木糖代谢研究

将来自嗜热放线细菌Thermobif ida f usca的木糖异构酶（xylose isomerase,XI）基因xylA,连接于酵母表达载体pYES2的半乳糖诱导启动子（PGAL）下,得到重组质粒pYES2-xylA,用其转化酵母菌INVSc1,测定重组酵母菌株INVSc1-xylA的木糖异构酶活性,并对重组酵母菌株进行木糖葡萄糖共发酵试验,探讨在酿酒酵母中建立新的生产乙醇木糖代射途径。结果木糖异构酶在75℃,pH值6.8的酶活力最高,在酿酒酵母中成功地获得活性表达,并且SDS-PAGE电泳有明显的特异性表达产物带,单体分子量为43kD。INVSc1-xylA在木糖葡萄糖共发酵实验中消耗木糖和产生乙醇分别比对照菌提高53.8%和36%,提高了其生产乙醇的能力。     

Tup1基因缺失对酿酒酵母耐高糖性状的影响

研究Tup1基因对酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）细胞耐高糖性状的影响。利用Cre/loxP系统对单倍体细胞中的转录因子Tup1基因进行敲除,单倍体细胞复倍后研究基因缺失菌株的性状变化。结果表明,Tup1基因缺失虽然减弱了菌株的呼吸能力,但却增强了菌株在高浓度葡萄糖培养基中的生长和发酵能力。Tup1基因可能通过调节酿酒酵母细胞呼吸强度来调控细胞的高糖应激反应。     

几丁质降解菌的筛选及其降解虾壳废弃物的研究

虾蟹壳废弃物产量的日益增加造成了巨大的资源浪费和严重的环境污染。为了提高虾蟹壳废弃物的综合利用价值，本研究从土壤中筛选出几丁质高效降解菌，并通过单因素试验探究降解虾壳的最佳条件及其对虾壳的降解能力。利用胶体几丁质为唯一碳源，采用平板透明圈法对来源于喀斯特地貌的土壤微生物进行富集、分离和纯化，获得了4株具有几丁质降解活力的菌株:粘质沙雷氏菌Serratia marcescens gxas3、蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus gxas5、嗜麦芽糖窄食单胞菌Stenotrophomonas maltophilia gxas7以及水生几丁质降解菌Chitinilyticum aquatile gxas1。其中C. aquatile gxas1在96 h时达到最大粗酶活力0.244 U/mL，优于其他3株菌株。利用单因素试验探究C. aquatile gxas1降解虾壳废弃物的能力，并优化其培养基和培养条件，最终确定最佳产酶培养基为果糖2 g/L、KH₂PO₄ 0.7 g/L、K₂HPO₄ 0.3 g/L、MgSO₄·6H₂O 0.6 g/L、酵母粉0.5 g/L、牛肉膏4 g/L、蛋白胨4 g/L。最佳发酵条件为接种量2.0%、pH值8.0、温度20 ℃、发酵时间9 d。在最佳发酵条件下，C. aquatile gxas1对虾壳废弃物达到最大降解率60%，其中脱蛋白率为76.77%，几丁质回收率为87%。该研究为微生物降解虾蟹壳废弃物提供了重要的理论依据。     

石榴枯萎病的生防木霉菌株的筛选及鉴定

目的 石榴枯萎病是由甘薯长喙壳菌引起,对石榴有严重危害的土传病害。利用拮抗微生物抑制病原菌的繁殖是石榴枯萎病绿色防控的有效手段。通过筛选具有对石榴枯萎病原菌产生拮抗效果的微生物,研究其抑制菌作用,以期为石榴枯萎病生物防控提供菌种资源。方法 从石榴的根际土壤中分离出真菌,根据产孢量、生长速率、拮抗系数及平板对峙结果进行筛选,对防效较好的真菌根据形态学和分子系统学进行鉴定,通过盆栽实验评估其对石榴枯萎病的防治效果。结果 能有效抑制石榴枯萎病菌菌丝的生长的菌株T9经鉴定为非洲哈茨木霉菌（Trichoderma afroharzianum）,盆栽防治效果最高可达71.35%。结论 该菌株展现出了对石榴枯萎病的生物防治效果,具有应用价值。     

涠洲岛珊瑚礁海洋真菌的分离鉴定及其抗MRSA活性筛选

本研究从广西涠洲岛礁栖珊瑚、海绵和海藻等样品中挖掘海洋真菌资源,旨在筛选发现潜在的具有抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）活性的菌株。研究首先采用稀释分离法从采集的珊瑚、海绵和海藻等样品中分离纯化出真菌,基于内转录间隔区（ITS）序列和系统发育树分析对菌种进行鉴定;然后采用大米培养基对分离得到的单一菌株进行小量发酵,利用乙酸乙酯提取浓缩获得提取物;最后采用薄层色谱（TLC）、高效液相色谱（HPLC-DAD）等方法分析菌株提取物中代谢产物的丰富度,并采用滤纸片琼脂扩散法对菌株粗提物进行抗MRSA活性初步筛选。结果从样品中分离获得40株海洋真菌,以曲霉属（Aspergillus）和木霉属（Trichoderma）为主,其中A.terreus MF01、A.flavus MF07、T.asperellum HP01、Fusarium equiseti HP08和A.unguis HP17等菌株具有丰富的代谢产物及抗MRSA活性。本研究发现的菌株MF01、MF07、HP01、HP08和HP17具有潜在的抗MRSA活性,为后续开展活性代谢产物研究提供基础资料。     

木糖发酵菌株的筛选

本实验利用传统的方法从森林土样中分离筛选出一株能有效发酵木糖生产乙醇的酵母菌株。首先通过富集培养、初筛、复筛等步骤筛选出一株（1#菌株）能够利用木糖的酵母菌株,对其进行了生理生化性能指标试验,初步鉴定为假丝酵母菌（Candida sp.）。并对其进行了利用木糖发酵乙醇试验,实验结果表明：在培养温度为30℃,pH5.0,接种量为10％左右,初始木糖浓度为40g/L时,该菌株可以利用木糖发酵生产乙醇,产乙醇量为1.06g/100mL,相当于理论转化率的56.9%。     

近十年海洋来源木霉属真菌次生代谢产物研究进展

木霉（Trichoderma spp.）是一类自然界广泛存在于土壤中的真菌类群,属于半知菌门（Deuteromycotina）丝孢目（Moniliales）木霉属（Trichoderma sp.）。海洋中的木霉属真菌因其高盐、高压和缺氧的特殊环境,能够产生更多结构新颖、生物活性独特的次生代谢产物。木霉属真菌的次生代谢产物主要包括聚酮、肽类、萜类以及其他类型,这些化合物具有细胞毒、抗菌、酶抑制等多种生物活性。本文综述近十年来海洋来源木霉属真菌中分离的新次生代谢产物,并对这些新化合物的生物活性进行归纳总结。     

西昌某奶牛场乳房炎病原菌的分离鉴定及药敏试验

目的 为了确定导致西昌市某奶牛场引起乳房炎的病原。方法 无菌采集患病奶牛乳样2份进行细菌分离培养、形态学观察、生化鉴定、溶血酵素基因（khe基因）和16S rRNA基因鉴定、小鼠致病性试验以及药敏试验。结果 （1）分离到1株菌，该菌为革兰氏阴性的粗短杆菌，形态学观察与生化特性均与肺炎克雷伯菌相符合；（2）khe和16S rRNA基因序列与GenBank中肺炎克雷伯菌的同源性分别为99.6%~99.8%和99.7%~100%，因此，将分离菌确定为肺炎克雷伯菌，并将其命名为XC1分离菌株；（3）小鼠致病性试验结果显示，4只接种小鼠均在接种第3天全部死亡，表明XC1分离菌株具有较强的毒力；（4）药敏试验结果显示，XC1分离菌株对恩诺沙星、诺氟沙星、头孢比肟和头孢他啶高度敏感，对妥布霉素、庆大霉素和新霉素中度敏感，对红霉素、氨苄西林和阿莫西林耐药。结论 该奶牛场发生的乳房炎与肺炎克雷伯菌感染有关，且XC1分离菌株对临床常用的抗生素存在不同程度的耐药性。     

发酵木糖高产乙醇树干毕赤酵母菌株的Co60诱变选育

【目的】选育能够利用木糖高产乙醇的酵母菌株。【方法】采用Co60诱变树干毕赤酵母(Pichia stipitis),筛选乙醇产量高的突变菌株,并对原始菌株、突变菌株的生长发酵特性和两个菌株对高浓度木糖、乙醇的耐受性进行比较。【结果】在YPX培养基上筛选获得1株能够高效发酵木糖的突变菌株1K-9。该菌株在50mL 15%FM发酵84h,发酵液乙醇含量最高达(51.034±0.112)g/L,比原始菌株提高10.05%;在500mL 15%FM发酵96h,乙醇含量最高达(51.390±0.119)g/L;在500mL 20%FM发酵156h,乙醇含量最高达(52.496±0.513)g/L。菌株1K-9在HSM培养基或含4%~5%乙醇的YPX培养基中生长良好,在含6%~7%乙醇的YPX培养基中生长缓慢。【结论】Co60诱变对于树干毕赤酵母(Pichia stipitis)菌株是有效的,能选育出木糖高产乙醇酵母菌株1K-9。     

Fermentation of xylose to produce ethanol by recombinant <Emphasis Type="Italic">Saccharomyces cerevisiae</Emphasis> strain containing <Emphasis Type="Italic">XYLA</Emphasis> and <Emphasis Type="Italic">XKS1</Emphasis>

Fermentation of the pentose sugar xylose to produce ethanol using lignocellulosic biomass would make bioethanol production economically more competitive. Saccharomyce cerevisise, an efficient ethanol producer, cannot utilize xylose because it lacks the ability to convert xylose to its isomer xylulose. In this study, XYLA gene encoding xylose isomerase (XI) from Thermoanaerobacter tengcongensis MB4T and XKS1 gene encoding xylulokinase (XK) from Pichia stipitis were cloned and functionally coexpressed in Saccharomyces cerevisiae EF-326 to construct a recombinant xylose-utilizing strain. The resulting strain S. cerevisiae EF 1014 not only grew on xylose as sole carbon source, but also produced ethanol under anaerobic conditions. Fermentations performed with different xylose concentrations at different temperatures demonstrated that the highest ethanol productivity was 0.11 g/g xylose when xylose concentration was provided at 50 g/L. Under this condition, 28.4% of xylose was consumed and 1.54 g/L xylitol was formed. An increasing fermentation temperature from 30℃ to 37℃ did not improve ethanol yield.     

生物脱毒改善蔗渣水解物木糖醇发酵性能的研究

为提高热带假丝酵母Candida troplicalis 1-18代谢产物木糖醇的产量,本研究以蔗渣半纤维素稀酸水解物作为研究材料,以生物脱毒菌株东方伊萨酵母Issatchenkia orientalis S-7细胞干重、水解物在280 nm处紫外吸收物含量、木糖醇产量作为评价指标,考察尿素、pH值、脱毒时间、预浓缩比例和细胞循环利用等5个因素对蔗渣半纤维素稀酸水解物木糖醇发酵性能的影响。结果表明,蔗渣半纤维素稀酸水解物采用Ca（OH）₂调节pH值为5,预浓缩至1/2体积,添加2 g·L^-1尿素,东方伊萨酵母S-7生物脱毒40 h,脱毒后水解物预浓缩至木糖浓度为150 g·L^-1时,热带假丝酵母1-18发酵的木糖醇产量最高,达134.5 g·L^-1,比对照组高出70 g·L^-1;循环利用细胞进行生物脱毒,脱毒时间缩短13 h;循环利用热带假丝酵母1-18对生物脱毒水解物进行产醇发酵,木糖醇产量达163.8 g·L^-1,生成速率为5.85 g·L^-1·h^-1,比第一代发酵（1.95 g·L^-1·h^-1）提高2倍。生物脱毒是改善木质纤维稀酸水解物木糖醇发酵性能的有效手段。     

酿酒酵母呼吸突变株的高糖胁迫反应研究

【目的】研究野生型甘蔗糖蜜发酵高产乙醇菌株MF1002及其糖分利用能力显著提高的呼吸突变菌株MF15c在高糖胁迫下的生理特性变化。【方法】测定在高糖胁迫下菌株的生长速率、出芽率、乙醇产量和超氧化物歧化酶(SOD)活力、过氧化氢酶活力、过氧化物酶活力以及细胞质和线粒体的ATP酶活力。【结果】在葡萄糖浓度分别为25%、30%和40%的高糖培养基中,MF15c菌株生长和乙醇发酵受抑制的程度均明显低于MF1002。当葡萄糖浓度为30%和40%时,MF15c的最大菌体数目、最高出芽率和乙醇发酵浓度等均显著高于MF1002。当葡萄糖浓度为30%时,两菌株胞内的SOD活力、过氧化氢酶活力、过氧化物酶活力以及细胞质和线粒体的ATP酶活力均显著上升。其中,MF15c的胞内SOD活力、胞内过氧化物酶活力、细胞质ATP酶活力和线粒体ATP酶活力在高糖胁迫下的上升幅度显著高于MF1002。【结论】MF15c较MF1002具有更强的高糖耐受能力。SOD活力、过氧化氢酶活力、过氧化物酶活力以及细胞质和线粒体的ATP酶均参与了两菌株的高糖胁迫反应,胞内SOD活力、胞内过氧化物酶活力、细胞质ATP酶活力和线粒体ATP酶活力可能与MF15c菌株的高糖耐受能力有关,可作为进一步改造该菌株的指导指标。     

原位预处理甘蔗糖蜜对耐高温酿酒酵母突变株Saccharomyces cerevisiae AQ生产乙醇的影响

【目的】探讨和分析原位预处理糖蜜促进酿酒酵母生长和乙醇生产的原因,开发一条绿色、低成本糖蜜乙醇生产途径。【方法】先在不同温度和初始糖浓度条件下,考察酿酒酵母原始菌株Saccharomyces cerevisiae A及其突变株Saccharomyces cerevisiae AQ的生长和乙醇生产性能差异,再以原位预处理前后糖蜜为发酵底物,测定突变株Saccharomyces cerevisiae AQ在不同培养基中的生长量、出芽率、乙醇产量、胞内超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶、细胞质内ATP酶和线粒体内ATP酶活力,研究原位预处理糖蜜对其生理特性的影响。【结果】在高温发酵糖蜜过程中,突变株Saccharomyces cerevisiae AQ较原始菌株Saccharomyces cerevisiae A表现出更好的生长和乙醇发酵稳定性。当以原位预处理糖蜜作为Saccharomyces cerevisiae AQ唯一碳源时,其胞内SOD酶、过氧化物酶、细胞质内ATP酶和线粒体内ATP酶活力较以糖蜜原料为唯一碳源时分别提高2.51倍,0.92倍,1.80倍和1.45倍,乙醇收率为31.07%,较以糖蜜原料为唯一碳源时提高36.26%。【结论】突变株Saccharomyces cerevisiae AQ较原始菌株Saccharomyces cerevisiae A更适用于糖蜜发酵生产乙醇体系,且新型的原位预处理方法能通过增强Saccharomyces cerevisiae AQ在糖蜜培养基中的呼吸作用,提高菌株活力,从而进一步提高乙醇收率。     

海绵Pseudoceratina sp.共栖细菌多样性及其抑制甘蔗鞭黑粉菌活性研究

【目的】探讨广西斜阳岛附近海域海绵共附生细菌的多样性,并筛选对甘蔗鞭黑粉菌有抑制作用的活性物质,为发现潜在的细菌新物种及开发农用生防菌肥奠定基础。【方法】采用稀释涂布法,通过6种复合营养分离培养基,从海绵Pseudoceratina sp.中分离可培养的共附生细菌。采取细菌形态学观察去除冗余,通过PCR扩增菌株的16SrRNA基因序列,并通过构建系统发育树分析物种多样性。采用牛津杯法进行抑制甘蔗鞭黑粉菌活性筛选实验。【结果】从海绵Pseudoceratina sp.中共分离到可培养细菌54株,经16SrRNA基因序列对比后,获得24株细菌,隶属于13科14属。其中,菌株BGMRC 2118与已发表有效菌株的16SrRNA基因序列的最高相似率为96.46%,可能为潜在新种。抑菌筛选实验结果显示,有8株细菌的发酵粗提物对甘蔗鞭黑粉菌具有很强的抑菌活性。【结论】广西斜阳岛附近海域中海绵共附生细菌具有较高的物种多样性,蕴藏着丰富的新物种资源,富含生物活性菌株。     

魔芋内生细菌抗软腐病菌株筛选

通过组织分离法从魔芋块茎中分离得到内生细菌,用牛津杯法皿内测试内生细菌对魔芋软腐病菌的拮抗作用,以筛选拮抗软腐病菌能力强的菌株。结果显示从魔芋块茎中分离得到35株内生细菌,35株内生细菌对魔芋软腐病菌均有不同程度的拮抗活性,不同菌株间拮抗活性存在显著差异。初筛中,对软腐病菌相对抑制率(RIR)达到50%以上的内生细菌有17株,100%的有11株。复筛中RIR为100%的内生细菌有8株,其中7株胞外产物的RIR超过了150%。     

广西北部湾大宗海水养殖鱼类卵形鲳鲹感染溶藻弧菌及其致病性研究

【目的】2016年广西钦州湾近海网箱养殖的卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus)发生以体表皮肤溃烂、皮下出血、内脏器官病变为典型症状的细菌性疾病,通过对患病卵形鲳鲹中病原菌进行分离、鉴定与保存,为后续开展病原菌快速检测技术和防控技术等研究,以及控制相关病原菌在海水养殖中的暴发和流行奠定基础。【方法】利用LB平板和TCBS平板从患病卵形鲳鲹体表溃烂病灶、肾脏、肝脏组织中分离纯化疑似病原菌,并对其进行常规形态特征和生理生化反应的生物学检验,通过16SrDNA基因测序对疑似病原菌株进行分子生物学鉴定,在细胞和鱼体水平开展病原菌的致病性研究,同时进行人工感染的回接试验。【结果】分离得到4株疑似病原菌(TOQZ01,TOQZ02,TOQZ03,TOQZ04),基于其表型、分子生物学特征和进化关系,判定4株菌株均为弧菌属的溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus),且细胞毒性试验和回归试验证实,分离得到的溶藻弧菌为此次卵形鲳鲹发病的病原菌。【结论】溶藻弧菌是引起广西沿海地区海水养殖鱼类发生细菌性鱼病的主要致病菌之一,未来将基于本研究中分离得到的溶藻弧菌开展病害快速检测技术和防控技术等现代海水生态健康养殖关键技术研究,以实现对广西海水养殖溶藻弧菌病的快速诊断、实时监控和有效预防。     

具有反秀丽隐杆线虫捕食能力的根际细菌的筛选及其反捕食机理的研究

虽然生物菌肥具有多效、环保、可持续等多种优点,但经常被生活在土壤中的其他生物捕食而减少其实际应用效果.细菌为应对捕食演化出多种机制,排斥或杀死线虫.对具有反捕食能力的菌株进行筛选,能够得到具有高竞争力的菌株.以秀丽线虫为样本,对细菌进行对峙试验,得到两株具有较高反捕食能力的植物促生细菌:橘黄假单胞菌(Pseudomonas aurantiaca)JD37、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)P13.以大肠杆菌(Escherichia coli)OP50为对照,线虫对3株细菌的偏好性由强至弱依次为P13、OP50、JD37.缓慢杀线试验中,JD37、P13对秀丽线虫的致死率分别达26.12%和18.66%.在单培养下,JD37能使线虫活力下降,产卵数量减少.化学和分子生物学研究显示:JD37不能产生任何已知的杀线次级代谢产物,而P13能够产生氰化氢(HCN).以上结果表明JD37能够抵御秀丽线虫捕食,在捕食压力下有较强竞争力,作为生物菌肥具有广泛的应用前景.