短小芽孢杆菌基因无痕修饰系统的建立及应用

为了实现对短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)SCU11基因组连续地无痕改造,提高碱性蛋白酶产量,本文建立了基于Upp基因反向筛选的短小芽孢杆菌基因无痕修饰系统,将碱性蛋白酶基因AprE的1份拷贝无痕插入至短小芽孢杆菌染色体16S rDNA区.摇瓶发酵实验显示,突变菌株碱性蛋白酶活最高达到7125 U/mL,与出发菌株相比提高了33.1%.结果表明利用该系统可实现对短小芽孢杆菌基因组的无痕修饰,对AprE插入突变菌株进行双交换筛选的最终效率约为23.07%.     

短小芽孢杆菌遗传操作系统的建立及应用

短小芽孢杆菌SCU11产生的胞外碱性蛋白酶具有良好的生皮脱毛效果,在生物制革领域有很大的应用前景.但该菌株的遗传转化系统尚未建立起来,限制了菌株的遗传改造和基因功能研究等方面的工作.本研究采用高渗透压电转化法,实现了对短小芽孢杆菌的电转化;在Ebuffer配方为甘露醇1M,山梨醇0.5M,甜菜碱7.5%,甘油10%,电场强度24KV/cm条件下,转化效率为3.5×10~3 CFU/μg DNA.构建了E.coli-Bacillus穿梭载体pUCETs,建立了短小芽孢杆菌基因敲除体系,利用该系统成功敲除了基因组中的peptidaseC40基因.本研究所建立的电转化系统及基因导入/敲除体系,为短小芽孢杆菌基因组编辑奠定了基础.     

枯草芽孢杆菌AS1.398中性蛋白酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的高效表达

将编码枯草芽孢杆菌AS1.398 的中性蛋白酶功能区和包含前导区序列(“pro”序列)在内的全长基因克隆到酵母整合型质粒pPIC9K中,电转化His4 缺陷型巴斯德毕赤酵母SMD1168,通过MD-G418平板、PCR方法筛选和鉴定重组子。重组子发酵液经SDS-PAGE分析和酶活测定表明,枯草芽孢杆菌AS1.398的全长中性蛋白酶基因在毕赤酵母中获得了高效表达,表达产物分泌至培养基中,分子量约为43kD。经甲醇诱导培养后,发酵液中的中性蛋白酶活力达20000 U/mL。     

中温α-淀粉酶基因在枯草芽孢杆菌中的整合及高效表达

从中温α-淀粉酶生产菌株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)264中克隆得到中温α-淀粉酶基因(amy L)并构建了重组表达质粒p AX01-amy L。该质粒转化枯草芽孢杆菌264后利用同源重组机制将由木糖操纵子引导的amy L表达盒整合入枯草芽孢杆菌染色体的lac A位点,以增加中温α-淀粉酶基因的拷贝数。经淀粉平板产酶初筛及Southern blot鉴定,成功分离获得了可高效分泌表达中温α-淀粉酶的基因工程菌ZHWY。该菌株在摇瓶发酵75 h后α-淀粉酶酶活可达到730 U/m L,比酶活为156 U/mg总蛋白,与原始菌株264相比提高了70%,且继代过程中表达水平稳定。在5 L发酵罐中,枯草芽孢杆菌ZHWY发酵所产中温α-淀粉酶酶活最高达到1450 U/m L,具有良好的工业应用前景。     

地热田碱性蛋白酶菌株的选育与酶性质的研究

从温泉附近土样中成功分离到一株高温碱性蛋白酶产生菌株H-1,经初步鉴定为芽孢杆菌(Bacillus).菌株H-1最佳产酶的发酵时间为67.5h,该酶在30～70℃酶活性随温度升高而增强,70℃酶活性达到最高,在pH7.0～11.0范围内较稳定,从菌株H-1液体发酵液中提取粗酶液,经CMC-I阳离子交换层析和SepHadex G-75凝胶层析,得到单一组分;通过Native-PAGE、SDS-PAGE电泳鉴定,粗酶至少含有3种碱性蛋白酶同工酶;单组分碱性蛋白酶的比活力为3875U,相对分子量约为31KDa.     

成孢延迟蛋白基因对枯草芽孢杆菌生物量和发酵酶活力的影响

探讨同种相噬对枯草芽孢杆菌内源酶发酵活力的影响.应用同源重组敲除的方法,构建了枯草芽孢杆菌168菌株的编码成孢延迟蛋白毒素前体的基因sdp C的knock-in突变株,比较了突变株和出发菌株的生物量、芽孢数和α-淀粉酶发酵活力.与出发菌株相比,突变株的生物量、芽孢数和α-淀粉酶发酵活力均显著提高,产酶高峰期酶活力提高23%.本研究结果显示,sdp基因突变不仅能够提高枯草芽孢杆菌的生物量,还能够提高其内源酶的发酵活力.     

芽孢缺失对D-核糖产量的影响

利用原生质体紫外线诱变的方法处理转酮酶缺陷型短小芽孢杆菌,选育到一株丧失芽孢形成能力的转酮酶缺陷型短小芽孢杆菌,摇瓶培养D-核糖平均产量达到66g/L,较出发菌株提高38%.研究表明,芽孢生成缺陷有利于D-核糖的产生,筛选芽孢生成能力缺陷的菌株是选育D-核糖高产菌株的有效手段.     

绿色荧光蛋白(GFP)基因在短小芽孢杆菌中的组成型表达

采用PCR技术,亚克隆来自短小芽孢杆菌总基因组中的启动子活性片段F1,构建了一个大肠杆菌-短小芽孢杆菌穿梭表达载体pHY300-F1gfp,以缺失启动子的绿色荧光蛋白(GFP)基因为报告基因,检测了该片段在短小芽孢杆菌DX01菌株中的启动活性,在荧光显微镜下,观察到了明亮的绿色荧光,证实活性片段F1具有组成型启动子的功能,GFP基因在短小芽孢杆菌中实现了组成型表达．     

产β-葡萄糖苷酶芽孢杆菌的筛选及水解大豆异黄酮糖苷研究

为获得能高效水解大豆异黄酮糖苷的芽孢杆菌,利用七叶苷平板分离法从动物的新鲜粪便中筛选产β-葡萄糖苷酶的芽孢杆菌菌株,然后对酶活最高的菌株进行种属鉴定和水解大豆异黄酮糖苷的研究.结果显示:筛选到1株酶活力较高的芽孢杆菌R2-2,经鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens);该菌株有较高的糖苷水解能力,黄豆苷水解率最高达到53.65%,染料木苷为48.80%.     

一株短小芽孢杆菌的16S rDNA基因序列分析

从黄颡鱼中分离得到一株优势菌BP-1,经过形态观察、生理生化试验和16S rDNA基因序列分析,表明该菌为发酵型,能运动,革兰氏阳性杆菌.获得的16S rDNA基因序列长度为1478 bp,Gen Bank数据库中登录号为KP299290.该序列与GenBank数据库中多条短小芽孢杆菌16S rDNA基因序列相似性高达99%,系统进化树上与短小芽孢杆菌亲缘关系最近,从而判定菌株BP-1为短小芽孢杆菌.这为短小芽孢杆菌的鉴定和分类提供科学依据.     

两株松材线虫拮抗细菌的筛选和鉴定

【目的】筛选对松材线虫具有较高杀线活性的拮抗细菌。【方法】以分离自南京、洛阳、上海的松树茎部的137株内生细菌为研究对象,采用培养滤液和菌悬液浸渍法对这些菌株进行杀线活性的测定,并对筛选的高效拮抗细菌进行菌种鉴定。【结果】通过培养滤液浸渍试验筛选出3株细菌对松材线虫有较高的杀线活性,使用3种菌滤液处理线虫48 h后,线虫死亡率均达到100%,其中菌株LYMC-3的培养滤液还可使线虫虫体出现消解。将3株菌的培养滤液分别稀释2倍、4倍和10倍后处理松材线虫,随稀释倍数的增加,培养滤液的杀线活性逐渐降低。处理线虫48 h后,菌株LYMC-3的10倍稀释滤液与其他两株菌滤液相比对线虫的致死率最高,为94.7%; 在菌悬液浸渍试验中筛选出菌株NJSZ-13对松材线虫有较高杀线活性,10⁵ cfu/mL 浓度的菌悬液处理线虫48 h后,线虫死亡率达81.5%。通过对LYMC-3和NJSZ-13菌株的形态特征、生理生化特征、Biolog鉴定和16S rDNA序列以及系统发育分析,确定菌株LYMC-3、NJSZ-13分别为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)和蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)。【结论】从松树体内筛选到两株对松材线虫有高效拮抗活性的菌株LYMC-3和NJSZ-13,对生物防治松材线虫病具有潜在的应用价值。     

温和气单胞菌对齐口裂腹鱼血清中抗氧化酶的影响

为探讨温和气单胞菌对齐口裂腹鱼抗氧化能力的影响,采用人工回感实验对齐口裂腹鱼注射温和气单胞菌,在6个不同时间点测定4个血清指标：总抗氧化能力(T-AOC)、过氧化氢酶(CAT) 、总超氧化物歧化酶活性(T-SOD)和黄嘌呤氧化酶(XOD)。结果表明：齐口裂腹鱼在感染48h后出现明显症状,与对照组相比,感染组血清T-SOD活力在感染12h后上升出现差异极显著(P<0.01),但在24h后显著下降。T-AOC在感染初期出现上升,48h呈极显著性升高,随后下降。CAT活性在感染初期明显增强,48h时出现极显著性差异(P<0.01),但72h后开始下降。XOD活性在感染24h后呈直线上升趋势。这有利于深入研究温和气单胞菌对鱼的致病机理。     

盐度、温度和pH对2株海南地衣芽孢杆菌相对蛋白酶活性的影响

采用脱脂牛奶平板法,测定了不同盐度、温度和pH对2株分离白海南热带海水养殖系统的地衣芽孢杆菌（Bacillus lichen@rmis）Pb．WC09001和Pb—WC09002的相对蛋白酶活性的影响．结果表明：随着盐度的增加,2个菌株的相对蛋白酶活性都趋于减弱,当盐度增加到50时,仅Pb-WC09001还存在一定的酶活性,其相对蛋白酶活性为1．56U·mL-1,说明Pb—WC09001对高盐度环境的适应性更强．此外,还测定了在18～38℃（以4℃为梯度差）范围内菌株的相对蛋白酶活性,当在与菌体培养相同的温度下测定培养液的酶活时,Pb-WC09001与Pb—WC09002酶活性最高的温度均为34℃;当在30℃测定2个菌株在不同温度下的培养液酶活时,酶活性最高的培养液所对应的培养温度分别为22℃和30℃,说明这2个菌株在相同温度下可产生不同的蛋白酶,同时,Pb-WC09001在低温环境下的相对酶活性强于Pb-WC09002．在30℃、盐度30、菌体终浓度为2×10^3／mL时,Pb-WC09001在pH8．0、Pb—WC09002在pH7．5时的酶活性最高,相对酶活均为2．74U·mL-1,因此,Pb-WC09001对海水环境（pH8．0—8．4）的适应性更强．     

短小芽孢杆菌碱性蛋白酶基因在枯草芽孢杆菌WB600中的表达

将来源于枯草芽孢杆菌WB600的启动子PyxiE与碱性蛋白酶基因进行融合,将融合片段插入到大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体pSUGV4中,构建了表达质粒pSUPyAp. 将该质粒转入枯草芽孢杆菌WB600中,得到转化子pSUPyAp/WB600,它在启动子PyxiE驱动下,能够在牛奶平板上产生透明的水解圈,其发酵上清液中的碱性蛋白酶活性最高为518.5 U/mL,其酶活分别是在启动子Bp53和P43驱动下的3.01倍和1.22倍.     

微生态制剂A对罗非鱼生长及消化酶活性的影响

以奥尼罗非鱼为试验对象,考察以枯草芽孢杆菌和紫色非硫光合菌为主要成分制成的微生态制剂A对罗非鱼生长及消化酶活性的影响.结果显示:与对照组相比,饲料中添加微生态制剂A能够降低罗非鱼养殖饵料系数16.91%,体质量提高9.78%;能显著或非常显著地提高罗非鱼胃、肠道和肝脏中的淀粉酶活性(P0.05或P0.01)和脂肪酶活性(P0.05或P0.01);能够显著提高罗非鱼肠道胰蛋白酶的活性(P0.05).可见,微生态制剂A有降低罗非鱼养殖饵料系数和促进生长的作用.     

短小芽孢杆菌LC01的鉴定及其芽孢漆酶性质的研究

【目的】对前期获得的1株具有较高漆酶活性的细菌菌株LC01进行鉴定及相关酶学性质研究,以开发具有较好工业应用特性的细菌漆酶。【方法】通过形态观察和生理生化实验,结合16S rDNA序列分析对菌株进行鉴定,测定其芽孢漆酶在不同条件下的催化性质及染料降解能力。【结果】经鉴定菌株LC01为短小芽孢杆菌,该菌株的芽孢漆酶氧化底物2,2'-连氮-二(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)、丁香醛连氮和2,6-二甲氧基苯酚的最适pH分别为3.0、6.6和8.6,以丁香醛连氮为底物的最适催化温度为80 ℃,在pH 9.0放置10 d或50 ℃处理10 h后均有较高活性。在pH 9.0时,芽孢漆酶-介体系统能有效脱色不同结构的染料。对染料活性黑5和靛红反应1 h后脱色率达90%以上,对RB亮蓝的脱色6 h后也达到了90%。【结论】短小芽孢杆菌LC01的芽孢漆酶能有效脱色染料且在碱性和高温条件下具有良好稳定性,表明其在多种工业领域具有较好的应用前景。     

一株具有广谱抑菌活性的兵马俑芽孢杆菌HS-15的筛选及其抑菌活性研究

采用高浓度土壤菌悬液涂平板法筛选出45株具有抑菌活性的菌株;以其中一株具有较强抑菌活性的菌株为研究对象,通过细胞形态特征、生理生化实验及16S rDNA序列分析等方法,将其鉴定为兵马俑芽孢杆菌,并命名为Bacillus bingmayongensis HS-15;分别用点植法和平板对峙法检测HS-15对细菌和真菌的抑菌活性,结果发现,该菌株对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌都有较强的抑制作用,是一株广谱微生物拮抗菌;发酵条件优化结果表明,28 ℃发酵20 h时,发酵液对金黄色葡萄球菌的抑菌活性最强;经透析袋处理,抑菌活性没有变化,而胰蛋白酶和蛋白酶K处理后,抑菌活性丧失,初步推测抑菌物质为蛋白质类.本研究丰富了产抑菌活性物质微生物菌种资源库,为天然防腐剂的开发提供理论基础.     

产中性蛋白酶工程菌的构建及其发酵条件的初步优化

为构建1株产中性蛋白酶的工程菌株并对其发酵条件进行优化,以中性蛋白酶工业生产菌株枯草芽孢杆菌AS1.398的基因组为模板,采用PCR技术扩增获得中性蛋白酶基因npr,与高拷贝质粒pWB980连接并转入蛋白酶缺陷型菌株枯草芽孢杆菌WB600中得到重组工程菌WB600/pWB980-npr.在初筛平板上工程菌蛋白酶活力明显高于工业生产菌AS1.398,工程菌发酵活力可达1,398.3,U/mL.通过对其发酵工艺进一步优化,在接种量5%、装液量100,mL/500,mL、摇床转速180,r/min、温度34,℃的条件下发酵48,h,发酵液的酶活力可达2,487.5,U/mL,比优化前提高了78%.     

发酵海带对刺参生长和免疫及消化生理的影响

对枯草芽孢杆菌发酵海带的条件进行优化,并以此发酵海带饲养刺参,结果表明,枯草芽孢杆菌发酵海带的优化条件为发酵温度30 ℃、适宜发酵时间96 h、接种剂量12%,发酵后海带的粗蛋白含量为14.65%,相对提高了15.17%。在36 d饲养时间内,实验组在刺参的配合饲料中添加了30%的发酵海带,刺参特定生长率、溶菌酶活性、超氧化物歧化酶活性、酸性磷酸酶活性、蛋白酶活性和淀粉酶活性皆有显著提高（P<0.05）,但是,刺参体腔液细胞数量、纤维素酶活性皆无显著变化（P>0.05）,此外,刺参摄食发酵海带还导致其消化道异养菌总数减少、弧菌相对数量降低、芽孢杆菌相对数量升高。由此可见,投饲枯草芽孢杆菌发酵海带能够促进刺参生长,提高消化酶活性和免疫力,调节肠道菌群结构。     

短小芽孢杆菌BA06的比较基因组分析

将短小芽孢杆菌BA06与其他18个短小芽孢杆菌菌株进行全基因组比较,鉴定出BA06基因组中有包括抗性岛、毒力岛、共生岛在内的12个基因组岛或噬菌体序列.基因家族分析鉴定出BA06有3个特异性基因家族,9个基因家族发生扩张,3个基因家族有所收缩.表明BA06在短小芽孢杆菌这一菌种中具有突出的抗药性与运动能力,并具有除皮革脱毛外更多的生物学特性.