褐藻胶裂解酶AlgL17酶解工艺优化及酶解产物分析

为探索重组褐藻胶裂解酶AlgL17酶解工艺的优化条件,采用3,5-二硝基水杨酸法(3,5-dinitrosalicylic acid,DNS)和苯酚-硫酸法分别测定反应生成的还原糖及总糖含量,计算平均聚合度,从反应温度、反应pH值、底物质量分数、加酶量及振荡速率5方面探讨各因素对酶解反应的影响,确定褐藻胶裂解酶酶解工艺的最优条件。结果表明,AlgL17酶解海藻酸钠的最优工艺条件:反应温度为35℃,pH=8. 0,初始底物质量分数为1. 1%,加酶量为1. 16 U,不振荡反应180 min。在此条件下,产生的还原糖质量浓度为7. 09 g/L,酶解产物的平均聚合度为2。液相色谱质谱联用(liquid chromatography-mass spectrometry,LC-MS)分析海藻酸钠酶解终产物为单糖、二糖、三糖和四糖。     

假交替单胞菌κ-卡拉胶酶的酶解工艺优化及产物分析

为探索假交替单胞菌κ-卡拉胶酶的酶解工艺,以κ-卡拉胶为底物,还原糖生成量为评价指标,对酶解工艺进行优化。采用3,5-二硝基水杨酸法和苯酚 硫酸法分别测定还原糖和总糖含量,计算酶解产物的平均聚合度,并利用质谱鉴定酶解产物。结果显示,假交替单胞菌κ-卡拉胶酶降解κ-卡拉胶的优化工艺条件为:加酶量为0.35 U（反应体系5 mL）,反应温度为40 ℃,反应pH=8.0,κ-卡拉胶底物质量浓度为9 g/L。在此条件下,酶解反应240 min后产生的还原糖质量浓度为1.531 g/L,酶解产物的平均聚合度为2。该κ-卡拉胶酶酶解反应的Km=2.07 g/L,Vmax=7.25 U/mg。质谱分析显示,假交替单胞菌κ-卡拉胶酶降解κ-卡拉胶的产物为κ-卡拉胶二糖和κ-卡拉胶四糖。     

高效褐藻胶降解菌的筛选与产酶条件优化

以海藻酸钠为唯一碳源,从天然腐烂海带中筛选得到一株高效褐藻胶降解菌株53#,经形态学观察和16S r RNA鉴定,确定为类芽孢杆菌Paenibacillus agaridevorans。采用正交试验方法,以p H、温度、Na Cl浓度和海藻酸钠初始浓度为影响因素,对该菌株的产酶条件进行优化,得到53#菌的最佳产酶条件:p H=8,25℃,Na Cl浓度15 g/L,海藻酸钠初始浓度15 g/L。在最佳产酶条件下,褐藻胶裂解酶最大酶活可达390.53±17.32U/m L。筛选得到的类芽孢杆菌Paenibacillus agaridevorans 53#具有易于培养、产酶速度快和酶活力高等优点,能够实现褐藻胶的高效糖化,在褐藻生产生物乙醇领域具有潜在利用价值。     

褐藻胶裂解酶发酵工艺优化及其中试放大

对产微球茎菌（Microbulbifer sp.）ALW1发酵产褐藻胶裂解酶5 L罐发酵工艺进行优化,建立褐藻胶裂解酶的高产发酵工艺。结果表明:海藻酸钠质量浓度为1 g/L时效果最好,浓度减半或加倍都会使酶活力下降;25 ℃比20 ℃更利于产酶;pH值控制在7.5时比自然条件下发酵产酶高峰提前,产酶量变化不大;在此基础上,对罐上工艺进行中试放大,20 L发酵罐酶活力最高为57.0 U/mL,200 L罐酶活力最高为43.5 U/mL,500 L罐酶活力最高为38.3 U/mL,分别是小试水平的39.6%、30.2%、26.5%。     

褐藻胶裂解酶基因的克隆、表达载体构建以及表达条件的研究

以产褐藻胶裂解酶的紫色链霉菌(Streptomyces violaceoruber)为出发菌株,应用基因工程技术,将褐藻胶裂解酶aly基因进行克隆,并构建了该基因的重组表达载体pET23b(+)-aly.通过表达条件的初步优化,实现了aly基因在大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)中的成功表达.在IPTG诱导浓度为0.1mmol/L,诱导时间为8h,诱导温度为16℃的条件下,细胞破壁后上清中ALY粗酶液活力为6U/mg.根据褐藻胶裂解酶ALY的蛋白质结构预测结果推断该酶属于Algi-nate lyase-2家族,理论pI为8.85,理论分子量大小为28 500,化学式为C1252N1920H356O394S9.SDS-PAGE蛋白电泳检测发现,ALY蛋白的分子量约为28 000,与预测的蛋白分子量较为接近.     

Pseudomonas syringae褐藻胶裂解酶基因的克隆及信息学分析

以Pseudomonas syringae的基因组为模板,使用褐藻胶裂解酶引物进行PCR扩增,将目的基因克隆至p MD18-T载体后进行测序.结果显示,克隆基因的大小为1137 bp,预测编码含有378个氨基酸残基的蛋白质.对该蛋白质进一步进行生物信息学分析,结果表明,该蛋白质序列与其他菌株来源的褐藻胶裂解酶具有高的相似性,预测本研究克隆的基因编码褐藻胶裂解酶.该褐藻胶裂解酶的理论分子质量为42.5 ku,理论等电点为8.15.采用同源建模法建立P.syringae褐藻胶裂解酶的三维结构,富含螺旋结构.     

产褐藻胶裂解酶菌株的筛选及发酵条件优化

为进一步探索高产褐藻胶裂解酶菌株,促进其工业化应用,以褐藻酸钠为唯一碳源筛选培养基,从鲍鱼内脏中筛选出一株高产褐藻胶裂解酶菌株B4,通过形态学观察和系统发育分析,鉴定为弧菌属细菌Vibrio sp.B4。通过单因素实验对B4菌株的发酵条件和发酵培养基进行优化,获得发酵培养基的最适碳源为褐藻酸钠10g/L,最适氮源为(NH4)2SO410g/L,最适发酵条件为温度30℃,接种量1%,培养基初始pH 6.0。在单因素实验的基础上,通过Plackett-Burman(PB)筛选出3个影响产酶活力的显著因素:(NH4)2SO4浓度、pH、接种量。通过响应面进一步分析优化,得到最佳的发酵培养基为褐藻酸钠10g/L,(NH_4)_2SO_4 10.91g/L,NaCl 10g/L,KH_2PO_4 1g/L,MgSO4·7H2O 0.5g/L,CaCl_2 0.2g/L,FeSO_4·7H_2O 0.02g/L,最佳发酵条件为温度30℃,接种量1.1%,起始pH 6.07。在最佳培养条件下,褐藻胶裂解酶活力可达19.09U/mL,比基础培养条件下提高了3.67倍。该菌经过产酶发酵条件的优化,酶活力得到较大幅度的提高,且其发酵产酶时间短,可为褐藻胶裂解酶的进一步研究应用提供参考。     

胡芦巴半乳甘露聚糖酶法改性的工艺条件

采用正交实验法优选纤维素酶降解胡芦巴半乳甘露聚糖的最佳工艺条件,以黏均分子质量和还原糖得率为指标,考察了酶解温度、酶解时间、酶用量及pH对降解效果的影响.结果表明,纤维素酶降解最佳工艺条件为:酶用量1500U/g,酶解温度50℃,pH 5.0,酶解时间150min,影响降解工艺的主次因素顺序为:酶解温度>酶用量>酶解时间＞pH.所得产物的黏均相对分子质量1.2×105,还原糖得率5.1%.     

交替假单胞菌BYS-2产褐藻胶裂解酶条件研究

以褐藻酸钠作为褐藻胶裂解酶产生菌初筛培养基唯一碳源,从鲍鱼养殖水样中分离获得一株产褐藻胶裂解酶的微生物,形态学和分子生物学16S rDNA鉴定结果显示,该菌株为交替假单胞菌Pseudoalteromonas sp.BYS-2.对该菌株进行产酶条件研究,获得最适产酶配方为:褐藻酸钠1 g·L~(-1),葡萄糖0.5 g·L~(-1),酵母膏10g·L~(-1),黄豆饼粉3 g·L~(-1),(NH_4)_2HPO_4 3 g·L~(-1),初始培养基pH8.0;最佳产酶条件为:接种量2%(体积分数),装液量50 m L/250 m L,发酵温度20℃,摇床转速200 r·min~(-1),在此条件下发酵24 h酶活力可达5.29 U·m L~(-1),比优化前(1.57 U·m L~(-1))提高2.37倍.     

猪粪便不同酸糖化预处理及其酶解条件研究

探讨了几种酸对猪粪便糖化预处理和预处理后的猪粪便酶解条件的影响.结果表明:强酸预处理猪粪便优于中强酸和弱酸,而5%盐酸在110℃预处理猪粪便4 h可以使还原糖含量达到46.41%.盐酸预处理猪粪便后,影响其酶解的主要因素是酶用量和底物浓度,酶解试验的最佳条件为酶解温度45℃、酶用量300 mg/L、底物浓度15 g/L和pH 4.8.酶解还原糖含量达到11.26%.     

Shewanella haliotis BP-1海藻酸裂解酶基因的克隆表达

【目的】了解海洋细菌Shewanella haliotis BP-1中海藻酸裂解酶降解海藻酸钠的生物活性。【方法】应用基因克隆和大肠杆菌异源表达技术,过量表达海藻酸裂解酶,将粗酶液通过DEAE Sepharose FF柱分离纯化后检测其酶活性。【结果】从S.haliotis BP-1菌株的基因组DNA中克隆得到一个大小为2 157bp的海藻酸裂解酶基因Alg17S,该基因编码的海藻酸裂解酶Alg17S属于PL17家族的蛋白,大小为79 726Da,其中包括N端26个氨基酸的信号肽,与Saccharophagus degradans 2-40菌株产生的海藻酸裂解酶Alg17C具有高度同源性,相似性为52%。经纯化后获得的重组酶Alg17S和△snAlg17S(N端不含26个氨基酸的信号肽)均具有降解海藻酸钠的活性,但△snAlg17S对海藻酸钠的催化活性比Alg17S高,其酶比活力高达9 635U/mg。【结论】重组海藻酸裂解酶△snAlg17S兼具高表达水平及高酶活性,是进一步研究海藻酸盐糖化和生物燃料生产的潜在的优势酶。     

虾类生物保鲜膜的制备技术研究

以凡纳滨对虾为原料,采用茶多酚、海藻酸钠、甘油、硬脂酸等成分为成膜材料,对生物抗菌膜的组分配比和制膜工艺进行研究。结果表明:茶多酚浓度15 g/L、海藻酸钠浓度20 g/L、甘油浓度0.4%、硬脂酸浓度15 g/L的组分配比以及在膜液pH 5.5、存放环境RH<50%的条件下制备的膜具有良好的机械抗菌性能。经过上述条件生产的抗菌膜对凡纳滨对虾及其虾仁具有良好的保鲜效果,虾类保鲜期延长3~4 d,虾仁持水力和感官品质得到不同程度的提高。     

医用藻酸盐敷料体外降解的研究

研究藻酸盐医用敷料体外降解的规律及不同降解时间其产物对内皮细胞增殖情况的影响,为藻酸盐医用敷料在临床使用中提供参考。以PBS缓冲液(模拟体液环境)为降解介质,对藻酸盐敷料进行体外降解;用藻酸盐敷料的失重率、分子质量变化表征本体的变化规律;用降解液中降解产物的糖醛酸含量变化表征降解产物的变化规律。将降解液与内皮细胞共培养,用MTT法检测内皮细胞增殖情况。藻酸盐敷料在模拟体液环境条件下,可以被降解,42 d失重率为61.2%,降解过程中其分子质量逐渐减小,最终产物为糖醛酸,其浓度不断增大。不同时间的降解产物均能促进内皮细胞的增殖。藻酸盐医用敷料体外降解比较快,完全降解的最终产物为糖醛酸,其降解液可以促进内皮细胞的增殖、分化,提高细胞新陈代谢能力,增加新细胞的再生速度,促进伤口的愈合。     

一种新型磁性壳聚糖/海藻酸钠复合凝胶球的制备与性能研究

以海藻酸钠水凝胶为骨架, 结合壳聚糖和磁性Fe₃O₄, 开发出一种新型的磁性壳聚糖/海藻酸钠复合凝胶球(MCSB)制备方法, 并通过正交试验和单因素实验, 探究不同制备条件对复合凝胶球制备效果的影响, 确定最优制备条件: CaCl₂浓度为2.5 g/L, 海藻酸钠浓度为24 g/L, 壳聚糖添加量为5 g/L, 磁流体添加量为4.64 g/L。制备出的凝胶球表面光滑, 大小均匀, 纯黑色, 呈球形, 直径在2 mm左右, 具有顺磁性。通过傅里叶变换红外光谱(FTIR)、同步热分析(TGA)等手段对凝胶球进行表征。结果表明, MCSB的热稳定性良好, 凝胶球表面的活性基团主要有羟基、氨基、羧基等。吸附性能实验表明, 当MCSB用量为20 mg时, 对40 mL 25 mg/LCu²⁺溶液的吸附去除率为78.13%, 表明磁性壳聚糖/海藻酸钠复合凝胶球是一种制备简单、效果良好的新型复合吸附剂。     

壳聚糖-海藻酸钙微球荧光标记反应对微球膜强度影响的研究

以壳聚糖-海藻酸钙载药微球给药后的体内检测为研究背景,探讨不同反应条件下壳聚糖-海藻酸钙微球荧光标记反应对微球膜在模拟体液中的强度影响.以壳聚糖、海藻酸钠为微球制备载体材料,以异硫氰酸酯(FITC)为荧光标记物对微球进行荧光标记.采用标记了FITC的微球在模拟体液中的膨胀率来表征微球膜的相对强度.采用相对分子质量为50 000、脱乙酰度85%、荧光标记浓度0.01 g/mL的壳聚糖,成膜液浓度0.015 g/mL,成膜时间30 min制备出的荧光微球在模拟胃、肠液中表现出良好的膜强度及稳定性.为研究壳聚糖-海藻酸钙载药微球在体内的分布、吸收、降解特性提供了适宜的入体实验条件.     

植物纤维素在微波 HCl/H2O2耦合条件下降解工艺条件的优化

在微波加热条件下, 研究降解条件（催化剂体积分数、 反应温度、 时间）对植物纤维素降解过程的影响, 结果表明, 适宜降解条件为: φ催化剂=5%, 100 ℃反应2 h. 在此条件下, 得到的ρ还原糖=2.15 g/L, 微波加热降解较常规加热还原糖浓度提高了33.5%, 降解率提高了487%. 利用SEM分析微波降解和常规条件下降解产物的结构特征, 结果表明, 微波作用下使纤维素的聚合度降低. 红外分析结果表明, 微波条件与常规条件下的剩余物结构一致.     

普鲁兰酶对柠檬酸发酵残糖降解效果的研究

在柠檬酸发酵残糖成分分析的基础上,研究了普鲁兰酶降解发酵残糖的最适条件和降解效果。研究结果表明,普鲁兰酶作用的最适条件为:t=28min,T=58℃,pH 4.8,酶用量0.4mL;在最适条件下,还原糖含量可提高30.7%.     

固定化猴头菌细胞的研究

报道了利用海藻酸钠固定化猴头菌细胞的发酵情况．就包埋剂的最佳浓度、固定化细胞的发酵条件以及固定化猴头菌细胞在深层发酵中应用的可行性进行了探讨．结果表明：最佳海藻酸钠的浓度为２％，氯化钙浓度为２％，固定化猴头菌细胞在发酵培养基内的代谢与游离细胞的代谢基本一致，发酵液中氨基酸含量最高可达８００ｍｇ／Ｌ，多糖含量最高可达１４００ｍｇ／Ｌ，固定化细胞可以连续使用３２～４８ｄ，因此固定化猴头菌细胞在工业生产中是可行的