基于Chelex-100和蛋白酶K的蚊虫足样本DNA提取技术

【目的】探索出一种蚊虫附肢(如单只足)微量DNA的提取方法,用于蚊虫分子鉴定和基因型研究。【方法】采用Chelex-100溶液和蛋白酶K结合的方法用于单只蚊虫足的微量DNA的提取。基于该方法,将不同方法保存的不同蚊种的足作为实验材料,从中提取蚊虫基因组DNA;以之为模板,扩增核糖体DNA的D2,D3,ITS2区以及线粒体COI和COII基因,并对PCR扩增产物进行测序。【结果】提取到了高质量的基因组DNA,PCR扩增获得了高质量的DNA扩增片段,进一步测序获得了高质量的序列。【结论】该方法价格便宜,操作简单方便,减少了对蚊虫样本的依赖。单只足用于DNA提取不影响对剩下的部分开展形态学等研究,可以作为蚊虫分子生物学研究中微量DNA样本提取的重要方法,也为其他昆虫微量DNA的提取提供理论依据。     

基于Chelex-100和蛋白酶K的蚊虫足样本DNA提取技术

【目的】探索出一种蚊虫附肢(如单只足)微量DNA的提取方法,用于蚊虫分子鉴定和基因型研究。【方法】采用Chelex-100溶液和蛋白酶 K 结合的方法用于单只蚊虫足的微量 DNA 的提取。基于该方法,将不同方法保存的不同蚊种的足作为实验材料,从中提取蚊虫基因组 DNA ;以之为模板,扩增核糖体 DNA 的 D2 , D3 , ITS2 区以及线粒体 COI 和COII 基因,并对 PCR 扩增产物进行测序。【结果】提取到了高质量的基因组DNA,PCR扩增获得了高质量的 DNA 扩增片段,进一步测序获得了高质量的序列。【结论】该方法价格便宜,操作简单方便,减少了对蚊虫样本的依赖。单只足用于DNA 提取不影响对剩下的部分开展形态学等研究,可以作为蚊虫分子生物学研究中微量 DNA 样本提取的重要方法,也为其他昆虫微量 DNA 的提取提供理论依据。
     

聚合酶链反应法扩增免疫球蛋白变区基因

用异硫氰酸胍抽提抗人小细胞肺癌单克隆抗体杂交瘤细胞株2F7的总RNA,用逆转录酶合成第一链cDNA,用PCR技术扩增出351 bp的重链变区基因(V_H)和324bp轻链变区基因(V_L),分别克隆至pUCV_(NP)-PCR和pWR13载体上,经筛选和DNA序列分析研究,证实已获得了该单克隆抗体的变区基因.     

唐松草及近缘植物ITS序列和5S rRNA基因间隔区序列的分析

通过对毛茛科的唐松草(Thalicrum L.)及其近缘植物黄连、毛莨和芍药科的牡丹等植物的ITS序列和5SrRNA基因间隔区的克隆、扩增及构建系统发育树的分析研究,结果显示,唐松草扩增后ITS序列长607 bp,5SrRNA基因基因间隔区序列长323 bp;系统树证明唐松草属与黄连属和毛茛属的亲缘关系较近,结合形态学与化学等其它学科证据,本研究结论支持唐松草和黄连在进化上更接近,为含木兰花碱生物碱及毛茛甙植物的鉴别以及毛茛科相关植物的亲缘关系初步提供了分子依据.     

翘嘴鳜线粒体基因组全序列的克隆与特征分析

通过直接测序的方法获得翘嘴鳜线粒体DNA基因组全序列(GenBank:JF972568).翘嘴鳜线粒体基因组全长为16 496 bp,其包含13个编码蛋白基因、22个tRNA基因、2个rRNA基因和1个Control region区域.整个翘嘴鳜线粒体DNA利用率非常高,仅仅只有32 bp的基因间隔和35 bp的基因重...     

库尔勒香梨自交不亲和SFBB-γ基因F-box区和可变区V3 RNAi表达载体的构建及遗传转化

目的为在分子水平应用RNAi(RNA interference)技术调控梨自交不亲和性状,培育自交亲和梨品种。方法基于本实验室获得的库尔勒香梨(Pyrus bretschneideri Rehd)自交不亲和品种花粉决定子SFBB-γ基因c DNA全长序列,选取SFBB-γ基因F-box区和可变区V3分别设计141 bp和120 bp的片段作为干扰序列,以棉花基因组DNA 242 bp的序列作为间隔片段,利用融合PCR (Fusion PCR)构建SFBB-γ基因发卡结构(intron-containing hairpin RNA,ihpRNA),酶切后与pCAMBIA1304植物表达载体相连,构建SFBB-γ基因RNAi表达载体并转化至农杆菌GV3101中。利用叶盘转化法转化到库尔勒香梨无菌叶片中,用GUS组织化学染色法鉴定侵染叶片。测序结果表明干扰F-box区获得的ihpRNA臂长为141 bp,茎环253 bp;干扰可变区V3获得的ihpRNA臂长为120 bp,茎环253 bp。结果说明SFBB-γ基因F-box区和V3区的ihpRNA结构融合成功。通过双酶切检验及PCR证实,SFBB-γ基因F-box区和V3区的RNAi表达载体p CAMBIA1304-RNAi-SFBB构建成功; PCR验证和测序结果也表明重组质粒已经成功转入农杆菌GV3101中,GUS染色检验获得蓝色,目的基因已整合进入库尔勒香梨叶片中。结论成功构建库尔勒香梨SFBB-γ基因F-box区及可变区V3的RNAi表达载体,为诱导香梨SFBB-γ基因转录后基因沉默及培育自交亲和梨品种提供参考。     

基于rDNA ITS序列的何首乌PCR-RFLP分子鉴别

为建立何首乌(Fallopia multiflora)DNA分子鉴别技术,对何首乌及其常见混淆品的rDNA ITS（核糖体DNA内转录间隔区）序列进行了扩增和测序,运用CLUSTAL X、MEGA软件对该区进行序列分析.结果表明：何首乌与毛脉蓼（F. multiflora var.cilliinervis）、翼蓼（Pteroxygonum giraldii）及耳叶牛皮消（Cynanchum auriculatum）在ITS1区的差异率分别为6.9%、18.1%、42.0%,在ITS2 区的差异率分别为10.0%、19.4%、43.9%,而何首乌种内各居群间ITS1 和ITS2 区的差异分别为0%～2.13% 和0%～1.03%．进一步利用premer premier 5 找出了一个位于ITS2间区的何首乌特征性NsbI酶切位点,将何首乌rDNA ITS 序列PCR扩增产物用NsbI酶切后可得到得一个含约531 bp和109bp的二片段PCR－RFLP图谱, 而其混淆品rDNA ITS 序列PCR扩增产物不能被NsbI酶切,图谱呈单一条带.建立的PCR－RFLP方法简单易行,可用于何首乌原植物的鉴别．     

赤狐ESR1基因启动子的克隆及生物信息学分析

对赤狐ESR1基因启动子区转录因子结合位点进行了预测,为今后研究其转录调控机制提供参考依据。以赤狐基因组DNA为模板,通过PCR技术扩增克隆ESR1基因启动子序列,并构建至双荧光素酶报告基因载体;利用生物信息学方法对ESR1基因核心启动子区的关键转录因子结合位点进行预测。成功克隆出赤狐ESR1基因5’上游1 880 bp的片段。通过在线软件分析预测发现,2个候选核心启动子位于转录起始位点上游634～842 bp;多种在线软件预测到赤狐ESR1基因启动子区存在Sp1,cEBP及NF-1等多个转录因子结合位点。推测这些转录因子可能对赤狐ESR1基因转录活性具有重要的调控作用。     

产氢菌的16S -23S rDNA间隔区的长度变异性分析

生物制氢细菌Rennanqilyf3的16S rRNA gene(rDNA)-23S rDNA间隔区碱基序列被测定，利用PCR扩增间隔区DNA，间隔区碱基序列存在长度多态现象．用这一长度多态现象进行产氢发酵细菌的辨认和识别，产氢发酵细菌Rennanqilyf3的16S rRNA gene(rDNA)-23S rDNA间隔区的PCR产品从1270到398bp，共有5个序列，碱基数目分别为1270、398、638、437和436bp。     

滇藏地区8种鹅膏菌的ITS序列分析

 对滇藏地区8种鹅膏菌的核糖体DNA(rDNA)内转录间隔区(ITS)进行PCR扩增和测序,用ClustalX(version 1.81)软件对所测的ITS序列进行比对分析.结果表明,除5.8S rDNA(其长度为160 bp)比较保守外,8个不同种的ITS序列在长度和碱基位点上都存在较大差异,其中ITS1区间的片段长度为206～297 bp,ITS2区间的片段长度为191～238 bp.这说明鹅膏属的种间具有较高的遗传多样性.利用MEGA(version 3.1)软件进行聚类,8个鹅膏菌在D=0.14处分成3组,与传统分类有出入.这为鹅膏菌的进一步分类及研究提供了分子依据.     

麂属动物小麂线粒体DNA文库的建立和序列分析

通过建立麂属动物小麂线粒体DNA文库，鸟枪法测序，我们获得了小麂线粒体基因组全序列的初步信息，这也是国内有关哺乳动物线粒体基因组全序列的首次报道，与其他哺乳动物线粒体基因组全库列的比较研究发现：全长为16354bp的小麂线粒体基因组同样编码13种蛋白、2种rRNA和22种tRNA，除了用于调控线粒体DNA复制和转录的D-Loop区以外，小麂线粒体基因组各基因长度，位置与其他哺乳动物相似，其编码蛋白质区域的rRNA基因与基因他哺乳动物具有很高的同源性，D－Loop区长度和序列的差异是导致各种哺乳动物线粒体差异的主要原因。     

HER-2基因特异性核酶设计与体外转录载体构建

目的 构建人表皮生长因子受体-2(HER-2)特异性核酶(ribozyme,RZ)及其底物基因的体外转录载体.方法 设计合成RZ基因,将该RZ克隆到真核表达载体pcDNA3.1( )中,测序鉴定.应用Trizol试剂提取MDA-MB-453细胞总RNA,RT-PCR扩增靶基因HER-2 cDNA片段,同样插入载体pcDNA3.1( ),测序鉴定.结果 经DNA测序分别证实合成的RZ基因序列和通过RT-PCR扩增的HER-2 cDNA序列克隆入pcDNA3.1( )中.结论 构建HER-2特异性RZ真核表达载体及含有HER-2 cDNA的载体,有助于进一步研究RZ对靶基因切割作用及雌激素受体阴性乳腺癌细胞MDA-MB-453中HER-2信号转导通路.     

中华按蚊AsAce2基因的鉴定及生物信息学分析

【目的】对中华按蚊(Anopheles sinensis)基因组中的乙酰胆碱酯酶(Ace)基因进行鉴定和生物信息学分析。【方法】通过同源性搜索得到1条乙酰胆碱酯酶(Ace)基因序列,命名为AsAce2,分析了该基因的基因结构以及所编码蛋白的理化性质、亚细胞定位、二级结构、三级结构和系统发生关系。【结果】AsAce2基因全长为4 008bp,编码区序列长度为1 941bp,共编码647个氨基酸;AsAce2蛋白与其他蚊虫的Ace2蛋白具有较高的同源性,在系统发育关系上与冈比亚按蚊(Anopheles stephensi)的Ace2蛋白和不吉按蚊(Anopheles gambiae)的Ace2蛋白关系更近;AsAce2基因结构中含有3个1位和2个2位内含子;AsAce2蛋白分子式为C_(3222)H_(4925)N_(875)O_(947)S_(32),为亲水性蛋白,蛋白定位在细胞周质,在13~32位氨基酸为跨膜区,无疏水区和信号肽,二级结构主要以不规则卷曲为主。【结论】丰富了相关基础数据,为进一步研究该基因的功能奠定了基础。     

中华按蚊的分子鉴定标准

中华按蚊(Anopheles sinensis)是重要的传疟媒介之一,广泛分布于中国和东南亚,它的形态特征和赫坎按蚊种团(Anopheles hyrcanus Group)其他蚊种十分近似,建立中华按蚊的分子鉴定标准十分重要。本研究从实验室中华按蚊品系的一个个体测序了线粒体DNA COI和COII基因,以及核糖体DNA D2、D3和ITS2位点,测序片段长度分别为658、663、551、365、556 bp。这些序列和近缘蚊种对应序列分别用最大似然法构建系统发育树,结果表明中华按蚊的序列均聚合为同一支。将测序的中华按蚊COII序列和已知蚊种的对应序列比对发现其中的保守位点分别是第133位点C,321位点C,382位点C,435位点T,516位点A和651位点C,线粒体DNA COI和COII基因序列的碱基组成具有AT偏向性,分别占69.15%和74.96%。提交了5条序列到NCBI数据库,其中核糖体DNA D2位点序列是首次在中华按蚊中公开报道。     

阳春砂HMGR基因cDNA克隆及生物信息学分析

目的:克隆阳春砂3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGR)基因的编码区c DNA.方法:根据阳春砂叶片转录组得到的HMGR基因序列自主设计引物.用改良的CTAB法提取阳春砂叶片总RNA,反转录得到c DNA,以c DNA为模板通过PCR反应扩增阳春砂HMGR基因并克隆到p MD-18T载体,将获得的阳性克隆进行测序分析.运用生物信息学方法分析得到的c DNA序列.结果:成功扩增出全长1 716 bp的c DNA片段,将其成功克隆进入p MD-18T载体,测序后将序列提交至Gen Bank得到其编号KU572444.生物信息分析结果显示,该基因片段编码1个由571个氨基酸残基组成HMGR蛋白.HMGR二级结构主要由43.95%的α-螺旋和47.29%的β-转角组成,同时还含有8.76%的β-折叠.与其他植物该蛋白质序列同源性及进化树分析结果表明,阳春砂HMGR与小米(Setaria italic)的同源性最高,且阳春砂与单子叶植物聚为一类.结论:从阳春砂叶片中成功克隆HMGR基因并进行了生物信息学分析.     

日本囊对虾线粒体DNA COⅠ基因片段序列分析

以相应引物对日本囊对虾(Marsupenaeus japonicus)线粒体DNA细胞色素氧化酶Ⅰ亚基基因(mtDNA COⅠ)进行PCR扩增,经过基因重组、转化、克隆、筛选、DNA测序,得到709 bp的碱基片断.碱基组成A、C、G、T含量分别为196bp(27.64%)、129 bp(18.19%)、134 bp(18.90%)、250 bp(35.26%).与GenBank中斑节对虾(Penaeus monodon)的mtDNA CO I全序列(AF217843)比对.经分析发现本实验获得的日本囊对虾mtCO Ⅰ基因片段序列和GenBank上的同种序列(AY264897)都只是该种COⅠ基因序列的一部分,二者之间有41bp的重叠并可拼接.拼接后的总长为1515 bp.     

中华按蚊AsAce2基因的鉴定及生物信息学分析

【目的】对中华按蚊(Anopheles sinensis)基因组中的乙酰胆碱酯酶(Ace)基因进行鉴定和生物信息学分析。【方法】通过同源性搜索得到1条乙酰胆碱酯酶(Ace)基因序列,命名为AsAce2,分析了该基因的基因结构以及所编码蛋白的理化性质、亚细胞定位、二级结构、三级结构和系统发生关系。【结果】AsAce2基因全长为4008bp,编码区序列长度为1941bp,共编码647个氨基酸;AsAce2蛋白与其他蚊虫的Ace2蛋白具有较高的同源性,在系统发育关系上与冈比亚按蚊(A-nophelesstephensi)的Ace2蛋白和不吉按蚊(Anopheles gambiae)的Ace2蛋白关系更近;AsAce2基因结构中含有3个1位和2个2位内含子;AsAce2蛋白分子式为C3222H4925N875O947S32,为亲水性蛋白,蛋白定位在细胞周质,在13~32位氨基酸为跨膜区,无疏水区和信号肽,二级结构主要以不规则卷曲为主。【结论】丰富了相关基础数据,为进一步研究该基因的功能奠定了基础。
     

家蚕浓核病毒BmDNV-1(伊那株)结构蛋白基因VP4的克隆、表达及抗体制备

为研发新的日本血吸虫(Schistosoma japonicum)疫苗候选抗原基因,为血吸虫诊断和疫苗研制提供依据,提取和纯化S.japonicum成虫DNA,PCR扩增相关基因,然后将其克隆入pBST载体,对菌落PCR阳性克隆子测序和分析.菌落PCR获得一条与PCR产物一致的DNA片段,PCR产物与S.japonicum 22 600抗原分子DNA序列具有高度同源性,636 bp大小,oRF189 bp,ORF小是全长的蒯读框,只获得部分编码区,能编码63个氨基酸,表达产物含有一个包含9个氨基酸残基的潜在螺旋跨膜片段(25～33位)和一个酪氨酸激酶磷酸化位点(38～39位).本研究所获取的阳性克隆是与S.japonicum 22 600抗原编码基因有高度同源性的基因.通过Blastn和BLASTP分析,预测该基因为体膜相关蛋白基因,可编码血吸虫体壁相关蛋白,可能是信号传递分子.     

中华按蚊的分子鉴定标准

中华按蚊(Anopheles sinensis)是重要的传疟媒介之一,广泛分布于中国和东南亚,它的形态特征和赫坎按蚊种团(Ano pheles hyrcanus Group)其他蚊种十分近似,建立中华按蚊的分子鉴定标准十分重要。本研究从实验室中华按蚊品系的一个个体测序了线粒体DNA COI和COII 基因,以及核糖体DNA D2、D3和ITS2位点,测序片段长度分别为658、663、551、365、556bp。这些序列和近缘蚊种对应序列分别用最大似然法构建系统发育树,结果表明中华按蚊的序列均聚合为同一支。将测序的中华按蚊COII序列和已知蚊种的对应序列比对发现其中的保守位点分别是第133位点C,321位点C,382位点C,435位点T,516位点A和651位点C,线粒体DNA COI和COII 基因序列的碱基组成具有AT偏向性,分别占69.15%和74.96%。提交了5条序列到NCBI数据库,其中核糖体DNA D2位点序列是首次在中华按蚊中公开报道。
     

水稻硝酸还原酶基因5′上游序列的克隆与序列分析

以日本晴水稻幼苗叶的基因组总DNA为模板,采用PCR方法扩增获得约1 300 bp大小的DNA片段,回收该片段并与pMD18-T载体连接,转化大肠杆菌感受态,并提取质粒DNA.用凝胶电泳检测和酶切鉴定,选取阳性克隆进行测序分析.测序结果显示,该片段含1 376个核苷酸对;应用NCBI网站的BLAST软件对本试验中克隆的序列与GenBank(NC_008401)公布的水稻硝酸还原酶基因启动子序列进行比对,有3个核苷酸差异,同源性为99%,证实本试验中克隆的DNA序列为水稻硝酸诱导基因启动子.该序列含有多个与转录调控有关的保守序列(如TATA-box、CAAT-box和GAGA-box).此序列的成功克隆,为今后开展水稻等重要农作物转基因研究奠定基础.