口蹄疫抗原决定簇融合基因转化胡萝卜的研究

利用转基因植物生产疫苗是目前植物基因工程的一个研究热点,具有生产简单、成本较低、使用安全方便、易贮存等优点.本实验通过农杆菌介导的遗传转化,以O型和A型口蹄疫抗原决定簇基因O21-O14-A21转化胡萝卜.通过筛选,获得潮霉素抗性愈伤组织,经胚状体再生得到156棵抗性苗.通过GUS染色检测,GUS报告基因在部分转化的愈伤组织中瞬时表达,并在部分抗性苗中稳定表达.对部分抗性植株进行PCR和PCR-Southern杂交检测,证实目的基因已经成功整合到胡萝卜基因组中.     

水稻磷转运蛋白基因OsPht1;6启动子表达载体转化系统的建立

通过PCR从粳稻（Oryza sativa L.cv.ssp.Japonica）的总DNA中扩增出一个磷转运蛋白基因（Phosphates transporter1；6；OsPht1；6，accession no AF536966）的启动子序列.以此为基础与二元表达载体PS1aG-3构建含Pht1；6启动子的植物表达载体，并通过根癌农杆菌介导转化了水稻武运粳7号品种.同时，对其愈伤组织高效再生体系和影响报告基因GUS瞬时表达的各种因素也做了比较研究.结果表明：①诱导水稻武运粳7号品种愈伤形成，3 mg/L 2，4-D的生长素浓度最适宜；②GUS基因高瞬时表达频率的条件为：工程菌液的浓度OD600值为0.7-0.8，浸染时间30 min，共培养时间3 d.利用这些再生转化条件，以EHA105为菌株转化浸染愈伤组织，获得了较高频率的Pht1；6启动子驱动的GUS基因瞬时表达.这些方法都有效地提高了抗性愈伤组织的形成率，该实验获得了转基因植株，经PCR检测，证实已将目的基因整合到水稻的基因组中.     

农杆菌介导的DREB1A基因转化多花黑麦草及其转化体系的优化

采用携带卡那霉素抗性基因nptII和GUS基因的ubiquitin启动子驱动的表达载体pBI121／DREB1A的根癌农杆菌AGL1, 对多花黑麦草幼胚来源的胚性愈伤组织进行了遗传转化,并优化了各种影响因素。胚性愈伤组织经根癌农杆菌感染和共培养后,用50mg／L巴龙霉素筛选抗性愈伤组织,待抗性愈伤组织在IB分化培养基上分化成苗后用25mg／L卡那霉素进一步筛选再生植株, 获得了部分抗性植株。抗性植株的总DNA用DREB1A基因的特异引物进行PCR检测,转化频率为2.14％,PCR-Southern blot进一步验证了转化植株基因组中含有该外源基因。各种影响转化效率因素的优化实验表明,当转化时菌液浓度的OD600为2.0、侵染时间为1h、共培养时间为2d、共培养温度为21℃及在共培养期间使用乙酰丁香酮等,均可明显提高转化频率。     

根癌农杆菌介导的绿色荧光蛋白基因在水稻植株中的表达

将改良的绿色荧光蛋白（EGFP）基因插入到植物表达载体中,构建了ubi启动子驱动下的植物表达载体p13UEGFP．通过根癌农杆菌介导转化水稻的胚性愈伤组织,经潮霉素筛选,获得抗性愈伤组织和再生植株．对T2代植株进行PCR分析、激光共聚焦显微镜检测和RT—PCR分析,结果表明,绿色荧光蛋白基因已经在转基因植株中稳定表达．     

苜蓿愈伤组织诱导及GUS基因瞬时表达

用电击转化法将质粒pBI121(含GUS基因,β-葡萄糖苷酸酶基因）导入苜蓿愈伤组织的小细胞团内,利用组织化学定位实验检测到GUS基因在受体组织中的瞬时表达。     

原球茎为转化受体的农杆菌介导石斛遗传转化

以携带双元载体pCAMBIA1305.1的农杆菌菌株EHA105转化石斛种子萌发形成的原球茎,通过GUS瞬时表达检测对受体状态、农杆菌活化条件、共培养时间等转化影响因子进行了优化;共培养4 d的原球茎接种到含有30 mg/L潮霉素(Hyg)和500 mg/L头孢噻肟钠的愈伤组织诱导与增殖培养基上以获得潮霉素抗性的愈伤组织,抗性愈伤组织在含Hyg 50 mg/L的再生培养基上再生植株,抗性株经GUS组织化学、PCR和PCR-southem blot检测证明为转化株。     

转抗虫融合基因(cry1Ac3-cpti)玉米(Zea mays L.)植株的获得及其抗虫性分析

将苏云金杆菌家族中的cry1Ac3基因与豇豆胰蛋白酶抑制剂基因（cpti)融合成融合基因，构建cry1Ac3-cpti融合基因植物表达载体，表达Bt-CpTI抗虫融合蛋白。用基因枪转化技术将cry1Ac3-cpti融合基因分别导入玉米优良自交系E28及340的胚性愈伤组织中，轰击后的愈伤组织经筛选剂3次筛选，获得可育的再生植株。经PCR及Southern blot分子检测，证实所获得的再生植株为转基因植株。抗虫性分析结果表明，部分转基因玉米植株对玉米螟衣较强的抗性。     

转抗虫融合基因(cry1Ac3-cpti)玉米(Zeamays L.)植株的获得及其抗虫性分析

将苏云金杆菌家族中的cry1Ac3基因与豇豆胰蛋白酶抑制剂基因(cpti)融合成融合基因，构建cry1Ac3-cpti融合基因植物表达载体，表达Bt-CpTI抗虫融合蛋白．用基因枪转化技术将cry1Ac3-cpti融合基因分别导入玉米优良自交系E28及340的胚性愈伤组织中，轰击后的愈伤组织经筛选剂3次筛选，获得可育的再生植株．经PCR及Southernblot分子检测，证实所获得的再生植株为转基因植株．抗虫性分析结果表明，部分转基因玉米植株对玉米螟虫有较强的抗性．将苏云金杆菌家族中的cry1Ac3基因与豇豆胰蛋白酶抑制剂基因(cpti)融合成融合基因，构建cry1Ac3-cpti融合基因植物表达载体，表达Bt-CpTI抗虫融合蛋白．用基因枪转化技术将cry1Ac3-cpti融合基因分别导入玉米优良自交系E28及340的胚性愈伤组织中，轰击后的愈伤组织经筛选剂3次筛选，获得可育的再生植株．经PCR及Southernblot分子检测，证实所获得的再生植株为转基因植株．抗虫性分析结果表明，部分转基因玉米植株对玉米螟虫有较强的抗性．     

利用电击法转化玉米胚性愈伤组织获得GUS基因瞬时表达的研究

作者以成单玉米幼胚经诱导、继代、筛选,获得了可分化的胚性愈伤组织,采用电击转化法,将质粒PBI121导入成单玉米的胚性愈伤组织中,通过组织化学染色法,观察到了GUS基因的瞬时表达,并筛选出对愈伤组织损害轻、GUS表达较强的最适电击条件为：960μF,375V/cm,61ms。     

用Ti质粒子的双元载体法将抗性基因转入西红柿体细胞

采用Ｔｉ质粒的双元载体法对西红柿的叶片外植体进行遗传转化，经选择培养基的筛选，从抗性愈伤组织细胞中诱导出具有卡那霉素抗性的幼苗，分子杂交证实，卡那霉素抗基因通过根瘤农杆菌的介导，整合到细胞核基因组中，转化子具有较高的新霉素磷移酶活性，说明抗性基因在受体细胞得到表达。     

用Ti质粒的双元载体法将抗性基因转入西红柿体细胞

采用Ｔｉ质粒的双元载体法对西红柿（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）的叶片外植体进行遗传转化，经选择培养基的筛选，从抗性愈伤组织细胞中诱导出具有卡那霉素抗性的幼苗．分子杂交证实，卡那霉素抗性基因通过根瘤农杆菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）的介导，整合到细胞核基因组中，转化子具有较高的新霉素磷酸转移酶活性，说明抗性基因在受体细胞得到表达．     

人参SQS基因的干扰载体构建及转化人参愈伤组织

以5年生人参为材料, 根据人参SQS基因设计正义及反义片段引物, 构建了SQS基因干扰表达载体; 利用农杆菌转化法转化人参愈伤组织, 对获得的抗性愈伤组织进行PCR检测及实时定量PCR检测, 并对抗性愈伤组织的皂苷进行HPLC分析. 实验结果表明, 与非转化人参愈伤组织相比, 转化后的愈伤组织SQS基因表达量降低, 皂苷含量有所变化. SQS是人参皂苷生物合成途径的关键酶, 抑制SQS基因的表达, 可调控人参皂苷含量变化.     

水仙胚性愈伤的获得及农杆菌介导GUS基因的遗传转化

用正交实验设计对前期影响水仙胚性愈伤诱导和分化关联性大的因素进行综合分析,结果显示,培养基类型、激素及处理方式、不同添加物等对水仙外植体胚性愈伤诱导及分化的影响是基于培养基的多因素协同效应。水仙适宜胚性愈伤诱导培养基是:改良MB+NAA(0.2 mg/L)+6BA(2 mg/L)+ABA (2 mg/L)+AgNO3(5 mg/L);适宜的分化培养基是：改良N6+2,4D(0.5 mg/L)+6BA(2.5 mg/L)+NAA(0.2 mg/L)+ABA(2 mg/L)。实验中观察到水仙体细胞胚的发生,在胚性愈伤诱导和分化体系优化基础上实现农杆菌介导GUS基因转化,稳定表达抗性愈伤GUS染色显示最佳胚性愈伤诱导培养基能促进水仙外植体感受态的形成,有利于外源基因的接受,PCR检测表明实验中获得3株转GUS基因阳性植株。     

CMV启动子克隆及其在植物体内的表达

根据细胞肥大病毒CMV启动子基因序列设计引物,PCR扩增目的基因后,利用基因重组技术成功构建具有Kan抗性和GUS intron报告基因的植物表达载体LpPCG,并将重组质粒转化到烟草叶片中.通过CMV启动子指导的GUS intron基因在烟草叶片内的瞬时性表达,比较了其植物表达特性.结果表明:CMV启动子可启动GUS在植物体内的表达,其表达活性相当于2×35S启动子的(80.4±26.6)％.     

麻疯树毒蛋白(curcin)基因转化水稻的研究

以粳稻(Japonica)品种日本晴与中花11号为材料,对影响农杆菌介导水稻转化体系的几个因素进行了研究,建立了农杆菌介导的有效水稻转化体系.在该体系中,首次使用浓度为10-4g/mL嘌呤合成抑制剂acivicin在转化前对水稻愈伤组织进行预处理,结果表明此法可有效提高GUS基因的瞬时表达率.同时,利用插入了麻疯树毒蛋白(curcin)基因的植物表达质粒pBI121-curcin,通过农杆菌介导转化水稻,获得了多株转基因植株.通过PCR鉴定,证实curcin基因已整合到水稻基因组中.     

表达长喙田菁SrPCS4烟草的获得及Cd抗性研究

植物螯合肽(phytochelatins,PCs)在植物解除重金属的毒性方面具有重要作用,是以谷胱甘肽为底物,在植物螯肽合成酶(phytochelatin synthase,PCS)催化下合成的.作者已经克隆得到的长喙田菁(Sesba-nia rostrata)植物螯合肽合成酶SrPCS4 cDNA长为1035 bp,其ORF编码177个氨基酸,以pHANNIBAL及pART27为基础,构建了CaMV35S启动子驱动的SrPCS4基因植物表达载体pAM25,采用电击转化方法将pAM25导入根癌农杆菌EHA105,并通过改良叶盘转化方法用该菌株对烟草进行了转化,对转基因烟草进行了PCR与northern-blot检测,研究结果表明得到了表达该基因的烟草,但表达该基因的烟草不能够提高对Cd的抗性.     

OsCHX1基因克隆及转基因植株获得

利用RT-PCR扩增水稻的Na 、K 、/H 反向转运蛋白(OsCHXl)基因全序列,将其与35S启动子连接后,插入到pl301中,构建植物过量表达载体pl301-35S-OsCHXl-NOS.将该质粒转化农杆菌EHA105,并对水稻愈伤组织进行转化,获得了再生植株.对再生植株进行GUS和PCR鉴定,发现超过85%的再生植株为阳性植株.此研究结果为进一步探讨OsCHX1基因功能提供了实验材料.     

口蹄疫抗原决定簇融合基因转化水稻的研究

将口蹄疫O型抗原决定簇和A型抗原决定簇构成的融合基因O21-O18-A21经农杆菌介导转入粳稻品种日本晴中．经潮霉素筛选．获得再生植株207株．提取它们的总DNA进行PCR检测．其中193株扩增出和阳性对照相同的900bp和450bp两条带．转基因阳性率达93．2％．抽取部分阳性植株进行PCR—Southern杂交检测及报告基因GUS检测．同样证明融合基因已经整合到日本晴基因组中．     

农杆菌介导东方百合“西伯利亚”遗传转化体系建立

以东方百合"西伯利亚"(Lilium seberia)为材料,建立了百合再生和农杆菌介导的遗传转化体系.采用LBA4404和GV3101菌株对鳞片来源的愈伤组织进行侵染,并以鳞片作为对比转化材料,两种菌株携带有相同的双元载体pCAMBIA1301.研究结果表明,农杆菌侵染愈伤组织外植体转化率较高;乙酰丁香酮(AS)的添加能大大提高根癌农杆菌转化百合的效率.另外,共培养时间、不同菌株均对转化效率有一定的影响.筛选后获得的抗性植株经PCR检测和GUS组织化学染色证实外源基因已经整合到基因组DNA中并获得表达,转化率为5%～8%.     

一个NBS-LRR蛋白质基因转化水稻及其超量表达

水稻Osxoc1334是一个编码NBS-LRR类蛋白质的基因,通过构建该基因的超量表达载体,并在农杆菌EHA105介导下转化中花11号水稻,最终获得6株再生水稻植株.对抗性愈伤组织和再生植株用GUS组织化学染色检测,结果抗性愈伤组织和6株再生水稻植株均可染上蓝色,而野生型植株不变色,用潮霉素磷酸转移酶基因的特异引物进行PCR鉴定,再生植株均可扩增到目标条带而野生型植株则不能,表明Osxoc1334基因已随T-DNA整合到再生水稻植株基因组中.采用半定量和荧光定量PCR分析转基因水稻的Osxoc1334基因表达,结果其中3株转基因植株的Osxoc1334基因平均相对表达量明显增强,其中1株为野生型植株的23.5倍.这为进一步鉴定该基因功能奠定了基础.