烟草叶肉原生质体再生壁形成中的呼吸途径Ⅱ.TCA途径

壁的再生是原生质体生命活动中最重要的行为之一。这种行为是建立在代谢基础上的。前文我们已报道了再生壁形成中,EMP(糖酵解)和HMP(戊糖支路)呼吸途径起了重要作用,但对于TCA(三羧酸循环)途径尚未研究。本文系报道应用TCA呼吸途径的抑制剂丙二酸钠对烟草叶肉原生质体再生壁形成中的作用进行的研究结果。材料与方法选择烟草(Nicotiana tabacum)叶片为材料,按前法分离叶肉原生质体。原生质体的培养按前法进行。丙二酸钠附加于NT培养基中,经高压灭菌后接种。检查原生质体细胞壁的再生,用荧光增白剂VBL染色荧光法。细胞面积的计算按前法。     

金针菇原生质体制备和再生条件实验

本文采用溶壁酶(Lyuvllzyme)、蜗牛酶(Snailase)、纤维素酶(Cellulase)制备金针菇(Flammulina Velutipes)的原生质体.比较了酶的浓度、渗透压稳定剂、温度、酶解时间、菌龄等因素对原生质体形成和再生的作用.1％蜗牛酶和1.5％溶壁酶酶解金针菇菌丝获得了高产量的原生质体.无机盐(kcl,Nacl,Mgso_4)和甘露醇是制备金针菇原生质体的有效稳定剂.35℃、酶解1小时、菌龄3～4天的菌丝是制备金针菇原生质体的最佳条件.不同的再生菌丝生长速度和子实体形成的时间有很大的差异.     

地衣芽孢杆菌JF—20菌原生质体的形成及其再生的最佳条件

以地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis)JF-20菌为出发菌株,对原生质体制备及再生的各种影响因素进行了研究,在原生质体形成及再生的最佳条件下制备原生质体。结果发现：JF-20菌的原生质体形成率及再生率分别达到以86.9%和38.4%,并通过光学显微镜技术,观察了原生质体形成及再生的有关现象。     

裙带菜原生质体的分离和培养

本文以裙带菜(Undaria pinnatifida(Harv)Suringat)为材料，进行原生质体分离和培养研究。取得以下结果：1、使用海螺酶(sca snail enzymes)和纤维素酶(cellulase，Onozuka R-10)，酶解裙带菜细胞壁，在一定的条件下，能够大量地分离成活的裙带菜原生质体。2、实验表明，氯化钠可作为分离裙带菜原生质体研究中的一种理想的渗透剂。3、荧光增白剂染色镜检法可作为鉴定裙带菜原生质体的一种辅助方法，并适用于原生质体再生壁的观察。4，光照(2000-2500Lux)能促使原生质体再生细胞壁，含有蔗糖(W／V，1％)的培养液有助于原生质体再生细胞壁。5、分离的裙带菜原生质体，经培养，已能长成幼体。     

斜卧青霉Penicillium decumbens原生质体的形成和再生因素的研究

用脱壁酶(含0.04％的蜗牛酶和0.5％的纤维素酶)以0.6M的(NH_4)_2SO_4作稳定剂,于pH6.5,35℃直接酶解不经任何预处理的培养22～25小时和33～36小时的斜卧青霉JN15、Jul的菌丝体,得到大量具再生能力的原生质体。用不同浓度的脱壁酶处理指数生长期的菌丝体,在本试验范围内,原生质体的形成量随酶浓度的增高而增加,其再生频率随酶浓度的升高而下降;对两者的关系进行了讨论,并给出了获得大量具再生活性的原生质体的脱壁酶的浓度范围。同时,研究了温度,pH、渗透压稳定剂的浓度对原生质体形成和再生的作用;在相差显微镜下,详细观察了原生质体的释放过程、形态变化以及原生质体再生成正常茵丝的全过程。     

蒙古口蘑原生质体的制备与再生研究

影响蒙古口蘑原生质体形成和再生的因素很多,重点探讨了酶浓度、酶解时间、菌龄、渗透压稳定剂和再生培养基对原生质体形成和再生的影响.结果表明,蒙古口蘑原生质体制备和再生的最佳条件是:菌龄为5 d,2.5% 溶壁酶处理4 h,酶解温度25℃,0.6 mol·L-1KCl为渗透压稳定剂,MB为再生培养基,再生率为8.4×10-4左右.     

烟草叶肉原生质体再生壁形成的电镜研究

电镜观察表明,新分离的烟草叶肉原生质体表面光滑,在质膜外没有纤维状物质,内质网和高尔基体几乎没有发育:培养1天后,线粒体明显增加,粗面内质网和高尔基体沿质膜发育,质膜变得粗糙;2天后,质膜发生折皱,高尔基囊泡向质膜外分泌它的内含物;6天后,质膜表面出现明显松散分布的再生壁。在培养基中附加200 ppm香豆素处理,在培养1天后,质膜仍然光滑,未出现内质网和高尔基体;2天后,质膜开始变粗糙,内质网开始发育。试验表明,质膜、内质网、高尔基体在原生质体再生壁形成中起重要作用,并讨论了它们的可能作用。香豆素可能是在一定时同内,通过抑制质膜的活动和内质网、高尔基体的发育而抑制壁的再生。     

异常汉逊酵母原生质体形成和再生研究

采用多因子正交实验确定了一株异常汉逊酵母(Hansenula anomala)原生质体形成和再生的最佳条件。对数前期细胞在1％蜗牛酶、0.1％巯基乙醇(ME)。0.1％EOTA,0.9mol.l~(-1)甘露醇和pH5.4,35℃条件下处理30分钟,原生质体形成率和再生事分别为91.4％和9.31％,原生质体形成率×再生率值最大(8.51％)。     

卵清溶菌酶激活剂的研究——Ⅲ、激活剂溶菌酶的微生物细胞脱壁效应

细胞融合是新近发展起来的生物工程技术之一,而细胞融合的主要关键步骤之一是酶法脱壁制备原生质体。早在1958年Romano等报导链霉菌属中一些种的细胞壁可以被溶菌酶溶解,Douglas首先用溶菌酶从链霉菌菌丝制备出原生质体,并用对噬菌体吸咐及血清学试验证明细胞壁确实溶解。随后Okarishi等研究了链霉菌原生质体形成和再生成细胞形态的条件。但由于不同的微生物之间的细胞壁的结构和组成有所不同,以致使它们对溶菌酶的敏感性也呈现出很大的差异,从而使溶菌酶在细胞融合中的脱壁作用受到一定的影响。前面两文已证明,激活剂LIA能     

槐耳原生质体制备与再生研究

对槐耳原生质体制备与再生进行了研究,结果表明:槐耳原生质体制备最佳条件是以液体静置培养9d的菌丝体,0.6mol/L蔗糖作为渗透压稳定剂,在体积质量比2%溶壁酶、1%纤维素酶和1%蜗牛酶作用下,25℃酶解3h,制备率达2.75×106个/mL;再生最佳条件是液体静置培养12d的菌丝体,0.6mol/L甘露醇为渗透压稳定剂,在2%溶壁酶作用下,35℃酶解2h,再生率为12.7%.     

黑曲霉(Aspergillus niger)原生质体电融会(Ⅰ)─黑曲霉原生质体形成与再生的研究

通过紫外诱变获得两株稳定的黑曲霉营养缺陷型Ｍｕ２（Ｍｅｔ－）和Ｄ１２（Ｃｙｓ－），并首次证实低温黑暗保存数小时对黑曲霉突变株具有稳定作用。系统地研究了菌龄、渗透压稳定剂、温度、酶的浓度和酶解系统等因素对黑曲霉原生质体形成的影响．采用２％溶壁酶加０．５％纤维素酶，获得了大量的原生质体。在显微镜下观察原生质体形成和再生过程， Ｍｕ２和 Ｄ１２再生率分别为 ５４％和 ３３％。原生质体在正弦交变电场（１ＭＨｚ，４５０ Ｖ／ｃｍ）作用下形成珠串，在高压电脉冲（强度 ９．０ ｋＶ／ｃｍ、时程 ２５ μｓ）触发下，发生融合。     

稗弯孢菌（Curvularis lunata）原生质体的制备

研究了不同菌龄、酶浓度、渗透压稳定剂、缓冲液pH值以及酶解温度和时间等因素对稗弯孢菌(Curvularia lunata)原生质体形成的影响。将培养18h的菌丝,以0.7mol/L KCl作为渗透压稳定剂,30℃下,经过2％溶壁酶和4％纤维素酶混合酶液(pH5.8)酶解4h,原生质体在静止条件下最大释放量达到 1.7×10~6/mL,再生率为0.76％。     

烟草叶肉原生质体再生壁形成的电镜研究

电镜观察表明,新分离的烟草叶肉原生质体表面光滑,在质膜外没有纤维状物质,内质网和高尔基体几乎没有发育:培养1天后,线粒体明显增加,粗面内质网和高尔基体沿质膜发育,质膜变得粗糙;2天后,质膜发生折皱,高尔基囊泡向质膜外分泌它的内含物;6天后,质膜表面出现明显松散分布的再生壁。在培养基中附加200 ppm 香豆素处理,在培养1天后,质膜仍然光滑,未出现内质网和高尔基体;2天后,质膜开始变粗糙,内质网开始发育。试验表明,质膜、内质网、高尔基体在原生质体再生壁形成中起重要作用,并讨论了它们的可能作用。香豆索可能是在一定时同内,通过抑制质膜的活动和内质网、高尔基体的发育而抑制壁的再生。     

林肯链霉菌原生质体形成、再生和融合的研究

林肯链霉菌生长在0.5%甘氨酸的S培养基中,能较好地被溶菌酶破壁形成原生质体。原生质体能在RB培养基上再生,但不能在R_2培养基上再生,这和已报道过的其他链霉菌不同。78-11菌株的再生频率约为25.7%,S-3菌株的再生频率约为20.5%。PEG(聚乙二醇)1000对诱导融合的效果较好,重组频率最高可达10~(-2)。重组子和亲本在培养特性、孢子形态方面无特殊差异,但经C_O~(60)诱变后重组子的正变率超过亲本。     

产辅酶Q10的类球红细菌原生质体制备和再生研究

 辅酶Q₁₀(CoQ₁₀)是人类细胞自身产生的内源性辅酶因子,是一类天然抗氧化剂,目前已广泛应用于医药、食品、化妆品等诸多领域.基因组改组技术的核心内容为原生质体融合,为了提高基因组改组的效率,提高辅酶Q₁₀的产量,本研究对产辅酶Q₁₀的类球红细菌原生质体制备及再生条件进行了优化,通过生长曲线、正交试验等确定了原生质体制备及再生的适宜条件：溶菌酶浓度1mg/mL、作用温度37℃、作用时间1h以及再生培养基蔗糖浓度10%.在此条件下,类球红细菌原生质体形成率可达到96.1%,再生率可达到28.8%.这为进一步对该菌的基因组改组研究奠定了基础.     

谷氨酸产生菌原生质体的制备和再生

6株谷氨酸产生菌以甘氨酸、青霉素和溶菌酶不同组合处理,对其原生质体形成进行了比较,在最佳条件下,原生质体形成率可达95～100％。B9-15 菌株细胞形态特殊,表面呈凹陷状,仅在含1.5～2.0％甘氨酸的高渗培养液中就能形成原生质体,在加有壁制剂的丁二酸钠高渗培养基上,所试菌株的原生质体再生率从10.5％～61.8％,差异性较大。     

不依赖特异性抗体激活补体经典途径的机理探讨

实验证实了Ｅ．ｃｏｌｉＢ和Ｅ．ｃｏｌｉｋ１２ ｇａｌ＾＋的细胞壁可直接激活补本，去壁扣的细菌球形体或原生质体加入补体后可裂解，说明在不依赖特异抗体激活补体经典途径中，补体的激活部位是细胞壁，作用靶子似乎是细胞膜。     

钝齿棒杆菌AS1.542原生质体形成和再生条件的研究

本文研究了钝齿棒状杆菌(Corynebacterium crenatum AS1.542)原生质体形成和再生的条件。结果表明:菌体培养至对数生长期,用1.Oμg/ml青霉素G处理4小时,再以1000μg/ml蛋清溶菌酶在37℃下处理14小时原生质体形成率达99.0％,在含0.5M蔗糖的高渗完全基上,它的再生率为20.0～50.0％。高渗缓冲液DF比NSM和SMM更适合于原生质体的再生,高渗稳定剂0.5mol/L蔗糖优于0.5mol/LNaCl。用电镜观察了菌体和原生质体的形态结构。     

钝齿棒杆菌AS1.542原生质体形成和再生条件的研究

本文研究了钝齿棒状杆菌(Corynebacterium crenatum AS1.542)原生质体形成和再生的条件。结果表明:菌体培养至对数生长期,用1.0 μg/ml青霉素G处理4小时,再以1000μg/ml蛋清溶菌酶在37℃下处理14小时原生质体形成率达99.0％,在含0.5M蔗糖的高渗完全基上,它的再生率为20.0～50.0％。高渗缓冲液DF比NSM和SMM更适合于原生质体的再生,高渗稳定剂0.5 mol/L蔗糖优于0.5 mol/L NaCl。用电镜观察了菌体和原生质体的形态结构。     

酵母菌原生质体形成戌再生多因子综合效应分析

研究了酶解时间、酶解温度、渗透压稳定剂和处理剂对酿酒酵母Ａ００１与克鲁维酵母Ｙ０３４原生质体形成时间与再生的综合效应，统计分析表明，在２％蜗牛酶，菌龄为数生长期时，影响原生质体形成的主要因素是酶解时间、酶解温度，且两者存在交互作用，影响原生质体再生的主要因素是渗透压稳定剂，确立了实验菌株原生质体形成与再生的最佳匹配条件。