金针菇原生质体制备和再生条件实验

本文采用溶壁酶(Lyuvllzyme)、蜗牛酶(Snailase)、纤维素酶(Cellulase)制备金针菇(Flammulina Velutipes)的原生质体.比较了酶的浓度、渗透压稳定剂、温度、酶解时间、菌龄等因素对原生质体形成和再生的作用.1％蜗牛酶和1.5％溶壁酶酶解金针菇菌丝获得了高产量的原生质体.无机盐(kcl,Nacl,Mgso_4)和甘露醇是制备金针菇原生质体的有效稳定剂.35℃、酶解1小时、菌龄3～4天的菌丝是制备金针菇原生质体的最佳条件.不同的再生菌丝生长速度和子实体形成的时间有很大的差异.     

木质素降解菌L1原生质体的形成和再生

从自然界筛选出一株降解木质素高的白腐真菌 L1,对其原生质体的形成和再生进行了研究。在 OS培养基中生长的菌丝体 ,原生质体数量较高。在液体培养条件下 ,于 OS培养基中培养 60 h的菌丝体 ,用 0 .3% β-巯基乙醇与酶液同时处理菌丝体 ,采用 p H5 .0的混合酶 (蜗牛酶∶纤维素酶∶溶菌酶的最佳浓度比为 5∶ 4∶ 1 ) ;在 30℃酶解 4h;用 0 .4mol/L NH4Cl,1 0 mmol/L Mg SO4作渗透压稳定剂时 ,原生质体数量达到 4.32× 1 0 5个 /mg。 OS双层再生培养基最适于原生质体再生     

稗弯孢菌（Curvularis lunata）原生质体的制备

研究了不同菌龄、酶浓度、渗透压稳定剂、缓冲液pH值以及酶解温度和时间等因素对稗弯孢菌(Curvularia lunata)原生质体形成的影响。将培养18h的菌丝,以0.7mol/L KCl作为渗透压稳定剂,30℃下,经过2％溶壁酶和4％纤维素酶混合酶液(pH5.8)酶解4h,原生质体在静止条件下最大释放量达到 1.7×10~6/mL,再生率为0.76％。     

新西兰青霉(Penicillium novae-zeelandiae)原生质体的制备与再生研究

利用酶对新西兰青霉菌的菌丝进行酶解获得原生质体,探究了影响原生质体制备和再生的因素,包括酶种类,酶浓度,菌丝培养时间,酶解时间和温度,pH,二硫苏糖醇(DTT)预处理等.结果显示最佳酶解条件为:菌丝体培养48h,用0.05mol·L~(-1) DTT预处理0.5h,以0.8mol·L~(-1)氯化钠作为稳定剂,31℃条件下经Lywallzyme(10mg·mL~(-1))酶解4h,原生质体数量达到4.75×107 g~(-1),再生率为18.0%.     

阿舒假囊酵母(Eremothecium ashbyii)原生质体制备与再生的研究

阿舒假囊酵母(Eremothecium ashbyii)在经0.4％巯基乙醇30℃预处理15分钟的菌丝体,其菌龄以对数期为宜。在蜗牛酶浓度8mg/ml、纤维素酶0.lmg/ml及果胶酶0.05mg/ml的作用下,pH为6.0～7.5,以0.7M甘露醇或0.gM蔗糖作稳定剂,有利于此种酵母原生质体的制备和再生.     

担子菌LMPQ39和CSP菌丝原生质体分离和再生的研究

本文以蜗牛酶和纤维素酶的混和酶液作为脱壁酶，通过酶解试验比较了菌龄，酶解时间，酶解温度及酶液浓度等对担子菌ＬＭＰＱ３９和ＣＳＰ菌丝原生质体分离的影响，通过原生体再生试验，比较了渗透压稳定剂对ＬＭＰＱ３９和ＣＳＰ菌丝原生质体再生的影响，获得了１０＾５－１０＾８数量级的原生质体再生菌落，同时，本文还对ＣＳＰ原生质体再生过程的形态变化作了适当的描述。     

蒙古口蘑与双孢蘑菇原生质体融合育种研究

以蒙古口蘑和双孢蘑菇为出发菌株,研究了酶浓度、酶解时间、菌龄和渗透压稳定剂、再生培养基等对蒙古口蘑和双孢蘑菇原生质体制备和再生的影响.结果表明,蒙古口蘑原生质体制备和再生的最佳条件是,培养5 d的菌丝体用2.5%(w/w)的溶壁酶酶解4 h,渗透压稳定剂为0.6 mol/L KCl,MB为再生培养基,制备率为7.53×1010个/L,再生率为8.4×10-4;双孢蘑菇原生质体制备和再生的最佳条件是,培养5 d的菌丝体用2%(w/w)的溶壁酶酶解3 h,渗透压稳定剂为0.6 mol/L KCl,PQA为再生培养基,制备率为6.96×1010个/L,再生率为7.4×10-4.对两种菌原生质体的释放过程进行形态观察,均为顶端释放.采用双亲灭活原生质体融合技术对蒙古口蘑和双孢蘑菇原生质体融合进行研究,蒙古口蘑原生质体采用热灭活,65℃处理30 min,灭活率达100%,双孢蘑菇采用紫外灭活,在15 W紫外灯下,距离30 cm,处理20 min,灭活率达100%,两菌株按1∶1混合,以30%PEMG(6 000)为促融剂,融合10 min,融合率为5.6×10-5.经遗传稳定性检验,融合菌株的遗传稳定率为80%,从菌落特征、菌丝形态、菌丝生长量、酯酶、游离全蛋白、乳酸脱氢酶、乙醇脱氢酶和过氧化物酶等同工酶方面对融合子进行筛选,获得一株具有双亲性状的融合株.     

维生素B＿2产生菌的原生质体制备及再生

用１．０％纤维素酶＋０．５％蜗牛酶的混合酶液酶解培养２６～３２小时的维生素Ｂ＿２产生菌阿氏假囊酵母（Ｅｒｅｍｏｔｈｅｃｉｕｍａｏｈｂｙｉｉ）菌丝体，可以得到大量原生质体，最佳酶解时间为１．５小时。原生质体再生率为０．３５％～０．６７％。阿氏假囊酵母在原生质体再生过程中具有较高的突变率，以维生素Ｂ＿２产量为指标的正突变率为１２．１４％。     

蒙古口蘑原生质体的制备与再生研究

影响蒙古口蘑原生质体形成和再生的因素很多,重点探讨了酶浓度、酶解时间、菌龄、渗透压稳定剂和再生培养基对原生质体形成和再生的影响.结果表明,蒙古口蘑原生质体制备和再生的最佳条件是:菌龄为5 d,2.5% 溶壁酶处理4 h,酶解温度25℃,0.6 mol·L-1KCl为渗透压稳定剂,MB为再生培养基,再生率为8.4×10-4左右.     

钝齿棒杆菌AS1.542原生质体形成和再生条件的研究

本文研究了钝齿棒状杆菌(Corynebacterium crenatum AS1.542)原生质体形成和再生的条件。结果表明:菌体培养至对数生长期,用1.Oμg/ml青霉素G处理4小时,再以1000μg/ml蛋清溶菌酶在37℃下处理14小时原生质体形成率达99.0％,在含0.5M蔗糖的高渗完全基上,它的再生率为20.0～50.0％。高渗缓冲液DF比NSM和SMM更适合于原生质体的再生,高渗稳定剂0.5mol/L蔗糖优于0.5mol/LNaCl。用电镜观察了菌体和原生质体的形态结构。     

玉米叶片原生质体的制备

本文以玉米黄化叶片为材料，采用两步酶解的方法研究了从玉米叶片制备原生质体的方法，发现第一次酶解以３０℃处理１ｈ为宜，第二次酶解以３０℃处理２．５～３ｈ较合适。同时发现所得原生质体净化悬浮时用２５％的蔗糖溶液在２５００ｒｐｍ离心５ｍｉｎ能获得较好的净化效果。     

洁霉素产生菌原生质体的形成、再生和融合

洁霉素产生菌不论生长在含有甘氨酸的S培养基或不含甘氨酸的S培养基的菌丝中,其细胞壁均可被溶菌酶溶解而释放出原生质体。甘氨酸浓度为1.0%破壁效果最好,溶菌酶的作用浓度以2.5mg/ml为最佳。原生质体在Hb培养基上能够很好地再生。用P培养基配制的40%(w/v)PEG1000溶液,能有效地诱导洁霉素产生菌原生质体融合。融合重组频率达6.7%。     

紫锥菊愈伤组织原生质体分离方法初探

紫锥菊提取物属于目前国际上流行的草本植物药,其主要运用于增强免疫力等方面.以加拿大狭叶紫锥菊愈伤组织为材料,研究影响其原生质体分离的因素,结果表明选用浅黄绿色、质地均匀且呈疏松颗粒状的紫锥菊愈伤组织易游离出原生质体;采用纤维素酶浓度为2.0%,果胶酶浓度为1.0%,半纤维素酶浓度为0.5%,甘露醇浓度为0.7 mol·L-1的酶液配方酶解时间为8 h时,原生质体的产量为每克鲜重含50.0×104个.由此归纳出一套完整的愈伤组织诱导,组织培养,原生质体分离纯化,原生质体鉴定及计数的方法.     

核酶转基因载体的构建及在烟草原生质体中对TMV感染的抑制作用

设计切割烟草花叶病毒RNA的锤头型核酸Rz－2，分别以pKyLx7和pBin19为载体，构建含Rz－2基因及核酸和底物连接的RzSb－2基因的重组质粒，通过三亲交配将目的基因转入土壤农杆菌中的Ti质粒．重组Ti质粒通过PEG法转化烟草原生质体，同时对转化的原生质体接种TMVc一定时间后以半叶法检测原生质体中病毒的侵染性．结果表明转基因原生质体中TMV侵染性明显低于未转基因的对照，推测病毒在转基因的原生质体中复制受到干扰；且核酸Rz－2（正向）表达后作用最为明显，核酸连底物RzSb－2（正向）与RzSb～2（反向）之间有明显差别．     

2种捕食线虫真菌大量原生质体的快速制备与再生技术

 比较了培养基、菌龄、溶壁酶、配制酶液的缓冲溶液和酶解条件等重要因素对2种捕食线虫真菌原生质体形成的影响.采用优化后的制备条件,用较低质量浓度的酶液(5mg/mL纤维素酶,5mg/mL蜗牛酶),在短时间内(5h)蠕虫节丛孢(Arthrobotrys vermicola)原生质体得率可达0.5×10⁷～1.0×10⁷mL^-1,球状单顶孢(Monacrosporium sphaeroides)原生质体得率为0.8×10⁷～1.5×10⁷mL^-1.原生质体的再生除了受到原生质体制备方法的影响,还与再生培养基的营养成分、渗透压稳定剂及其浓度有很大关系.另外还对原生质体的释放和再生进行了详细的观察和描述.     

利用原生质体融合技术选育高产菌株

以龟裂链霉菌(Sterpomyces rimosus)98#和76#为出发菌株,分别用溶菌酶制得2个亲本的原生质体,其中76#采用15 W紫外灯下30 cm照射25 min,100 %灭活,用PEG诱导进行了原生质体的融合.通过比较菌落外观、颜色挑选融合子328株,结合前期代谢情况进一步筛选高单位的融合菌株8株,经反复传代考察融合子的稳定性后得到1株新菌株102#,其发酵单位比亲本提高了13.0%.     

香菇菌丝原生质体制备及融合条件的研究

讨论不同菌龄、酶解时间、酶解温度、渗透压稳定剂对香菇原生质体产率的影响。结果表明 ,香菇菌丝制备原生质体时最适菌龄为 6天 ,酶解时间为 3h ,酶解温度为 34℃ ,渗透压稳定剂用 0 .6mol/L甘露醇为最佳。在此基础上 ,以 35 %的PEG为融合诱导剂进行香菇B0 1、L2 6种间原生质体融合 ,并用显微镜观察到融合子的形成     

金色链霉菌原生质体的制备

对金色链霉菌原生质体制备的具体条件进行了优化研究 .发酵培养基中采用蔗糖浓度 12 %、甘氨酸浓度 0 .5 %、酶解条件采用菌龄为 48h的菌丝、溶菌酶浓度 6mg/mL、酶解时间为 1h制备原生质体 ,原生质体制备率可高达 6 0 %以上 .