雏鹅新型病毒性肠炎病原快速检测技术的建立及应用

根据小鹅瘟病毒(GPV)和鹅源禽腺病毒(FAV)基因组序列特征分别设计了各自的PCR引物,经对反应条件的优化建立了能同时检测两种病毒的二重PCR方法．该法能从雏鹅新型病毒性肠炎和小鹅瘟疫苗株以及分离的鹅源腺病毒蚀斑克隆株分别扩增出相应的特异性产物,而对其它常见鹅病的病原及正常鹅胚肝组织的扩增结果均为阴性;对来自广西不同地方的36份临床病例样品的检测发现,其中具有雏鹅新型病毒性肠炎典型病变的22份样品均可检出GPV和FAV两种病毒．其它的有4份只检出GPV,3份只检出FAV;12份健康雏鹅肝组织中仅有一份检测到GPV;健康成鹅泄殖腔中GPV和FAV的检出率分别达44．29％、37．14％二者都有的占1．43％．结果表明,雏鹅新型病毒性肠炎的病原可能包括GPV和FAV两种病毒;建立的PCR诊断技术具有快速、敏感、特异的特点,可用于该病征的临床快速鉴别诊断以及流行病学的调查研究．     

白斑综合征病毒(WSSV)和血卵涡鞕虫多重PCR检测方法的建立

根据对虾白斑综合征病毒(WSSV)和血卵涡鞕虫在GenBank中已发表的基因序列分别设计2对引物,建立了一种同时检测WSSV和血卵涡鞕虫的多重PCR方法,即通过一次PCR反应,同时扩增WSSV和血卵涡鞕虫2种病原的核酸。应用该方法分别对已知WSSV和血卵涡鞕虫阳性的样品进行PCR扩增,分别扩增出了2条特异性带———467 bp(WSSV)和168 bp(血卵涡鞕虫),与实验设计相符,且与常规PCR检测结果一致。特异性实验结果也表明,该方法对WSSV和血卵涡鞕虫的检测均具很好的特异性,而对三疣梭子蟹其它常见病原、梭子蟹DNA样本的PCR扩增结果均为阴性。10份临床样品检测结果表明该检测结果与常规PCR检测结果符合率达到100%,说明所建立的多重PCR方法可以用于三疣梭子蟹2种病原的快速检测和鉴别诊断,对养殖三疣梭子蟹的疾病及时防控具有重要意义。     

猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒和猪轮状病毒三重PCR检测方法的建立

通过设计三对引物分别扩增猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)及猪轮状病毒(RV)的特异性基因,建立了一个能对TGEV、PEDV及RV感染鉴别诊断的三重PCR方法。该方法能同时检测TGEV的M基因252bp片段、PEDV的N基因540bp片段及RV的VP7基因412bp片段,而对CSFV、PCV2、PRRSV、PRV等无扩增,其检测TGEV、PEDV及RV的极限为100pg核酸/μL;用该方法对临床收集的26份粪便样品进行检测,结果表明:建立的多重PCR方法具有特异性强,强灵敏度高等特点,能用于临床诊断及流行病学调查。     

松属树种种苗鉴定中AFLP指纹技术的研究

AFLP(扩增片段长度多态性)标记技术是高效而可靠的标记技术之一，特别对于那些基因组序列信息很少的物种更为有效。笔对基因组较大的松属树种的AFLP实验程序进行了优化，提供了松树树种AFLP分析中DNA酶切、引物连接、预扩增及选择性扩增的优化实验程序。结果显示．预扩增反应中利用选择碱基数不同的预扩增引物(E/M 1，E／M-2)制备的模板对后续的选择性扩增结果没有显影响；在选择性扩增反应中，对碱基数目选择进行了细致的优化．分别测试了15个E-3M-3引物组合，6个E 4/M 3引物组合及15个E 3/M 4引物组合。对于有相同选择碱基数的引物．扩增结果随选择碱基的组合不同而有较大差异。据总的扩增结果发现，选择碱基增加时．扩增谱带数明显减少，谱带清晰度增加，即当选择碱基增加到E引物末端时(M十4／E 3)，大多数引物组合的扩增谱带数要比选择碱基增加到M引物末端(E 3/M 4)的引物组合扩出的谱带数少且带型清晰。总体来看，E 4/M 3的引物组合比较适合于松属树种的AFLP分析。笔还利用单株树种子的胚乳组织对AFLP标记的遗传方式进行了研究，在所用的两个引物组合获得的标记中，约有30％左右的分离标记．分离标记中偏分离比例约为6％。另外．选用3个松属树种对选出的14个AFLP引物组合进行的验证显示，这些组合在不同种间均获得了较好的扩增结果．说明在不同松属树种中筛选出的引物组合可以为其它松属树种AFLP分析引物组合的选择提供借鉴。     

传染性法氏囊病快速诊断技术的建立及其应用

根据已发表的IBDV各致病型毒株的序列，在病毒结构蛋白VP2编码基因的高变区(VP2 variable domain,vVP2)两端外侧的保守序列内设计合成了2条寡核苷酸引物，对各种不同致病型的12株参考毒株进行逆转录酶一聚合酶链式反应(RT—PCR)的检测．结果 12个参考毒株均能扩增出约679 bp的目的片段，而对作为阴性对照的常见5种鸡病病原NDV、IBV、CAIV、E．coli、pM均没有扩增出任何片段；应用建立的技术对疑似IBD的34份临床病料进行检测，并同时在基础RT—PCR扩增的片段内设计另一对引物进行Nested—PCR检测．结果基础RT—PCR方法检测到ll份阳性，Nested-PCR检测到23份阳性．研究的结果表明建立的IBD的RT—PCR诊断技术具有特异、快捷、敏感的特点．在此基础上设计的Nested—PCR则大大提高了阳性检出率(提高52．1％)．     

聚合酶链反应对性传播疾病病原体检测的意义

应用聚合酶链反应技术（PCR）对184例男性性传播疾病进行检测，检出单纯淋菌感染79例（43％）；衣原体感染42例（22．8％）；解脲支原体感染28例（15．2％）；混合感染26例（14．1％），认为PCR技术对STD的诊断具有快速、准确的效果。     

兜唇石斛的位点特异性PCR鉴别

根据兜唇石斛及其它37种枫斗类和黄草类石斛的rDNA ITS序列，设计了鉴别兜唇石斛的位点特异性PCR引物DC—JB01S和DC—JB01x，并对兜唇石斛成功地进行了位点特异性PCR鉴别．在进行位点特异性PCR鉴别之前，首先运用扩增ITS区的通用引物P1、P2对模板DNA进行扩增，以验证模板的可靠性和扩增的合适浓度．当退火温度上升为64℃，只有兜唇石斛的模板DNA能被扩增出来，而其它的37种石斛属植物均为阴性．该鉴别反应重复性好，已在鉴别我国兜唇石斛中发挥重要作用．与DNA测序鉴别方法相比，位点特异性PCR具有简单、省时、高效、准确等优点．     

62例肝功能异常学龄儿童输血传播病毒的检测结果

目的：分析血丙氨酸氨基转移酶(ALT)升高的学龄儿童(7—12岁)输血传播病毒(TTV)感染情况，并对其致病性及与其它肝炎病毒感染的关系做初步探讨。方法：应用巢式聚合酶链反应技术(Nested PCR)，对62例体检发现ALT升高和75例ALT正常的学龄儿童血标本进行TTV DNA扩增，通过凝胶电泳分离扩增产物；用ELISA方法同时检测甲、乙和丙型肝炎病毒感染的血清标志。结果：ALT升高中，TTV DNA检出率为12．9％(8／62)，其中3例HBsAg同时阳性(4．8％)，1例与抗—HCV同时阳性(1．6％)；ALT正常中，TTV DNA检出率为2．7％(2/75)，两差异具有显性意义(P＜0．05)。结论：肝功能异常学龄儿童存在较高的TTV感染率且有可能致肝功能损害。TTV与肝炎病毒可重叠感染同一儿童。     

海口地区人乳头瘤病毒感染的分子流行病学研究

利用PCR扩增和Southen杂交技术,对海口地区人乳头瘤病毒（HPV）型别进行了调查,结果显示,在所抽取的1045份样本中,有436份检出HPV-DNA,总阳性率为41．72％（436／1045）,其中有337份只检出1种型别感染（单侵染）,65份检出2种型别感染（二重侵染）,34份检出3种或3种以上型别感染（三重或三重以上侵染）,分别占感染样本的77．29％,14．91％和7．80％;在单侵染中,高危型所占比例为74．78％（252／337）,不同型别的检出率从高到低分别是HPV16（22．25％）,HPV58（17．89％）,HPV43（16．74％）,HPV52（16．06）和HPV6（8．94％）．其中HPV16,HPV58和HPV43为高危型,其检出率较高,具有一定的区域性．     

中药材桔梗及其易混品的DNA条形码分子鉴定

为了特异性地鉴别桔梗药材Platycodon grandiflorum及其易混品,通过优化DNA提取方法,并基于ITS(internal transcribed spacer)序列上的特异性位点,设计特异性引物,进行特异性PCR扩增,以扩增成功率为判定指标快速鉴别桔梗药材真伪.研究结果表明,改良CTAB(cetyltrimethylammonium bromide)法提取DNA较纯且100%扩增成功;基于桔梗293位和538位的特异性位点,设计特异性引物U1/D1,且特异性PCR鉴别中,仅桔梗能扩增得到约 264 bp 的特异性条带,其他药材均为阴性扩增.ITS序列以及特异性引物可准确鉴别桔梗及其常见易混品,为桔梗药材的基原鉴定提供科学依据.     

鸡肿瘤病快速鉴别诊断试剂盒及其应用研究

建立快速鉴别诊断鸡肿瘤病的聚合酶链式反应技术并研制成配套的诊断试剂盒。应用该试剂盒及其配套的操作程序,在2000年5月～2004年7月检测来源于广西6个地区202个禽群共685羽病、死鸡和火鸡的肿瘤和可疑肿瘤组织病料以及来源于安徽省不同地区的46个鸡群的疑似肿瘤病、死鸡305羽;同时,检测广西、安徽、山东、河南主要养鸡地区临床表现为生长缓慢、消瘦、贫血、疫苗免疫应答不佳、发病率和死亡率偏高等疑为免疫抑制状态的154个鸡群中的644羽病、死鸡。结果,在肿瘤和可疑肿瘤病料的检测中,马立克氏病、网状内皮增生症和禽白血病的阳性率分别为57．17％、11．84％和5．47％,其中二重、三重混合感染总检测率为16．25％。在疑似免疫抑制性疾病病料的检测中,3种鸡肿瘤病的阳性率分别为28．26％、7．45％和4．19％,其中二重、三重肿瘤病以及与其它免疫抑制性疾病的混合感染率达35．92％。建立的鸡肿瘤病快速鉴别诊断程序及试剂盒,操作简便快捷、结果准确可靠、保存方便、检测成本低,适用于临床鸡肿瘤病的鉴别诊断,对鸡肿瘤病的流行病学调查、免疫抑制病检测以及兽医检疫有重要价值。     

Gln 对鸭瘟感染鸭十二指肠免疫调节相关基因表达量的影响

摘要: 目的 为谷氨酰胺( Glutamine,Gln) 在正常鸭及鸭瘟( Duck plague,DP) 模型中对肠道功能及作用途径的研究提供依据。方法 280 只无特定病原体( Specific pathogen free,SPF) 7 日龄雏鸭随机分为 8 组,四组梯度剂量每天灌喂 Gln( 0、0. 5、1、2 g / kg 饲 料) 6d,及另四组灌喂同等梯度剂量 Gln 6 d,于 第 一 天 灌 喂 30 min 后 攻 0. 2 mL2000TCID50 鸭瘟病毒,观察 Gln 对正常雏鸭的免疫促进作用及攻毒鸭免疫应激的缓解作用。测定 Toll 样受体 4( Toll-like receptor 4,TLＲ4) 通路基因表达量。结果 Gln 显著提高正常组 TLＲ4 通路 mＲNA 表达量( P ＜ 0. 05) ,显著降低攻毒组表达量( P ＜ 0. 05) 。结论 Gln 通过 TLＲ4 通路提高正常雏鸭肠道的免疫力,降低鸭瘟病毒( Duck plague virus,DPV) 造成的肠道免疫损伤。     

牛疱疹病毒Ⅰ型(BHV-1)荧光定量PCR检测方法的建立及应用

目的 建立牛疱疹病毒Ⅰ型(BHV-1)实时荧光定量PCR检测方法,用于牛源性样本中BHV-1的快速检测。方法 根据已发表的BHV-1 gB基因设计特异引物和TaqMan探针,建立BHV-1实时荧光定量PCR方法。并对方法的特异性、敏感性、重复性稳定性等进行测定。用建立的方法对181份牛源性样本进行检测。结果 建立的BHV-1荧光定量PCR检测方法与牛副流感病毒Ⅲ型(BPIV3)、牛病毒性腹泻病毒1型(BVDV1)、猪伪狂犬病毒(PRV)、单纯疱疹病毒Ⅰ型(HSV-1)、猫疱疹病毒1型(FHV-1)均无交叉反应;检测灵敏度可达到1×101copies/μL;批内变异系数均小于5%。应用建立的方法检测181份牛源性样本,有6份样本BHV-1核酸为阳性。结论 建立的BHV-1荧光定量PCR检测方法具有快速、特异、敏感及稳定的特点,可用于牛源性样本中BHV-1污染的检测。     

应用PCR技术检测结核菌的临床研究

应用聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术对２４４例呼吸疾病患者临床标本进行结核菌ＤＮＡ检测，并同时与涂片抗酸染色结果进行比较。结果显示：１１２例结核标本涂片和ＰＣＲ检测阳性率分别为１６．１％和５２．７％，两者差别有显著性（Ｐ＜０．０１）。９４例涂阴结核标本ＰＣＲ阳性达４５．７％。结果表明应用ＰＣＲ技术检测结核杆菌ＤＮＡ具有快速敏感、特异性较高等优点，尤其对涂阴病人具有较大诊断价值     

鹅细小病毒CHv强毒株VP3基因克隆及遗传进化

根据Genbank中的鹅细小病毒(GPV)B株全基因序列,设计合成一对引物,应用PCR技术扩增了GPV强毒株CHv的VP3基因片段,将扩增后的VP3基因重组到pMD18-T质粒载体上,并对插入片段进行序列测定,将测序结果及由该结果推导的氨基酸序列与国内外分离的GPV、MDPV、PPV和CPV等不同宿主的细小病毒的VP3进行比对分析。结果表明:中国四川分离的GPV CHv株VP3基因长1 605 bp,编码534个氨基酸,与国内外10株GPV的VP3基因进行比较,核苷酸同源性为93.4%~99.8%,氨基酸同源性为96.5%~99.3%,其变异较小,是GPV保持一个血清型的分子基础。与番鸭细小病毒的核苷酸和氨基酸同源性分别为79.6%和89.9%,而与其他种属的细小病毒同源性均在30%以下,表明它们与GPV CHv株亲缘关系较远。     

应用聚合酶链式反应检测犬细小病毒

将具有犬细小病毒病典型症状的病犬肠溶物经ＳＤＳ－酚裂解法提取总ＤＮＡ,并以此ＤＮＡ为模板,通过人工合成的两条２０ｍｅｒ引物进行ＰＣＲ扩增,该对引物扩增的片段为犬细小病毒结构蛋白ＶＰ２基因中间１／３区段,ＰＣＲ产物经琼脂糖凝胶电泳,试验结果表明：用ＰＣＲ扩增检测犬细小病毒具有良好的特异性,应用该方法检测的２７份病犬肠溶物样品块获得了预计长度的ＤＮＡ片段（５３１ｂｐ）,而健康犬的肠溶物样品ＰＣＲ结果为     

TTV感染的检测及意义

目的：探讨本地区不同型别肝炎患者血清中TTV感染状况。方法：采用巢式PCR对97例不同型别肝炎患者血清中TTVDNA进行检测。结果：对97例不同肝炎患者血清中TTV检测,其阳性率慢性乙型肝炎为6.0%,慢性丙型肝炎为24.0%,非甲-庚型肝炎为18.1%。结论：采用巢式PCR对不同型别肝炎患者血清中TTVDNA进行检测。为本地区TTV肝炎的诊断和治疗提供实验诊断方法,具有一定的指导意义。     

华南地区汉族人群MDR1基因单核苷酸多态性研究

 多药耐药基因1（MDR1）单核苷酸多态性（SNP）与疾病的易感性、药物治疗效果以及患者的生存复发等预后密切相关。采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）和聚合酶链反应-单链构象多态性（PCR-SSCP）方法,对华南地区无亲缘关系的汉族人群MDR1基因编码区及部分启动子区进行SNP筛查,并比较不同人种间等位基因频率的差异。结果共检测出5个多态位点：T-2410C、T-129C、C1236T、G2677T/A和C3435T,其等位基因频率-2410C为4.65%,-129C为3.11%,1236T为63.31%,2677T为44.66%,2677A为14.47%,3435T为41.18%。除T-2410C位点因报道的太少无法比较外,其余位点等位基因频率在东亚、高加索以及非洲人群中的分布存在显著差异。该研究为进一步研究华南地区汉族人群MDR1基因SNP与药物效果、药物毒副作用以及疾病易感性之间的相关性提供依据。     

甲型H1N1流感超敏感诊断方法的建立及优化

利用几种助沉剂和核酸纯化方法富集病毒RNA,建立甲型H1N1流感超敏感诊断方法。收集31份甲型H1N1流感确诊病人提取的病毒RNA,稀释至1000分之一倍后分别应用酵母tRNA、糖原、AcrylCarrier助沉剂和磁珠、硅胶颗粒和离心柱的9种组合进行病毒RNA的富集,富集后分别进行RealtimePCR检测。并对检测结果进行统计学分析。利用几种助沉剂和核酸纯化方法的组合时,发现磁珠+AcrylCarrier助沉剂方法是最佳的核酸富集方法,能够大大提高病毒核酸的检出效率。建立了甲型H1N1流感超敏感诊断方法,该方法能够大大提高甲型H1N1流感的检出率。