ΔNp63γ 和ΔNp63a及其C端在H1299细胞凋亡中的作用

为了研究ΔNp63γ、ΔNp63a及其C端(p63aCT)在细胞凋亡中的作用,本研究扩增出人ΔNp63γ、ΔNp63a和p63aCT编码序列,并克隆至慢病毒表达载体pLVX-HA-Flag.通过将构建的pLVX-ΔNp63a、pLVX-ΔNp63γ、pLVX-p63aCT包装至慢病毒颗粒,感染人肺癌细胞株H1299后,用Western blot检测到ΔNp63γ、ΔNp63a及其C端能在H1299细胞中有效地过表达;通过PI染色以及流式细胞术检测发现ΔNp63a能有效挽救DNA损伤药物Cisplatin(CDDP)诱导的细胞凋亡,而ΔNp63γ和ΔNp63aCT则没有明显的挽救效果.本研究表明,在H1299细胞中,ΔNp63a具有抑制细胞凋亡的作用,其C端可能与其它功能域一起参与此过程.     

ING4及IL-24双基因共表达腺病毒载体对MG-63人骨肉瘤细胞体外抑癌增效作用研究

目的用人肿瘤生长抑制因子(mING4)及人白介素24(IL-24)基因构建腺病毒双基因共表达载体(Ad-ING4-IL-24),并设Ad-ING4和Ad-IL-24单基因对照,研究双基因共表达载体对MG-63人骨肉瘤细胞体外抑癌增效作用.方法首先将已构建成功的Ad-ING4-IL-24,Ad-ING4及Ad-IL-24腺病毒感染QBI-293A细胞,经多轮扩增后获得高滴度的病毒子,测病毒效价后分别以100 MOI剂量感染MG-63细胞,用荧光显微镜、RT-PCR法检测ING-4及IL-24在MG-63细胞中的转录和表达;MTT法检测ING-4及IL-24基因表达对MG-63细胞的生长抑制效应;半定量RT-PCR法检测ING4及IL-24基因表达对MG-63细胞中的Bcl-2,Bax,Caspase3,p21,CD34等相关基因表达的影响.结果获得了高滴度的重组腺病毒Ad-ING4-IL-24,Ad-ING4,Ad-IL-24和Ad-GFP;治疗后MG-63细胞中ING-4及IL-24双基因表达对MG-63细胞增殖有明显抑制作用,ING-4及IL-24基因表达可通过上调细胞中Bax,Caspase3,p21和下调Bcl-2,CD34基因表达诱导细胞凋亡.在病毒子剂量为100 MOI时,Ad-ING4-IL-24对MG-63人骨肉瘤细胞抑制作用比对Ad-ING4和Ad-IL-24抑制效果更为显著.结论腺病毒介导的ING4或/和IL-24基因可明显抑制MG-63人骨肉瘤细胞的生长,且Ad-ING4-IL-24双基因比Ad-ING4和Ad-IL-24单基因的抑制效果更为显著,该现象可能是通过改变Bcl-2,Bax,Caspase3,p21,CD34基因表达水平来发挥抗肿瘤作用的.     

靶向survivin基因的shRNA慢病毒载体的构建及其对膀胱癌EJ细胞凋亡的影响

目的:构建survivin基因特异性shRNA慢病毒干扰载体,转染膀胱癌EJ细胞,研究survivin基因在膀胱癌细胞株中的表达抑制情况,观察survivin shRNA慢病毒载体对EJ细胞凋亡的影响.方法:以survivin基因为靶标设计shRNA干扰序列,克隆至p SIH1-H1-cop GFP慢病毒载体.干扰载体鉴定正确后转染膀胱癌细胞株EJ细胞,荧光显微镜下观察GFP表达情况,实时荧光定量PCR检测survivin基因mRNA含量变化,Western blotting法检测survivin蛋白表达,Annexin V-FITC/PI双染法检测EJ细胞凋亡情况.结果:PCR扩增鉴定、DNA测序证实survivin慢病毒干扰载体构建成功;EJ细胞经干扰载体处理后,EJ细胞survivin基因mRNA水平下调了73.33%,蛋白表达受到显著抑制,EJ细胞凋亡率达到24.39%.结论:成功构建了靶向survivin基因的shRNA重组慢病毒干扰载体,可以显著降低转染细胞survivin基因的表达水平,并有效提高膀胱癌细胞凋亡率.     

p63在胃癌组织中的表达

目的:探讨抑癌基因p53蛋白家族成员p63蛋白在胃癌及癌旁组织中的表达情况.方法:回顾性分析41例胃癌及37例癌旁组织,利用组织微阵列技术,构建88点组织阵列,并采用免疫组织化学技术S-P法检测该阵列中p63蛋白在胃癌及其癌旁组织中表达情况.结果:①p63蛋白定位于细胞核,呈弥漫分布的棕黄色颗粒;②胃癌组织中,p63蛋白表达于核大间变细胞中;p63蛋白在高分化型胃癌中阳性表达率为5.9%,在低分化型胃癌中的阳性表达率为41.7%,两者比较差异有统计学意义(P<0.05);③p63蛋白在胃癌癌旁组织中无表达,在胃癌中的阳性表达率为24.4%,两者比较差异有统计学意义(P<0.05).结论:①p63蛋白的高表达可能参与了胃癌的发生;②p63与胃癌的分化程度有关,并可能参与了胃癌细胞的分化.     

融合蛋白TAT-p53-MTS的促细胞凋亡作用

本研究首先构建了融合蛋白 TAT-p53-MTS 的原核表达质粒 pET-22b(+)-TAT-p53-MTS,将表达纯化的融合蛋白与p53缺陷型人肺癌细胞NCI-H1299孵育,通过Western blot和免疫共沉淀(co-immunoprecipitation,co-IP)检测融合蛋白的细胞穿膜以及与 Bcl-2蛋白的相互作用,并通过流式细胞术检测融合蛋白对 NCI-H1299细胞的促凋亡作用。结果显示,融合TAT和MTS的p53重组蛋白具有更强的细胞穿膜及线粒体定位能力;并且,融合蛋白能够通过与Bcl-2蛋白的结合显著诱导NCI-H 1299细胞的凋亡。     

Pin1的细胞定位调控Rb蛋白的磷酸化状态

为了研究Pin1和Rb蛋白的细胞定位、Pin1调控Rb磷酸化的相关机制,本研究构建了慢病毒载体pLVX-Flag-HA-Pin1和Plko.1-shRNA,包装病毒感染人非小细胞肺癌(H1299),免疫印迹检测Pin1蛋白表达水平,采用免疫荧光染色、免疫组化技术研究蛋白的定位.结果表明,沉默Pin1可降低Rb的磷酸化并抑制细胞的增殖;培养的肿瘤细胞和肿瘤组织中,Pin1可定位到细胞质中,而胞质定位的Pin1也可增加Rb的磷酸化.     

山奈酚对人小细胞肺癌H446细胞凋亡的影响

研究山奈酚诱导人小细胞肺癌H446细胞凋亡的作用及可能的作用机制.采用MTT法检测山奈酚对小细胞肺癌H446细胞增殖的抑制作用;采用DAPI染色检测经山奈酚处理后细胞凋亡的形态变化;采用RT-PCR和Western-blot技术检测山奈酚处理前后H446细胞p53,bax,bcl-2 mRNA和蛋白的表达.结果显示,不同浓度的山奈酚能抑制人小细胞肺癌H446细胞生长,且随浓度增加抑制作用增强;H446细胞在山奈酚诱导下出现典型的凋亡形态;20μmol/L以上浓度的山奈酚处理后,p53,bax mRNA和相应蛋白表达均升高,而bcl-2 mRNA和蛋白表达降低.研究表明,山奈酚对H446细胞增殖有抑制作用,并能促进其凋亡.p53,bax和bcl-2在山奈酚诱导人小细胞肺癌H446细胞凋亡中起重要作用.     

人参皂甙Rg1对人成骨肉瘤MG-63细胞形态结构和终末分化指标的影响

为了研究人参皂甙Rg1对人成骨肉瘤MG-63细胞(以下简称"MG-63细胞")形态与超微结构及终末分化指标的影响,鉴定其对MG-63细胞的诱导分化作用,以50 μg/mL人参皂甙Rg1处理MG-63细胞,光学显微镜与电子显微镜观察MG-63细胞形态、超微结构变化,免疫细胞化学方法检测成骨细胞相关终末分化蛋白的表达变化,并同步以HMBA处理MG-63细胞作为阳性对照.光学显微镜与电子显微镜观察结果显示细胞形态与超微结构产生了细胞形态规则、大小一致、细胞铺展体积增大,核质比例减小、核内核仁数目减少、细胞器丰富发达等与正常细胞相似的恢复性变化.观察到MG-63细胞终末分化指标I型胶原、骨粘素、骨钙蛋白的阳性表达及钙化糖原颗粒的增多与典型骨节结的形成,其变化结果与HMBA处理细胞类似.本研究证实人参皂甙Rg1能显著改变MG-63细胞形态与超微结构恶性特征,并增强成骨细胞相关的终末分化指标的表达,从而对MG-63细胞的终末分化具有一定的诱导作用.     

血管内皮细胞凋亡过程中几种癌基因表达的研究

为了研究细胞凋亡的分子调控机制 ,用光学显微技术、DNA凝胶电泳和Northernblot方法 ,研究了去除生长因子 (FGF和血清 )和蛇毒诱导的两个血管内皮细胞凋亡系统中 p53、c H ras、c myc和bcl 2基因的表达 .发现去除生长因子诱导的细胞凋亡过程中 ,p53基因表达显著增加 ,c H ras和c myc基因表达无变化 ;蛇毒诱导细胞凋亡过程中 ,p53基因表达显著增加 ,c H ras和c myc基因表达无变化 .在正常生长和凋亡细胞中均未检测到bcl 2基因的明显表达 .实验结果表明 :p53基因参与上述两种细胞凋亡诱导系统的分子调控 ;c H ras基因只参与去除生长因子诱导的细胞凋亡过程 ,而不参与蛇毒诱导的细胞凋亡过程 ;这两种细胞凋亡诱导系统均与c myc基因表达无关 ;未见bcl 2基因明显参与血管内皮细胞的凋亡过程 .     

小鼠Sirt3基因过表达慢病毒载体的构建及其表达鉴定

构建小鼠Sirt3基因过表达慢病毒载体,检测人神经母细胞瘤细胞(SK-N-SH细胞)感染Sirt3基因过表达慢病毒后Sirt3 mRNA和蛋白的表达,为在细胞和动物水平研究Sirt3的作用提供新的途径和工具。利用Genebank检索的小鼠Sirt3基因序列,人工合成法合成小鼠Sirt3基因的c DNA片段,将其克隆至慢病毒载体p CDH-CMV-MCS-EF1-cop GFP中,构建慢病毒表达质粒。进行酶切及测序验证后,将慢病毒表达质粒连同辅助包装原件载体质粒共同转染入293T细胞,收集上清,测定病毒滴度。用Sirt3基因过表达慢病毒感染SK-N-SH细胞,即为Sirt3过表达组(Sirt3);用空载体慢病毒感染的SK-N-SH细胞为空载体组(GFP);未感染病毒的SK-N-SH细胞为对照组(CON)。收集细胞后,用Real-time PCR法检测各组细胞Sirt3 mRNA的水平;用Western blotting法检测各组细胞Sirt3蛋白的表达。Sirt3基因过表达慢病毒载体构建成功,病毒滴度为1.0×10~9TU/m L。Sirt3组SK-N-SH细胞的Sirt3 mRNA和Sirt3蛋白水平均显著高于GFP组和CON组(P0.01)。成功构建的Sirt3基因过表达慢病毒载体具备高效感染力,能在SK-N-SH细胞高效过表达Sirt3,本研究结果为今后进一步在神经细胞和模型动物中研究Sirt3的作用提供了新的途径和工具。     

H13诱导人卵巢癌A2780细胞凋亡及其机制的研究

探讨新型Topo I抑制剂H13对人卵巢癌A2780的杀伤和诱导凋亡的作用机制.MTT法对人卵巢癌A2780的杀伤作用;流式细胞仪研究H13对A2780细胞的凋亡诱导作用;Western Blot法检测H13对A2780细胞内caspase-3和p53蛋白表达的影响.H13对人卵巢癌A2780有明显细胞毒性作用,并且有剂量依赖性;A2780细胞在H13作用后出现特征性凋亡形态特征,且凋亡率由5.7%上升为20.6%;H13明显增加p53蛋白的表达和caspase-3蛋白的表达.H13对人卵巢癌A2780有明显的杀伤和促凋亡作用,其机制可能依赖于细胞内p53蛋白和caspase-3蛋白表达增高.     

BMP2对骨肉瘤细胞株MG63的作用机制

为探讨骨形态发生蛋白2(BMP2)在体外抑制人骨肉瘤细胞株MG63的增殖和迁移并促使其凋亡的作用机制,分别用绿色荧光蛋白重组腺病毒(AdGFP)、骨形态发生蛋白2重组腺病毒(AdBMP2)感染人骨肉瘤细胞MG63,用RT-PCR和免疫细胞化学法检测核录因子κB(NF-κKB)、有丝分裂素激活蛋白激酶激酶4(MKK-4)的mRNA和蛋白水平变化.结果发现.AdBMP2降低MG63中NF-κB的mRNA水平和蛋白表达,分别为对照组的38.2%和42.5%(P<0.05);但未能检测到对MKK-4表达的影响.研究表明,BMP2可以显著降低细胞中NF-κB的mRNA水平和蛋白水平.这可能是其抑制细胞增殖和迁移、促进凋亡的机制之一.     

p53突变蛋白下调调控人肺腺癌细胞中E-cadherin的表达并促进细胞迁移

摘要：p53 是最重要的抑癌基因之一。在肿瘤发生发展过程中,超过50% 的人类肿瘤组织和细胞中存在 p53 基因发生突变,而且大多数为点突变,其中包括 R273H,由此产生的点突变蛋白会失去 p53 的DNA结合和特异的转录活性。最近的研究表明p53突变蛋白还可能获得一些野生型p53蛋白不具有的新的生物学活性。在本研究中,我们在人肺肿瘤细胞 H1299 中稳定表达含R273H 点突变的p53 蛋白（p53-R273H）,观察到细胞中 E-cadherin mRNA 和蛋白水平下调,同时细胞迁移能力增强。免疫荧光方法检测发现 p53-R273H 显著降低 E-cadherin 在肿瘤细胞间的表达。这些结果表明p53-R273H 突变蛋白具有下调 E-cadherin 基因的表达和促使肿瘤细胞迁移的新功能。     

低剂量碳离子束辐射增强AdCMV-p53转染对人非小细胞肺癌细胞的治疗效果

探讨低剂量碳离子束预辐照对AdCMV-p53转染非小细胞肺癌细胞的影响,观察了20和40MOIAdCMV-p53转染经^12C^6＋束流或γ射线预辐照的H1299细胞后,外源性p53的表达、细胞周期、细胞凋亡和细胞存活等．结果显示,经碳离子束预辐照后AdCMV-p53转染细胞p53阳性细胞所占比例高达90％多,明显高于γ射线预辐射后AdCMV-p53转染细胞p53阳性率．低剂量碳离子预辐照明显阻止AdCMV-p53转染细胞G0／G1阻滞的发生,促进G2／M阻滞和细胞凋亡的发生．碳离子束辐射诱导AdCMV-p53转染组相对生物学效应（RBE）比单纯碳离子束辐照组增加30％～60％,比单纯AdCMV-p53转染组增加20％～130％,比单纯γ辐射诱导AdCMV-p53转染组增加30％～70％．结论：低剂量碳离子束预照射明显增强外源性p53的表达和AdCMV-p53转染对非小细胞肺癌细胞的抑制．     

泛素连接酶Nedd4调控人前列腺癌细胞的增殖与凋亡

为了研究泛素连接酶Nedd4对肿瘤细胞增殖和凋亡的影响,利用小RNA干扰技术,通过慢病毒包装,侵染前列腺癌细胞DU145,达到下调Nedd4表达的目的.MTT检测表明,下调Nedd4表达可以抑制DU145细胞的增殖;DAPI染色发现,下调Nedd4表达的DU145细胞对星形孢菌素诱导的细胞凋亡更加敏感.这些结果都说明,下调Nedd4的表达不仅可以抑制DU145肿瘤细胞增殖,而且可以促进细胞凋亡.     

人乳头瘤病毒HPV16E6的表达促进角质生成细胞凋亡的发生

为探讨HPV16早期基因E6的表达对角质生成细胞NIKS凋亡表型的影响及可能的机制,经培养稳定表达HPV16E6的角质生成细胞NIKS;使用不同的DNA损伤剂处理转染后细胞,流式细胞术检测细胞凋亡情况;建立表达HPV16E6突变体Y54D及F2V的p53降解缺陷型NIKS细胞系并用DNA损伤剂处理,流式细胞术检测凋亡情况.研究显示,流式细胞术结果显示稳定表达E6的细胞系在足叶乙甙、丝裂霉素及紫衫醇处理后发生明显的细胞凋亡;表达Y54D或F2V的NIKS细胞经DNA损伤剂处理后凋亡明显低于正常E6表达细胞.研究表明,人乳头瘤病毒E6的表达能够促进角质生成细胞凋亡的发生,这种促凋亡作用与细胞内p53的表达相关.     

沉默PPARγ对骨肉瘤MG-63细胞增殖的影响及相关机制

目的:探讨过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)基因沉默对骨肉瘤MG-63细胞增殖的影响及其机制.方法:将PPARγshRNA(干扰质粒),scramble shRNA(阴性对照质粒)转染入骨肉瘤MG-63细胞中,Western blot检测PPARγshRNA对PPARγ蛋白的抑制作用;MTT法观察PPARγ沉默对骨肉瘤MG-63细胞增殖的影响,克隆形成实验与检测PPARγ沉默对骨肉瘤MG-63细胞克隆形成能力的影响;Western Blot检测PPARγ沉默后对骨肉瘤MG-63细胞中细胞增殖相关蛋白p-AKT、p-GSK-3β、CyclinD1的蛋白表达水平的影响.结果:PPARγ在骨肉瘤MG-63细胞中沉默成功;MTT及克隆形成实验结果显示沉默PPARγ可促进骨肉瘤MG-63细胞的增殖;Western Blot检测结果显示PPARγ沉默上调骨肉瘤MG-63细胞p-AKT、p-GSK-3β、CyclinD1蛋白的表达.结论:沉默PPARγ可能通过调控Akt/GSK-3β/CyclinD1信号通路促进骨肉瘤MG-63细胞的增殖.     

对香豆酸抑制肺癌细胞增殖、迁移并诱导其凋亡的机制研究

探究了对香豆酸（p-coumaric acid,p-CA）对人肺癌细胞细胞A549和H1299增殖、凋亡和迁移的影响及作用机制.结果显示,添加0～10 mM p-CA能显著抑制两种肺癌细胞的生长和迁移,并呈剂量和时间依赖性（P<0.001）. p-CA显著抑制了细胞周期发生,并将细胞周期阻滞在G1期,且细胞凋亡发生明显增加（P<0.05）. p-CA显著抑制了CDK2、CDK6、Cyclin D1等周期正调控因子表达,并诱导细胞周期负调控因子p21、p27等基因的表达上调;与此同时,p-CA还诱导了促凋亡因子Bax表达上升和抗凋亡因子Bcl-2表达水平的降低且caspase-3和caspase-9的表达上调,而对迁移相关基因表达的检测结果也显示p-CA抑制了β-连环蛋白（β-catenin）的表达并促进钙粘附蛋白E(E-cadherin)表达上升.上述结果表明,p-CA具有抑制肺癌细胞生长、诱导凋亡并抑制其迁移的作用,它主要是通过促进Bax、caspase-3、caspase-9、p21、p27、E-cadherin等蛋白的表达而抑制Bcl-2、Cyclin D1、β-ca...     

Npas4基因过表达慢病毒的构建及其在SK-N-SH细胞的表达

研究旨在构建Npas4基因过表达慢病毒,为进一步深入探索Npas4基因的功能奠定基础。用人工合成大鼠Npas4基因c DNA片段,将其插入p CDH-CMV-MCS-EF1-cop GFP构建慢病毒表达质粒p CDH-Npas4。酶切、测序验证质粒后,将p CDHNpas4和辅助质粒共转染包装细胞293T,浓缩上清得病毒颗粒并测定病毒滴度。取病毒颗粒感染SK-N-SH细胞48 h,收集细胞采用Western blotting法检测Npas4蛋白的表达。p CDH-Npas4携载正确Npas4基因,将其包装293T细胞后能产生病毒。病毒滴度为1.05×109TU/m L。相比于转染GFP病毒对照组(GFP)和未转染对照组(control),Npas4重组慢病毒组(Npas4)的细胞Npas4蛋白表达显著增高。成功构建Npas4基因过表达的重组慢病毒载体p CDH-Npas4,并获得高效的重组慢病毒,能将外源Npas4基因导入SK-N-SH细胞,为进一步研究Npas4基因的相关功能奠定了基础。     

西达本胺通过线粒体凋亡途径诱导结肠癌HCT-15细胞凋亡

研究西达本胺(Chidamide)对结肠癌细胞系HCT-15的增殖抑制作用及机制. 以不同浓度西达本胺处理HCT-15细胞,CCK-8法检测细胞增殖情况及细胞的药物敏感性;平板克隆形成实验检测细胞体外克隆形成能力;流式细胞术检测细胞凋亡;EdU实验检测细胞增殖周期;Western blot检测乙酰化组蛋白、线粒体凋亡途径相关蛋白、细胞周期相关蛋白表达水平的变化. 结果表明:西达本胺抑制HCT-15细胞增殖呈浓度和时间依赖性,细胞体外克隆形成能力减弱,凋亡增多,细胞分裂相明显减少、总周期变慢,乙酰化组蛋白H3和H4、线粒体介导的相关凋亡蛋白表达上调、p21、p27表达上调、CDK2、CyclinA2蛋白表达下调. 西达本胺可抑制HCT-15细胞增殖,通过线粒体途径诱导细胞凋亡并阻滞细胞周期.