ELISA法快速测定McAb培养上清中鼠源IgG质量浓度

用小鼠IgG纯品免疫新西兰大白兔,获得兔抗小鼠IgG多克隆抗体.以兔抗小鼠lgG多抗包被聚苯乙烯微孔板.配以辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG抗体和以3,3'5,5-四甲基联苯胺(TMB)为底物,建立了快速测定McAb培养上清中鼠源IgG的双抗体夹心ELISA方法.该方法的检测线性范围是7.02ng/mL至449.38ng/mL之间,回收率在94.83%-115.15%之间,变异系数在1.45%-9.94%之间.显然用该方法测定MeAb培养上清中鼠源IgG质量浓度是可行的.     

用酶联免疫吸附试验(ELISA)进行小鼠及大鼠的肺炎支原体病的血清学诊断

<正> 肺炎支原体的血清学诊断多用CF试验。现在人们渴望寻求较CF试验敏感、快速,经济的诊断法,为此进行本试验。材料及方法 1.小鼠大鼠Mycoplasma pulmonis—MP的人工感染:SPF小鼠4周令,雌雄不拘,将其鼻部浸于5×10~8CFU/ml的MP悬浮液里约2秒钟令其感染。SPF大鼠,4周令,用10~8CFU/ml的MP悬浮液喷雾20分钟使其吸入感染。感染的小鼠、大鼠均用灭菌饲料及自来水饲养。 2.自然感染的小鼠、大鼠:是从16个单位鼠群中收集的个体。 3.MP的分离:取全部供试动物之鼻腔、气管、及部分肺材料,用固体培养基分     

兔抗SARS冠状病毒IgG的纯化及鉴定

目的：制备高纯度的兔抗SARS冠状病毒的IgG。方法：采用辛酸-硫酸铵沉淀进行初纯,以及DEAE离子交换层析精纯IgG,利用SDS-PAGE对纯化后的IgG纯度进行测定,利用间接ELISA、病毒中和滴定对IgG进行效价测定。结果：纯化后的IgG相对纯度达到90％以上,ELISA检测效价为1：4800,病毒中和效价为1：640。结论：利用上述纯化工艺能获得高纯度的兔抗SAILS冠状病毒IgG,同时抗体活性损失较小。     

人胎肝金属硫蛋白的分离纯化及酶联免疫吸附检测

人胎肝经匀浆、离心、乙醇沉淀后,通过Sephadex G-75、DEAE-Sepharose Fast Flow柱层析分离,获得金属硫蛋白的两种亚型(MT-1和MT-2)。经氨基酸组成分析证明是均一的。MT-1为抗原免疫青紫兰兔制备了抗血清,以纯化的IgG建立了人MT的酶联免疫吸附检测(ELISA)方法,并给出了标准工作曲线。     

WSSV单抗的制备及其在红螯螯虾病毒病检测中的应用

将提纯的感染红螯螯虾的WSSV,免疫BALB/c小鼠,三次免疫后取其脾细胞与SP2/0融合.间接ELISA筛选,阳性克隆经3次亚克隆后,共获得7株针对WSSV的特异性单抗,分别命名为E2、C2、E3、G3、C4、D5以及F10.细胞上清ELISA效价为1：1 600～1∶6 400.抗体亚类鉴定结果表明:E2、G3、C4属于IgG1,C2、D5、F10属于IgG3,E3属于IgG2a亚类;单抗热稳定性试验表明7株单抗均是热稳定的.选取单抗G3和F10进行病毒中和试验,结果表明:在适宜的抗原浓度下,两株单抗均有较好的中和能力.选取单抗G3作为一抗建立了间接ELISA方法,通过对人工感染红螯螯虾WSSV的测定,初步证实该单抗可用于WSSV的检测.     

欧洲鳗鲡抗体生成规律的初步研究

用山羊IgG注射欧洲鳗鲡背部肌肉后,采用山羊IgG-琼脂糖亲和层析柱对欧鳗血清免疫球蛋白（IgM）进行分离纯化,并通过SDS-PAGE电泳对纯化后的IgM进行检测,同时制备兔抗欧鳗IgM血清,运用间接ELISA检测正常欧鳗血清（第0天）以及山羊IgG注射欧鳗后第7、14、21、28、35、42天的血清抗体水平,同时利用荧光定量PCR测定了第0天至第28天的欧鳗肾脏、脾脏和鳃中IgM基因表达水平变化.结果表明：纯化后的欧鳗IgM经SDS-PAGE检测含有一条分子质量约68 ku的重链,以及分子质量分别为26 ku和28 ku的两条轻链,获得的兔抗欧鳗IgM血清效价达1/51 200;欧鳗血清抗体水平在第28天达到峰值,脾脏IgM基因表达水平在第14天达到峰值,肾脏和鳃均在第21天达到峰值,血清抗体水平以及三种组织器官IgM基因表达水平的变化规律均为先升高、达到峰值后再降低.     

弓形虫pcDNA3-ROP1 DNA疫苗免疫小鼠诱导体液免疫应答及保护性的初步观察

目的 观察弓形虫pcDNA3-ROP1 DNA疫苗免疫BALB/C小鼠诱导其体内产生的体液免疫应答及抗虫感染的免疫保护作用.方法 重组质粒用生理盐水稀释后,肌注免疫BALB/C小鼠.分别于免疫后5周和10周用ELISA法测定IgG抗体滴度;免疫鼠腹腔注射弓形虫速殖子攻击感染.结果 经两次检测,均可测到特异性IgG抗体,且抗体的滴度随免疫时间的延长而增高;弓形虫速殖子腹腔攻击感染免疫组小鼠的平均存活时间较对照组延长,统计学有显著性差异(P<0.01).结论 弓形虫pcDNA3-ROP1质粒 DNA疫苗能诱导BALB/C小鼠产生特异性体液免疫应答及部分抗虫免疫保护作用.     

三聚氰胺多克隆抗体的制备及鉴定

用三聚氰胺偶联蛋白为抗原,按不同的时间规律及抗原剂量对成年兔进行免疫,获得特异性的三聚氰胺多克隆抗体.效价检验应用蛋白质电泳和间接ELISA方法.应用10%及12.5% SDS-PAGE,验证血清中IgG抗体的产生情况,再用间接酶联免疫吸附试验测得第4次免疫后抗体效价达到1.2×107.此法易于实施,且获得的血清样品具有较高的效价,为今后三聚氰胺多克隆抗体的分离纯化提供了可靠的实验依据.     

小鼠腺病毒在鼠群中心感染及血清学检测方法的比较

本文采用ELISA法、间接免疫荧光法(IFA)和酶免疫分析(EIA)三种方法检测小鼠腺病毒血清抗体,并对三种方法的敏感性和特异性进行了比较。同时对国内14个省市的38个单位的开放饲养和SPF小鼠腺病毒的感染情况做了调查。用131只SPF小鼠的检测结果确定鼠腺病毒的阳性界限。结果表明:开放饲养的鼠群有程度不同的感染,而SPF小鼠的感染率为0％。三种血清学方法均可应用,其中以ELISA法最为敏感。     

“兔瘟”疫苗免疫家兔蚓突免疫细胞的对比观察

“兔瘟”是近年来在我国广泛流行的一种高度致死性的急性传染病,给养兔业造成了巨大的损失。为探求家兔对“兔瘟”的特异免疫机理,笔者应用常规酸性非特异性醋酶(ANAE)染色法分别对临床健康、“兔瘟”免疫和患“兔瘟”死亡的成年家兔蚓突免疫细胞进行了对比性观察,现将结果报告如下: 材料与方法 1、健康家兔:选取体重2000—3000克的青紫兰家兔,经“兔瘟”HI测定阴性,隔离饲养观察5天,确认临床健康的10只。 2、免疫家兔:用本校研制的10％“兔瘟”组织脏器灭活疫苗免疫19～21天,经“兔     

小麦GLB1蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

以小麦主要过敏原Glb-1蛋白为免疫原免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤NS-1细胞融合。采用细胞融合和有限稀释法相结合的方法快速筛选获得稳定分泌的特异性杂交瘤细胞株,用杂交瘤细胞株诱生小鼠腹水并用蛋白A亲和层析法纯化抗体后检测。采用间接ELISA法鉴定该单克隆抗体的IgG亚型;通过间接ELISA鉴定该单克隆抗体的特性和交叉性。利用双单抗夹心ELISA法检测单抗的抗原表位特异性。结果表明:共获得4株可稳定分泌小鼠抗小麦主要过敏原Glb-1蛋白的单克隆抗体,分别命名为1C4、4H5、1A9、4F5,经检测其Ig亚型均为IgG1,且4株单抗效价均在10-9以上。ELISA结果分析表明该4株单抗均能特异性识别小麦主要过敏原Glb-1蛋白且和其他常见食物无交叉反应性。将4株单抗两两配对进行ELISA实验,结果发现1C4与4H5可能有不同的抗原表位,以此建立的双抗夹心ELISA系统可以检测小麦Glb1-G3蛋白。实验成功制备了鼠抗小麦主要过敏原Glb-1蛋白抗原的单克隆抗体,并且建立了双单抗夹心ELISA检测系统,为小麦主要过敏原蛋白的检测奠定了基础。     

基于小鼠肝炎病毒研究遗传工程小鼠隔离检疫设计

目的以小鼠肝炎病毒(MHV)为例,研究两种常用小鼠感染MHV后粪便中病毒核酸检测量与血清特异性抗体的变化,探讨实验动物病原微生物感染的检测设计。方法用MHV病毒核酸检测阳性的脏垫料持续饲养C57BL/6和BALB/c小鼠(n=20) 28 d,进行脏垫料接触感染。之后所有小鼠使用无菌垫料进行单笼饲养,每周收集新鲜粪便和血清样本,经Taqman荧光定量PCR(qPCR)和ELISA法检测后进行统计分析。结果对于BALB/c小鼠,采用qPCR法检测时,在实验第21天即有阳性检出(阳性率20%),第28天阳性检出率达到最高,为80%,第42天阳性检出率为50%,至第56天无阳性检出。血清ELISA检测发现,实验第42天才有MHV特异性抗体检出(阳性率为50%)。对于C57BL/6小鼠,采用qPCR法检测时,在第28天和第42天分别从20%小鼠粪便中检出MHV。而采用ELISA法在整个实验期均未检出特异性阳性抗体。结论在隔离检疫和常规病原检测中,建议选用BALB/c小鼠作为哨兵鼠,替代C57BL/6小鼠。由于qPCR法具有早检出和更高检出率的优点,建议在隔离检疫早期采用基于分子生物学的粪样核酸检测法替代ELISA法。     

实验大鼠仙台病毒ELISA检测试剂盒的研制及其初步应用

报导实验大鼠仙台病毒血清抗体IgG ELISA检测试剂盒的研制过程及其初步应用。在ELISA反应条件及试剂盒的实用性方面进行了研究,首次进行了试剂盒的阴性对照血清的标化;并且同其它血清学方法进行了比较。结果表明,试剂盒的敏感性高、特异性强、重复性良好,操作简便,适用于常规检测。通过对京津地区六个单位的实验大鼠仙台病毒抗体检测发现,在普通大鼠中,阳性率高达81％:在清洁大鼠中,未发现仙台病毒的感染。     

双抗体夹心ELISA检测禽流感病毒方法的初步建立

用饱和硫酸铵初步纯化的兔抗AIV-H9高免血清中的IgG作为包被抗体,利用抗AIV-NP-7B4单抗作为ELISA的第二抗体,建立了检测禽流感病毒(AIV)抗原的双抗体夹心ELISA方法. 经方阵滴定试验测定反应的最佳工作条件为:兔抗AIV-H9高免血清IgG包被稀释度为1: 8 000(浓度为3.531 ug/mL),抗AIV-NP-7B4单抗腹水最佳使用稀释度为1: 800,酶标二抗的工作浓度为1: 4 000. 与其他禽易感病毒(NDV、IBV、EDS-76V)等均没有交叉反应. 结果表明,本方法具有很高的特异性.     

弓形虫快速鉴定及国内实验动物感染调查

目的 建立弓形虫快速鉴定方法,进行国内实验动物感染调查,为国家标准的修订提供参考依据。方法 选择2012年12月至2016年12月期间全国60个不同厂家的12 394只实验动物（包括：猴290只、小型猪425只、犬579只、兔1 234只、地鼠372只、豚鼠1 363只、大鼠987只、小鼠7 144只）作为调查对象。采用ELISA方法检测动物血清中弓形虫抗体IgG和循环抗原CAg。利用PCR技术鉴定弓形虫p30基因。应用直接镜检实时动态显微视屏摄录技术识别弓形虫虫体。结果 用ELISA从12 394份动物血清中检出4份弓形虫抗体IgG阳性。在这4份抗体IgG阳性样本中都发现了弓形虫虫体和DNA。通过PCR扩增p30基因的分子特性证明了样本中弓形虫病原体的存在。通过直接镜检实时动态显微视屏摄录技术,在这些样本中发现了弓形虫速殖子。2012年12月至2016年12月期间,对12 394只实验动物调查结果显示,弓形虫感染率为0.03%（4/12 394）。结论 ELISA、PCR、直接镜检实时动态显微视屏摄录技术相结合可完成实验动物的弓形虫检验工作。国内实验动物中存在弓形虫感染。因此,建议设计合理的筛查程序用于防止动物传播的弓形虫病。有必要开发新的诊断工具,特别是快检技术用于这一重要人兽共患病的未来研究。     

乙型脑炎病毒(JEV)单克隆抗体的制备及初步应用

目的制备乙型脑炎病毒(JEV)单克隆抗体,应用于猪源性生物制品中JEV的检测。方法提纯病毒抗原,免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,经间接ELISA方法筛选和有限稀释法三次克隆获得4株杂交瘤细胞,并应用琼脂扩散、酶联免疫吸附试验和免疫荧光方法进行抗体鉴定和样品检测。结果获得4株稳定分泌JEV单克隆抗体的杂交瘤细胞株G10、F4、C10、A5,免疫荧光抗体实验证实是特异的抗JEV抗体,其免疫球蛋白亚类G10和F4为IgG1,A5为IgM,C10未鉴定出其亚类。G10和F4腹水效价为105以上,C10和A5腹水效价为102以上。结论成功制备了抗JEV单克隆抗体,建立了以单抗介导的间接ELISA和间接IFA检测方法,并应用于猪源性生物制品中JEV的检测。     

博来霉素和内毒素诱导两种品系小鼠肺纤维化模型的比较研究

目的 通过比较博来霉素和内毒素诱导ICR、C57BL/6两个品系小鼠的肺纤维化程度,从而建立合适的小鼠肺纤维化模型。方法 分别将ICR、C57BL/6两个品系小鼠随机分为对照组、博来霉素组、内毒素组。博来霉素组向气管注射博来霉素(5 mg/kg体质量),内毒素组尾静脉注射内毒素(40 EU/kg体质量),对照组气管注射等量生理盐水。两个品系的对照组、博来霉素组、内毒素组分别于造模后第7、14、28天各处死8只,观察小鼠一般情况,测量小鼠肺系数;采用HE染色观察肺组织病理学变化; ELISA法检测肺组织中羟脯氨酸的含量。结果 与对照组相比,两个品系的博来霉素组和内毒素组的肺系数、肺组织羟脯氨酸含量均不同程度增加,有显著性差异(P0. 05)。结论 C57BL/6小鼠对博来霉素和内毒素更敏感。博来霉素、内毒素均能够制备小鼠急性肺损伤肺纤维化模型。     

实验大鼠肺支原体ELISA检测方法的建立

报告了实验大鼠肺支原体感染ELISA检测方法的研究。抗原包被量在0.5μg/ml,酶结合物1:16000稀释时,P/N值最大。波长在492时O.D值随抗原和抗体浓度不同而呈现有规律的变化。阳性血清稀释至1:1280时,P/N值仍在阳性范围之内。与常规的分离培养方法相比较,ELISA的阳性检出率高,且阳性血清的ELISA阻断率均大于50％。重复测定,实验结果的再现性好。以上结果说明所建立的ELISA方法,其敏感性、特异性和重复性均好。在所检测的130只普通级大鼠中,抗体阳性率达91％。另外还发现在实验大鼠中还存在关节支原体的感染,且一般与肺支原体以混合感染的形式存在。在清洁级大鼠中未见这两种支原体的感染。     

早期单核细胞增高对儿童肺炎支原体感染的诊断价值

目的 探讨早期单核细胞数增高与肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae,MP)感染的相关性,为MP肺炎早期诊治提供临床依据.方法 选取符合肺炎诊断标准住院患者513例,根据外周血单核细胞数分为外周血单核细胞增高组和外周血单核细胞正常组,采用金标法检测MP抗体(IgG、IgM),统计各组阳性病例数.在外周血单核细胞增高组中统计组内阳性病例数,并统计支原体感染阳性病例数在不同季节的分布情况.结果 早期外周血单核细胞增高组支原体抗体检测阳性率明显高于外周血单核细胞正常组(χ2=31.060,P<0.05),以冬春季患病率最高(χ2=9.973,P<0.05),且在早期外周血单核细胞增高组中支原体抗体阳性率高达57.8％,而单核细胞正常组支原体感染阳性率仅为29.5％.结论 儿童肺炎患者如早期单核细胞增高应高度警惕MP感染的可能,尤其在冬春季,需及时检测MP抗体,以指导早期临床诊断和治疗.     

抗沙门氏菌O4抗原单克隆抗体的研制及鉴定

制备抗沙门氏菌O4抗原单克隆抗体并鉴定其特性.用加热灭活的乙型副伤寒沙门氏菌免疫BALB/c小鼠,通过细胞融合方法建立分泌抗体的杂交瘤细胞株.用包被沙门氏菌全菌和纯化的乙型副伤寒沙门氏菌LPS的间接ELISA法筛选杂交瘤细胞和鉴定抗体.其中3株杂交瘤细胞分泌的抗体初步判断为针对O4抗原的抗体,分别命名为1E12、2D5和4C2,这3株抗体与肠道正常细菌及常见的致病性细菌无交叉反应;单克隆抗体的免疫球蛋白类型分别为IgG1κ和IgMκ.获得的单克隆抗体具有较高的特异性,有可能用于B群沙门氏菌免疫学检测方法的建立.