人神经节苷脂诱导分化相关蛋白cDNA的克隆、染色体定位和初步功能研究

通过构建,筛选人18周胎脑cDNA文库,克隆到一条与神经节苷脂诱导分化相关蛋白高度同源的新基因,经HUGO／GDB人类基因命名委员会的同意命名为GDAP1L1,进行新基因的全序列测定,RH定位分析,Blast分析及生物学信息分析,Northern杂交提示GDAP1L1基因在胎脑中高度表达,但在成人脑组织中低表达,新的神经节甙脂诱导分化相关蛋白的表达和功能研究初步提示：全长新神经节苷脂诱导分化相关基因核苷酸序列长1163bp,RH定位分析新基因定位在染色体20q12区,BLASTN,BLASTP,TBLASTN分析新基因的蛋白质序列与人和鼠“神经节甘脂诱导分化相关蛋白1”有58％的同源性,而与人的另一条“类似神经节苷脂诱导分化相关蛋白1”的部分蛋白序列（47－253aa)的同源性达100％,新基因蛋白在3,5端分别多出46aa和114aa的长度,生物学住处分析证实神经节苷脂诱导分化相关基因与神经营养与细胞凋亡有密切关系,全长新神经节苷脂诱导分化相关基因是一个神经营养与发育及细胞周期调控,信号传导有关的基因,可能在肿瘤的发生中具有重要作用,其功能的进一步研究将为肿瘤机理的阐明提供思路。     

毛囊特异表达载体pCDsR-UI的构建以及绒山羊胎儿成纤维细胞的体外转染和筛选

构建IGF1基因的毛囊特异表达载体,可为今后通过体细胞核移植技术建立转基因克隆绒山羊准备核供体细胞.将绵羊IGF1 cDNA序列,连接到含有UHS启动子序列的克隆载体p19TU的SalI、SphI位点,获得过渡质粒载体p19TUI;pCDsRed2和过渡质粒载体分别经酶切和连接构成表达载体pCDsR-UI.以组织块贴附法分离和培养绒山羊胎儿成纤维细胞,外源性表达载体以脂质体方法转染所培养的第2代成纤维细胞,DMEM/F12+ 10％ FBS、37℃5％CO2中培养,经添加G418筛选,获得了稳定表达红色荧光蛋白的细胞克隆,经特异性PCR鉴定证实外源基因已经整合在细胞基因组中.转基因前后分析细胞生长曲线和染色体核型证明转基因细胞的生长状态良好、各项参数正常.     

人可溶性增殖诱导配体在大肠杆菌中的表达、纯化及生物活性鉴定

人增殖诱导配体在促肿瘤细胞增殖以及自身免疫性疾病中具有重要的作用．从GenBank中查出人APRIL的序列号（AR）46888），根据其胞外可溶部分序列设计引物，采用RT-PCR技术从健康人新鲜血液单核细胞（PBMCs）总RNA中克隆出人sAPRIL cDNA，将该cDNA克隆人原核表达载体pET30a，经IPTG诱导后在大肠杆菌BL21（DE3）中获得高效表达，经SDS—PAGE后在17000左右有一明显的表达条带，该蛋白主要以包涵体形式存在，表达量达45％左右，将包涵体蛋白变复性后进行细胞生物活性实验，为进一步研究其临床应用奠定了基础．     

Cu~(2+)、前体对红豆杉细胞生长及产生10-Deacetyl Baccatin的影响

目的:研究前体和Cu2+诱导子对云南红豆杉细胞生长和产生10-去乙酰巴卡亭Ⅲ的影响.方法:在培养12d后分别向培养基中添加不同浓度的乙酸钠、苯甲酸钠两种前体和CuSO4诱导子,经过培养对云南红豆杉细胞生长情况进行统计,用HPLC测定细胞中10-去乙酰巴卡亭Ⅲ的含量.结果:培养基中添加0.1mmol/L乙酸钠和0.1nunol/L苯钾酸钠,10-去乙酰巴卡亭Ⅲ含量是不添加时的1.8倍和2.8倍,含量分别为0.079 88%、0.08291%;B5培养基中添加0.1mg/L硫酸铜时,10-去乙酰巴卡亭Ⅲ含量是B5培养基标准含量的2.2倍.结论:确定了云南红豆杉细胞悬浮培养过程中B5培养基添加乙酸钠、苯甲酸钠和硫酸铜的最佳浓度,表明适宜浓度前体和Cu2+诱导子对10-去乙酰巴卡亭Ⅲ合成与释放有显著影响.     

酵母诱导子对肉苁蓉细胞悬浮培养影响的研究

目的:以酵母诱导子对肉苁蓉细胞悬浮培养及其抗氧化活性成分苯乙醇苷的合成动力学的影响进行研究.方法:从肉苁蓉种子诱导出愈伤组织,在MS培养基上进行细胞悬浮培养.首先考察肉苁蓉细胞生长和苯乙醇苷合成的动力学,在此基础上就酵母诱导子对细胞生长和苯乙醇苷合成的影响进行研究.结果:肉苁蓉悬浮细胞培养经过三天的延滞期后进入对数生长期,21天后细胞生长进入稳定期,最大生物量和苯乙醇苷产量分别达到8.03g DW/L和97 mg/L.在对数生长期后期,即培养的第18天加入0.8 mL/瓶浓度的酵母诱导子,诱导三天的效果最好,苯乙醇苷的最高产量为237.7 mg/L,为对照的239%.结论:合适浓度的酵母诱导子不但能够有效提高肉苁蓉细胞悬浮培养液中的苯乙醇苷含量,同时对细胞生长也具有促进作用.     

藏红花的叶鞘培养与藏红花素类物质的合成

为克服人工栽培藏红花的困难,采取细胞培养生产藏红花素类药物是重要的生产途径之一。通过藏红花的叶鞘组织脱分化培养可以诱导出愈伤组织。这些愈伤组织呈浅黄色、黄色或橘黄色,含有与藏红花柱头基本相同的藏红花素类物质。以ＭＳ作为培养基、添加０．５ ｍ ｇ／Ｌ的细胞分裂素（ＢＡ）和２．０ ｍ ｇ／Ｌ的生长素（ＩＡＡ）,黑暗条件和２０℃培养温度有利于愈伤组织的形成,并增殖了５ 倍以上。实验证明２０℃有利于藏红花素的合成。     

PPAR γ配体结合域的表达、纯化和鉴定

提取MCF-7乳腺癌细胞的总RNA,通过RT-PCR技术扩增出hPPAR γ/LBD cDNA,并克隆于载体pGEX-1γ上,测序表明该序列与已报道序列相同,将其转入BL21(DE3)大肠杆菌中,IPTG诱导表达GST-hPPAR γ/LBD,在不同培养温度或IPTG诱导浓度下,GST-hPPAR γ/LBD以可溶或包涵体形式存在,表达产物经谷胱甘肽Sepharose 4B亲和层析纯化,可被抗hPPARγ多克隆抗体特异识别,并与其天然配体发生特异性结合.     

用小鼠单个MⅡ卵和2-细胞期胚胎构建cDNA文库

阶段特异性cDNA文库的构建和筛选是一种分离和克隆早期胚胎特异表达基因的有效方法.本研究利用小鼠单个MⅡ卵母细胞及发育至2-细胞的胚胎分别构建了cDNA文库.滴度分别为:6.5×106、7.2×107,基因片段平均长度为250-1500bp并用β-actin验证了文库的可靠性.这种利用单胚胎构建cDNA文库的方法,不仅解决了胚胎研究材料受限制的问题,而且在材料的发育时间上更加精确,更能反映胚胎发育的规律,是研究早期胚胎发育基因表达以及克隆胚胎发育相关基因的一种有效手段.     

HER-2基因特异性核酶设计与体外转录载体构建

目的 构建人表皮生长因子受体-2(HER-2)特异性核酶(ribozyme,RZ)及其底物基因的体外转录载体.方法 设计合成RZ基因,将该RZ克隆到真核表达载体pcDNA3.1( )中,测序鉴定.应用Trizol试剂提取MDA-MB-453细胞总RNA,RT-PCR扩增靶基因HER-2 cDNA片段,同样插入载体pcDNA3.1( ),测序鉴定.结果 经DNA测序分别证实合成的RZ基因序列和通过RT-PCR扩增的HER-2 cDNA序列克隆入pcDNA3.1( )中.结论 构建HER-2特异性RZ真核表达载体及含有HER-2 cDNA的载体,有助于进一步研究RZ对靶基因切割作用及雌激素受体阴性乳腺癌细胞MDA-MB-453中HER-2信号转导通路.     

固液两步法的藏红花素生物合成

为提高现代生物技术生产藏红花素的产率和效率,该研究采取固液两步培养法将在固体培养基中获得的藏红花愈伤组织转移到液体培养基中进行生物合成,结果显示生物反应器比摇瓶培养更有利于生物量的积累,也更有利于2号藏红花素的合成。碳源、氮源和磷酸的消耗与藏红花素的合成密切相关。采取固液两步培养法可以有效解决藏红花素合成与藏红花素抑制细胞快速增殖的相互矛盾。该结果对具有抗癌作用的藏红花素产业化有重要意义。     

Crocin Synthesis Mechanism in Crocus sativus

Saffron （Crocus sativus） cells can synthesize crocin, crocetin digentiobiosyl ester, in suspension cultures. The crocin family biosynthesis mechanism was studied using high pressure liquid chromatography （HPLC） to determinate the glucosyltransferase activity and to develop a method for synthesizing medicine from saffron cells. Previous studies indicated that two glucosyltransferases might be involved in the formation of crocetin glucosyl- and gentiobiosyl-esters. GTasel formed an ester bond between crocetin carboxyl groups and glucose moieties while GTase2 catalyzed the formation of glucosidic bonds with glucosyl ester groups at both ends of the molecule. These enzymes can catalyze the formation of crocetin glucosides in vitro. GTasel activity is higher during the first four days of crocin glucosides biosynthesis, but decreases after four days. The formation and accumulation of crocin increase during the first six days and stabilized on the eighth day.     

Monitoring gene expression by cDNA array

A new method designated cDNA array was developed by hybridization of quantitatively arrayed DNA samples isolated randomly from a cDNA library with probes reverse-transcribed from mRNAs of different sources or treatments. The gene expression patterns of 1 000 randomly chosen clones from an Arabidopsis library were analyzed with green seedlings versus suspension cells and seedlings irradiated under UV light. Northern blot and sequence analysis of some differentially expressed clones confirmed the results revealed by cDNA array, indicating that this method is efficient and reliable to monitor gene expression.     

大规模原位杂交筛选爪蟾发育调控基因

应用半自动化的系统表达筛选,研究了2400个爪蟾EST克隆在胚胎发育中的表达模式,从筛选出的624个分化表达克隆中,发现了协同表达组的新成员及调控爪蟾体节形成的新基因.     

用抑制差减杂交技术分离烯丙异噻唑诱导水稻特异表达的基因

烯丙异噻唑(PBZ)处理水稻根能使其产生对稻瘟病的系统获得性抗性,因此在东南亚稻区被广泛用于防治稻瘟病,然而关于其作用的分子机理还知之甚少．运用抑制差减杂交技术,试图通过分离鉴定受PBZ诱导调控的关键基因,探索其作用的分子机理．以PBZ处理后的水稻叶片cDNA为目标群体(tester),以未处理水稻叶片cDNA为对照群体(driver),用经过对照cDNA差减的、烯丙异噻唑处理的cDNA群体构建了一个含260个重组子的差减文库．通过差示筛选鉴定出了26个。PBZ诱导水稻特异表达和增强表达的候选克隆．对26个cDNA克隆进行了双向测序和同源性比较,发现其中3个克隆：rJAB1,rTAB2和蛋白磷酸酯酶2Aδ调节亚基同型物基因,位于抗病相关信号转导途径上,它们与哺乳动物和人类免疫途径上的信号因子有明显相似之处,因此推断可能与诱导抗性有关．另外8个克隆与已知基因同源性为70％～99％．经Northern杂交分析,其中rJAB1(编码c-jun激活区结合蛋白1)受烯丙异噻唑和稻瘟菌诱导表达;膜糖蛋白同源基因及肌动蛋白(actin)α1受烯丙异噻唑诱导表达,部分克隆为低丰度转录本．     

Effects of Culture Conditions, Carbon Source and Regulators on Saffron Callus Growth and Crocin Accumulation in the Callus

IntroductionSaffron is a precious herbal medicine.In recentyears,scientists have found that the mostimportant secondary metabolites in saffron pistils,such as crocetin,crocin,safranal and picrocrocin,have anticancer effects,especially on leukemia,papilloma,squamous cell carcinoma and softtissuesarcoma[1,2 ] .Saffron inhibits the gene expressionand DNA and RNA synthesis of cancer cells at themolecular level and is also a potent inhibitor oftumor promotion induced by 1 2 - o-tetradecanoylphorb…     

Interferon inhibits transformation by murine sarcoma viruses before integration of provirus

Neoplastic transformation by C-type retroviruses requires synthesis of a DNA copy (the provirus) of the RNA genome and its integration into the host cell DNA. We have previously shown that interferon (IFN) can stably prevent transformation of murine fibroblasts by the Kirsten strain of murine sarcoma virus (KiMSV), a murine leukaemia virus (MLV). A series of cell clones (IFN clones), isolated in the presence of IFN (10(4) U ml-1) from cultures of NIH-3T3 cells which had been treated with IFN, and then infected with KiMSV (KiMLV) in conditions where every cell was infected, were shown to be phenotypically untransformed. These untransformed cells did not produce virus or contain rescuable KiMSV. However, cells isolated using an identical procedure, but in the absence of IFN, were uniformly transformed and all produced KiMSV (KiMLV) or contained rescuable KiMSV. It was concluded that IFN either prevents synthesis or integration of the provirus, or else that in the presence of IFN the provirus is integrated such that it is not expressed. We now show that five representative clones contain no detectable KiMSV proviral DNA, and also that the initial stages of infection by KiMSV (KiMLV) are inhibited by IFN treatment. IFN seems to act before integration, preventing either the synthesis or the integration of proviral DNA.     

Des(rhamnosyl) verbascoside抗HBV作用的定量蛋白质组学研究

为探究des(rhamnosyl) verbascoside体外抗乙型肝炎病毒(HBV)的活性作用和机制,本研究以des(rhamnosyl) verbascoside为实验药物对HepG2.2.15细胞进行干预,实验分为药物干预组和对照组,采用串联质谱标签(Tandem Mass Tag, TMT)蛋白质组学方法对提取的总蛋白进行分析。结果表明,共筛选得到300个差异表达蛋白,其中有109个上调蛋白,191个下调蛋白。基因本体论(Gene Ontology, GO)分析结果显示,差异蛋白主要参与DNA复制(DNA replication)、鞘糖脂代谢(Glycosphingolipid metabolic process)、细胞增殖(Cell proliferation)、寡糖分解代谢(Oligosaccharide catabolic process)等生物学过程,以及DNA聚合酶活性(DNA polymerase activity)、丝氨酸型羧肽酶活性(Serine-type carboxypeptidase activity)、DNA引物酶活性(DNA primase acti...     

Gene expression profiles of the developing human retina

Retinaplaysimportantrolesintheperception,proc-essandtransmissionofvisualsignalsandthefunctionsoftheretinadepend,toalargeextent,onitshighlyorganizedstructure.During3—6weeksinhumanembryogenesis,theneuralectodermgrowsoutfromthediencephalonstoformtheopticvesicleandtheninvaginatestoformtheopticcup.Theouterlayeroftheopticcupbecomesthenon-neuralretinalpigmentepithelium(RPE)andtheinnerlayerbecomestheneuralretina.RPEcellsproliferateslowlyandappeardifferentiatedandpigmentedasearlyas6—8weeksandremain…     

美国山核桃不定根形成过程中相关蛋白质 的鉴定及功能分析

美国山核桃是扦插后极难生根的树种,为研究其不定根生根机制,利用MALDI-TOF-MS技术对美国山核桃不定根发育关键时期的差异蛋白进行鉴定分析,发现了48个表达相对差异的蛋白点,选择其中18个差异蛋白进行肽质谱指纹分析并进行同源性比较。结果表明,美国山核桃不定根形成的生理过程中产生了差异蛋白质,其中包括了能量代谢相关蛋白、逆境胁迫相关蛋白和信号传递相关蛋白等差异蛋白。分析可知:能量代谢相关蛋白有ATP合成相关酶类、光合作用相关蛋白及烯醇化酶等; 逆境胁迫相关蛋白与热激蛋白同源; 信号传递相关蛋白主要为细胞色素酶类和血红结合蛋白。