猪圆环病毒2型与猪繁殖与呼吸综合征病毒混合感染的诊断

2007年4月,龙岩市某存栏母猪达200头的规模化猪场,保育栏仔猪出现体温升高,呼吸困难,咳嗽,耳、鼻端、四肢及下腹部皮肤发紫,经临床剖检及病理观察大体判断为圆环病毒2型与猪繁殖与呼吸综合征病毒混合感染,为进一步确诊,进行了实验室诊断.分别设计了PCv2及PRRSV的扩增引物,结果从病例中扩增出相应的产物.通过临床、病理诊断及实验室检测.确诊为猪繁殖与呼吸综合征病毒与圆环病毒2型混合感染.     

高致病性猪蓝耳病防控知识

猪蓝耳病，又称猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS），是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起猪的一种接触性传染病。高致病性猪蓝耳病是以变异的猪蓝耳病病毒株为主要病原，其它多种病原混合感染发生的一种急性传染病。[第一段]     

科技期刊亮点

<正>抗体免疫选择压影响猪繁殖与呼吸综合征病毒变异最新研究发现,抗体免疫选择压会影响猪的繁殖与呼吸综合症病毒的变异。为了确定抗体选择压对PRRSV不同基因变异的影响,山东农     

Marc-145细胞库的建立及其生物学特性研究

从中国典型培养物保藏中心(CCTCC)引进Marc-145细胞,建立了原始细胞库、主细胞库和工作细胞库,并对工作细胞库的细胞复苏后进行了活力、形态、生长特性、微生物污染、核型、乳酸脱氢酶同工酶和对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)敏感性等特性进行了鉴定.结果显示,Marc-145细胞为上皮型细胞,生长状态良好,生长曲线呈"S"型,最大增殖浓度为4.71×105/mL,倍增时间为26.1h,细菌、真菌、支原体和红细胞吸附检测均为阴性,染色体核型为2n=60,对PRRSV敏感.建立的细胞,为开展猪繁殖与呼吸综合征病毒及其疫苗研究提供了细胞资源.     

猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒RT-PCR检测方法的建立

设计了一对特异性引物,对16头临床症状、病理变化和ELISA检测呈阳性的猪繁殖与呼吸障碍综合征疑似病例的肺脏、脾脏和淋巴结以及种公猪的精液进行了RT-PCR扩增。结果显示16头样品的相应组织及精液都扩增出特异性基因片段,阳性符合率为100%,8头猪繁殖与呼吸障碍综合征血清ELISA检测为阴性的对照样品中有2头扩增出阳性片段,检出率为25%。RT-PCR检测方法的建立为猪繁殖与呼吸障碍综合征的准确诊断提供了技术手段。     

金银花枝叶抗猪蓝耳病毒有效活性部位化学成分的分离与鉴定

通过测定金银花枝叶提取物对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染的Marc-145细胞的最小保护浓度和对病毒感染滴度的影响来评价其体外抗猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的活性.结果显示,金银花枝叶95%乙醇提取物经D101型大孔树脂吸附后,得到的60%乙醇/水洗脱部位对PRRSV感染细胞的最小保护浓度为6.25μg/mL,6.25μg/mL 60%乙醇/水洗脱部位使PRRSV病毒滴度从105.8 TCID50降低至100.3 TCID50左右,即60%乙醇/水洗脱部位具有良好的体外抗PRRSV活性.利用溶剂提取法、正相硅胶柱层析、Sephadex LH-20和RP-HPLC等色谱法,从该有效活性部位中分离得到了5个化合物,通过理化性质和1 H NMR、13 C NMR等光谱数据鉴定化合物分别为Dihydrodehydrodiconiferyl alcohol 4′-O-β-D-glucoside(1),Apigenin 5-O-β-D-glu-copyranoside(2),Secoxyloganin(3),Benzyl alcohol O-(6′-O-β-D-xylopyranosyl)-β-D-glucopyr-anoside(4)和Sweroside(5).     

猪繁殖与呼吸综合征病毒N基因原核表达产物的检测应用

利用猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白基因的原核表达产物,分别建立了检测猪繁殖与呼吸综合征抗体的间接ELISA方法及乳胶凝集试验．对200份血清样品分别应用建立的间接ELISA方法和乳胶凝集试验,及由IDEXX公司生产的EUSA检测试剂盒进行抗体检测,结果显示,乳胶凝集试验及间接ELISA方法与IDEXX公司试剂盒相比,检出符合率分别达78％和91％．建立的乳胶凝集试验还需改进,而N蛋白-ELISA方法具有良好的特异性和敏感性,是一种有应用前景的检测方法．     

II型猪圆环病毒ORF2基因的原核表达与初步应用

II型猪圆环病毒(PCV2)是引起断奶仔猪多系统衰竭综合症(PMWS)的重要病原.本研究用PCR以构建的PCV2 ORF2重组质粒pBS-T-ORF2为模板,扩增截短的ORF2(tORF2)基因亚克隆至表达载体pGEX-4T-3,构建重组表达质粒pGEX-tORF2并转化大肠杆菌BL21(DE3).经SDS-PAGE及Western blot鉴定,成功表达了谷胱甘肽S转移酶(GST)融合的tORF2,重组蛋白分子量约为45ku,表达量约为菌体总蛋白的20%,重组蛋白具有良好的免疫学活性.用tORF2重组蛋白对20份临床猪繁殖与呼吸障碍综合征(PRRS)阳性猪血清进行Western blot检测,有4份(20%)血清显示PCV2抗体阳性,说明PCV2与PRRSV存在共同感染现象.本研究初步证明表达的tORF2重组融合蛋白可以应用于临床检测.     

Ⅱ型猪圆环病毒ORP2基因的原核表达与初步应用

Ⅱ型猪圆环病毒（PCV2）是引起断奶仔猪多系统衰竭综合症（PMWS）的重要病原．本研究用PCR以构建的PCV2 ORF2重组质粒pBS-T-ORP2为模板，扩增截短的ORP2（tORF2）基因亚克隆至表达载体pGEX-4T-3，构建重组表达质粒pGEX-tORP2并转化大肠杆菌BL21（DE3）．经SDS-PAGE及Western blot鉴定，成功表达了谷胱甘肽S转移酶（GST）融合的tORP2，重组蛋白分子量约为45ku，表达量约为菌体总蛋白的20％，重组蛋白具有良好的免疫学活性．用tORP2重组蛋白对20份临床猪繁殖与呼吸障碍综合征（PRRS）阳性猪血清进行Western blot检测，有4份（20％）血清显示PCV2抗体阳性，说明PCV2与PRRSV存在共同感染现象．本研究初步证明表达的tORV2重组融合蛋白可以应用于临床检测．     

猪繁殖与呼吸综合征病毒SCM株ORF5基因抗原表位克隆表达及其免疫性研究

为鉴定猪繁殖与呼吸综合征病毒SCM株(PRRSV-SCM)囊膜糖蛋白GP5的免疫原性,利用RT-PCR方法从PRRSVSCM株ORF5中扩增大小为231bp的目的基因并构建表达载体PET32-GP5,将其转入大肠埃希菌Rosetta,运用IPTG通过条件优化诱导其表达.检测结果表明:最佳诱导条件为IPTG浓度1mmol/L在37℃下作用5h,表达大小约28kU的融合蛋白.通过Western-blot和间接酶联免疫吸附试验检测表达蛋白,结果显示该原核表达的融合蛋白可与PRRSV阳性血清发生反应,证明该蛋白具有免疫反应性.这为将来研制检测试剂盒以及后续研究PRRSV亚单位疫苗提供了重要依据.     

高致病性PRRSV ORF6和ORF7基因的遗传变异分析

从GenBank中选取8株国内报道的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒株,应用DNAStar软件对其ORF6、ORF7基因序列进行分析,与VR-2332株、LV株、国内及周边国家分离株进行核苷酸和推导氨基酸同源性比较,并绘制系统进化树.结果表明,高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒株的ORF6、ORF7核苷酸与VR-2332株的同源性为95.1%-95.4%、93.8%-94.1%,与欧洲型（LV）的同源性为69.4%-69.6%、67.9%-68.5%;ORF6、ORF7推导氨基酸与VR-2332株的同源性为97.7%、94.4%-95.2%,与欧洲型（LV）的同源性为80.0%-80.6%、65.3%-66.1%.系统进化树表明,8株高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒株仍属于美洲型.说明猪繁殖与呼吸综合征病毒不断变异的现今,ORF6和ORF7基因依然高度保守.     

猪繁殖与呼吸综合症的血清学调查

猪繁殖与呼吸综合症(PRRS)是由PRRS病毒引起的一种传染病.文章报告了我市部分县市猪繁殖与呼吸综合症的血清学调查情况,发现阳性率为8.97%,为本地该病的防治提供了依据.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白的表达与纯化

根据GenBank报道的PRRSV VR2332基因序列设计引物,经RT - PCR扩增,得到大小约为390 bp的阳性产物;利用Bam H Ⅰ,EcoR Ⅰ位点将N蛋白基因片段克隆到pET-28a载体,构建原核重组表达质粒pET-N,转化BL21(DE3)并进行SDS-PAGE,Western blot分析.结果表明:克隆的N蛋白基因与GenBank报道的VR2332基因同源性为93.83％;重组菌株经IPTG诱导后,N蛋白基因得到了高效表达;经筛选得到最佳诱导条件,即1 mmol/L IPTG诱导6h,蛋白表达量可达菌体蛋白总量的52.635％,SDS-PAGE后切胶回收可得到纯化的N蛋白,为进一步制备免疫胶体金试纸条或ELISA试剂盒提供基础.     

Fluorescent immunosensor based on fluorescence resonance energy transfer between CdSe/ZnS quantum dots and Au nanorods for PRRSV detection

An ultrasensitive and selective sandwich-type fluorescent immunosensor based on fluorescence resonance energy transfer (FRET) between CdSe/ZnS quantum dots (QDs) and Au nanorods (AuNRs) was developed for the rapid detection of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV). Modified CdSe/ZnS QDs and AuNRs were bioconjugated with primary antibodies M and GP5, respectively. When the target antigen was present, a well-known sandwich-type form CdSe/ZnS QDs-M antibody-antigen-GP5 antibody-AuNRs was produced, and thus reducing the distance between the QDs and NRs. As a result, FRET occurred and the fluorescence intensity of CdSe/ZnS QDs decreased, and this decrease was used to determine the antigen concentration. Ultrasensitive detection of PRRSV at low concentrations in swine serum was achieved with a limit of detection of 0.55 TCID₅₀/mL and a linear detection range of 10¹–3.5 ?× ?10⁴ TCID₅₀/mL. Therefore, the fluorescent immunosensor is selective and highly sensitive; specifically, it can detect PRRSV at low concentrations in swine serum over a large concentration range. This proposed detection method can facilitate the development of high-performance fluorescent immunosensors for the detection of PRRSV and other antigens.     

两类猪ADP-核糖基化因子的克隆分析与原核表达载体构建

哺乳动物小G结合蛋白——二磷酸腺苷-核糖基化因子(ADP-ribosylation factors,Arfs)除在囊泡运输、细胞骨架重排和调节细胞吞噬等方面起重要作用外,还与病毒的感染有关.前期研究发现猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)感染早期ARFs基因表达明显上调,然而在猪只中ARFs与PRRSV的感染至今知之甚少.本研究中,猪ARF1和ARF4分别被克隆,序列分析发现:ARF1包含一个长度为546bp的开放阅读框(Open reading frame,ORF),预测编码181个氨基酸,理论分子质量为20.70kDa,pI为6.62;ARF4包含一个长度为543bp的开放阅读框,预测编码180个氨基酸,理论分子质量为20.50kDa,pI为5.46.蛋白序列结构分析显示猪ARF1和ARF4蛋白含有典型的p loop,switch区,interswitch区和N端疏水区的Hasp,在第二位都含有可被肉豆蔻酰基化的甘氨酸.猪ARF1和ARF4的原核表达载体也被构建,为进一步研究其在PRRSV感染过程中的调控提供基础.     

快速检测猪瘟兔化弱毒疫苗株的TaqMan荧光定量RT-PCR方法的建立

在猪瘟病毒兔化弱毒疫苗株（HCLV）的5′端非编码区设计一对引物和一条TaqMan探针,通过优化反应条件,成功建立了特异性检测HCLV的荧光定量RT-PCR方法．结果表明：该方法检测的最低拷贝数为45拷贝／μL,灵敏度比普通PCR方法高10^4倍,在较广的范围内（4．5×10^1-4．5×10^6拷贝／μL）有良好的线性关系（r=0．994）;分别以乙型脑炎病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、副猪嗜血杆菌、牛病毒性腹泻,黏膜病病毒作为模板进行TaqMan RT-PCR扩增,未出现阳性信号：4个不同浓度标准品组内试验变异系数为1．90％～5．82％,组间试验变异系数为4．02％～5．69％：HCLV3个cDNA样本组内试验变异系数为3．72％～4．93％;组间试验变异系数为2．99％～4．02％．该方法具有很好的灵敏性、特异性及稳定性,能够快速准确定量检测HCLV,为HCLV疫苗的研制、猪瘟病毒分子生物学等方面研究提供了一种快捷有效的工具．     

冀南地区PRRSV的流行病学调查及灭活苗的制备

为预防和控制猪繁殖与呼吸综合征在我国广泛流行,减少对养猪业带来的巨大经济损失,调查了2006年以来冀南地区16个县市猪繁殖与呼吸综合征的发病情况、流行规律,进行油乳剂灭活疫苗的研究,结果表明,自家制备的油乳剂灭活疫苗不能有效防治高致病性蓝耳病的爆发.     

猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒和猪轮状病毒三重PCR检测方法的建立

通过设计三对引物分别扩增猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)及猪轮状病毒(RV)的特异性基因,建立了一个能对TGEV、PEDV及RV感染鉴别诊断的三重PCR方法。该方法能同时检测TGEV的M基因252bp片段、PEDV的N基因540bp片段及RV的VP7基因412bp片段,而对CSFV、PCV2、PRRSV、PRV等无扩增,其检测TGEV、PEDV及RV的极限为100pg核酸/μL;用该方法对临床收集的26份粪便样品进行检测,结果表明:建立的多重PCR方法具有特异性强,强灵敏度高等特点,能用于临床诊断及流行病学调查。