水稻磷酸酯酶2A基因蛋白的原核表达载体构建、表达和纯化

利用PCR技术,从水稻品种日本晴幼穗cDNA中扩增磷酸酯酶2A的基因ORF片段,并将其克隆入原核表达载体pGEX-6p-1中构建重组质粒pGEX-6p-1-PP-2A,经限制性内切酶酶切鉴定以及测序结果表明成功构建了原核表达载体pGEX-6p-1-PP2A。转化E.coli JM109并通过终浓度为0．4mmol／L的IPTG诱导,表达出39kD的CST-PP2A融合蛋白,并用蛋白亲和层析柱GSTrap FF对表达产物进行纯化,为下一步的研究打下了实验基础。     

绵羊角蛋白关联蛋白KAP6-1基因5''端调控区的分子克隆及测序结果比较

根据绵羊毛囊角蛋白关联蛋白（KAP6-1）基因已知DNA序列设计合成了两个特异性引物，以绵羊基因组DNA为模板，PCR扩增出1042bp的特异性片段，连接到pMD19T载体中获得该片段克隆．经过快速提质粒法筛选、限制性内切酶分析表明该克隆包含所需的目的片段．DNA测序结果也证明该克隆片段与原基因5＇端调控区序列相比具有很高的一致性．研究结果为今后制备转基因克隆动物，在毛囊细胞中特异性表达绒毛生长调控基因奠定了基础．     

绵羊角蛋白关联蛋白KAP6-1基因5′端调控区的分子克隆及测序结果比较

根据绵羊毛囊角蛋白关联蛋白(KAP 6-1)基因已知DNA序列设计合成了两个特异性引物,以绵羊基因组DNA为模板,PCR扩增出1 042 bp的特异性片段,连接到pM D 19T载体中获得该片段克隆.经过快速提质粒法筛选、限制性内切酶分析表明该克隆包含所需的目的片段.DNA测序结果也证明该克隆片段与原基因5′端调控区序列相比具有很高的一致性.研究结果为今后制备转基因克隆动物,在毛囊细胞中特异性表达绒毛生长调控基因奠定了基础.     

猪胆囊收缩素-33基因同向四串联体的构建与表达

根据GenBank上公布的猪胆囊收缩素（choleystokinin, CCK）-33基因的cDNA序列设计特异引物，以猪十二指肠cDNA为模板，PCR扩增得到CCK33基因，并克隆入pMD18-T载体，利用引物中设计的一对同尾酶构建CCK33四串联体，并在大肠杆菌中成功表达.表达纯化蛋白制备抗原，得到多克隆抗体.Western blot显示重组蛋白具有良好的免疫原性.     

人类胰岛素基因的克隆及其真核表达载体的构建

从胎儿胰腺细胞中提取出总RNA作为模板,用特异性引物和RT-PCR法扩增INS基因的cDNA,PCR产物T-A克隆到T载体构建中间重组体pUC57-INS,其测序结果和Genbank公布的序列一致。HindIII和BamHI双酶切pUC57-INS后,将INS基因亚克隆到真核表达载体pEGFP-N1中,经PCR扩增、酶切分析和序列测定后证实了重组表达质粒pEGFP-N1-INS构建成功。这将为转人类胰岛素基因动物模型的建立及人类糖尿病的基因治疗奠定必要的基础。     

采用反向PCR技术优化适合毕赤酵母表达的截短型HPV58型L1基因

目的:探讨利用反向聚合酶链反应(反向PCR)技术根据毕赤酵母偏爱密码子优化截短型人乳头瘤病毒58型(HPV58)L1基因的研究.方法:设计PCR引物扩增截短型HPV58L1目的基因,将其克隆入毕赤酵母分泌表达载体pPICZαC;测序并对目的基因进行序列分析;根据毕赤酵母偏爱密码子利用反向PCR技术设计引物对目的基因进行扩增.结果:扩增了截短型HPV58L1基因并将其克隆入毕赤酵母分泌表达载体pPICZαC中;根据毕赤酵母偏爱密码子优化了截短型HPV58L1基因.结论:成功构建经密码子优化截短型HPV58L1基因的毕赤酵母分泌表达载体pPICZαC-HPV58L1.     

简化的人纤溶酶原饼环区5基因的克隆及其在大肠杆菌中的融合表达

从正常人肝脏组织中提取总RNA,合理设计引物,利用RT-PCR直接得到简化的hPK-5基因.将该基因克隆至原核表达质粒pGEX-1λT,将此重组载体转化大肠杆菌JM109,经PCR、酶切及测序鉴定阳性克隆.用IPTG诱导阳性克隆表达融和蛋白,SDS-PAGE观察表达产物.再通过Western-Blotting鉴定.简化的hPK-5基因的RT-PCR产物为264bp.通过酶切、测序等方法鉴定简化的hPK-5基因正确克隆至原核表达质粒pGEX-1λT中.重组质粒pGEX-1λT/predhPK-5在大肠杆菌中     

HIV-1复合多表位基因的原核表达和多克隆抗体制备

为表达HIV-1复合多表位基因并制备其多克隆抗体.设计引物,以HIV-1标准株全长cDNA序列为模板,PCR扩增获得p24基因片段;合成改造后的多个表位基因MEG并且与p24片段相连接,克隆入大肠杆菌.将测序正确的p24MEG基因克隆入原核表达载体pET32a并诱导表达.采用Ni2 -NTA亲和柱纯化目的蛋白,以p24抗体对纯化蛋白进行Western-blot分析.将纯化的融合蛋白免疫家兔制备多克隆抗体.通过PCR成功获得长度为651 bp的HIV-1的p24片段,获得了与多表位基因连接后的p24MEG基因,通过诱导表达,显示在相对分子量约45 000处有预计大小的特异性条带,表明成功表达出融合蛋白.经此纯化的融合蛋白免疫的家兔能产生特异性抗体,其滴度达到1:3 200.纯化的融合蛋白和多克隆抗体为研究新型HIV疫苗奠定一定的理论和实践基础.     

羊布鲁菌外膜蛋白Omp22的原核表达及鉴定

布鲁菌外膜蛋白Omp22与布鲁菌致病性相关,又可诱导机体免疫反应。为进一步研究Omp22的特性,对其进行原核表达,并初步鉴定。根据Genbank序列,设计并合成羊布鲁菌外膜蛋白Omp22引物。以羊布鲁菌M5株基因组DAN为模板,PCR扩增并克隆入原核表达载体pGEX-4T-1中。酶切鉴定正确后,测定序列;将重组质粒pGEX-4T-1-Omp22电转化大肠杆菌DH5α中,诱导表达,并采用羊布鲁菌兔免疫血清,Western-blot初步检测融合蛋白GST-Omp22表达情况和免疫学特性。结果PCR扩增出约660bp目的条带,与预期相符;酶切鉴定和测序结果表明,成功构建了pGEX-4T-1-Omp22原核表达载体;优化诱导温度,结果表明,在25℃诱导表达时,该融合蛋白大部分出现在上清中;Western-blot结果证实,GST-Omp22可与羊布鲁菌兔免疫血清特异性结合。说明成功构建了Omp22蛋白原核表达载体并进行了可溶性表达;该融合蛋白可与羊布鲁菌兔免疫血清特异性结合。Omp22蛋白的表达,为进一步研究布鲁菌的致病机制以及疫苗研制奠定基础。     

青鳉DMY基因的克隆及其在性别鉴定中的应用

提取雄性青鳉成鱼基因组DNA为模板,利用特异性引物,聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增获得1 908 bp的特异性条带.经测序证明为DMY基因片段,其核苷酸序列由3个外显子和2个内含子组成,可连续编码150个氨基酸.建立准确而有效的鉴定任意发育阶段青鳉个体雌雄性别基因型的方法,即利用管家基因——肌动蛋白基因PCR扩增条带的有无验证DNA样本提取和PCR扩增的有效性,同时利用雄性DMY基因的PCR扩增条带的有无鉴定青鳉个体的雌雄性别.对随机选取的成鱼和新生鱼卵样本,应用该方法可成功地鉴定出青鳉个体的雌雄性别.     

Mechanism of gold nanoparticle induced simultaneously increased PCR efficiency and specificity

Gold nanoparticles （AuNPs） have been reported to induce faster heat transfer of polymerase chain reaction （PCR） solution to enhance PCR efficiency. AuNPs can also increase the specificity of PCR by functioning analogously to single-stranded DNA bind- ing protein （SSB）. However, the simple structure of AuNPs makes it difficult to determine how AuNPs affect PCR efficiency and specificity. This study aimed to elucidate the effect of AuNPs on PCR efficiency by altering the denaturation times and annealing temperatures. In addition, comparative study of the effect of AuNPs on PCR inhibition caused by two competitive primers al- lowed investigation of the mechanisms of AuNP-enhanced PCR accuracy. Finally, heat-treated salmon sperm DNA was used to evaluate whether AuNPs could eliminate the inhibitory PCR effect caused by DNA impurities. This study demonstrated that en- hanced thermal conductivity by AuNPs was the main mechanism for increased PCR efficiency and specificity. AuNPs promoted efficient double-stranded DNA template unwinding and dissociation between mismatched primers, DNA fragments and template, and enhanced PCR efficiency and specificity simultaneously. Thus, this significant finding suggests the future use of AuNP-assisted PCR in different fields, especially in rapid clinical diagnosis and screening by PCR.     

建立实时荧光PCR快速鉴定鸡制品中鸡伤寒沙门氏菌的方法

建立基于Taqman探针实时荧光PCR检测鸡伤寒沙门氏菌(Salmonella gallinarum)的方法.根据GenBank公布的鸡伤寒沙门氏菌基因序列,设计引物和Taqman探针,采用实时荧光PCR进行特异性、灵敏性及模拟样品的检测实验.结果表明:特异性引物和探针可从34株鸡伤寒沙门氏菌菌株、26株其他血清型沙门氏菌和7株非沙门氏菌菌株中检测出全部的34株鸡伤寒沙门氏菌.以鸡伤寒沙门氏菌梯度稀释菌液DNA为模板进行实时荧光PCR实验,菌株模板浓度与Ct值呈良好线性关系,线性系数(R2)为0.999,扩增效率为88.2%,最低检测浓度为5cfu/mL.对已接种鸡伤寒沙门氏菌的模拟样品同时进行实时荧光PCR检测和传统方法鉴定,两者结果一致.该方法特异性好、灵敏度高,是快速鉴定鸡伤寒沙门氏菌的有效方法.     

PCR产物计算公式的推导与修正

从PCR放大产物的形成和组成特点入手，推导出基因组特异DNA序列扩增倍数的理论计算公式，即Yn=An（1＋X）^n，其中Y表示放大后的DNA片断拷贝数，x表示各反应周期的平均放大效率，n代表循环次数，An为反应周期系数。     

线粒体基因种属鉴定复合扩增体系

针对cyt b基因和ND6基因序列,设计两对引物,以14种常见动物（包括人）生物性检材为对象进行PCR扩增,产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）、硝酸银染色进行分析。结果证明,两条电泳条带者为人样本,分别是cyt b基因片段（358 bp）和ND6基因片段（181 bp）;一条电泳条带者为动物来源,是358 bp cyt b基因片段。在37.5μL PCR反应体系中最小检出模板量为0.25 pg基因组DNA。检材在4℃、室温和37℃温度下,经过4个月后均可获得正确的种属区分。高度潮湿环境中放置50 d的检材、形成于水泥地面、墙面、泥土等基质上的血痕,本方法可得到正确区分。由此建立的种属鉴定的线粒体基因复合扩增体系,其检测片段短、灵敏度高、操作简易,适合法医学上微量、降解、陈旧检材的种属判定。     

RT—PCR检测草鱼呼肠孤病毒的方法研究

草鱼呼肠孤病毒（Grass carp reovirus,GCRV）为草鱼出血病的病原．本实验根据GenBank中GCRV和其他水生呼肠孤病毒毒株的第六基因片段,在其保守区设计了一对GCRV特异性引物,建立了快速检测GCRV的逆转录聚合酶链式反应（RT—PCR）方法．该PCR体系中,上下游引物的最适终浓度为120nmol／L,最适退火温度为52℃．PCR特异性试验表明：所设计的引物只能扩增GCRV的核酸,而不能扩增嗜水气单胞菌BSK-10、WSSV以及正常CIK细胞的DNA或RNA．敏感性试验表明,当GCRV的反转录模板稀释至5-7时,PCR结果还为阳性．用所建立的RT—PCR方法对5份样品进行检测,结果表明本研究建立的RT—PCR检测方法可靠且可行．     

单引物PCR扩增DNA指纹图谱的稳定性研究

以人胶原蛋白基因下游一段ＤＮＡ的互补序列设计引物，对人染色体ＤＮＡ进行单引物ＰＣＲ扩增，在低温退火的条件下，这种引物与ＤＮＡ模板的一处完全配对，并且可以随机地结合在其他一些位置上。由此进行单引物ＰＣＲ扩增，它们的扩增产物形成了稳定的引物－模板特异的ＤＮＡ指纹图谱。本文所建立的单引物ＰＣＲ扩增技术在类似的研究中均可获得稳定的实验结果，具有一定的应用价值。     

东亚正钳蝎毒素基因BmKbpp的原核表达及其抗菌功能初步鉴定

一级结构分析和二级结构预测表明无二硫键蝎毒液多肽(NDBPs)BmKBPP具两亲性α-Helix结构,含有大量带净正电荷的碱性残基(Arg和Lys),符合多价阳离子抗菌肽的典型特征。采用PCR法和质粒载体pGEX-5X-1构建BmKbpp、EGFP及BmKbpp/EGFP与GST的原核融合表达载体,3个表达载体与pGEX-5X-1分别在Rossetta(DE3)菌中进行表达,并测定4个Rossetta(DE3)表达工程菌诱导表达的生长曲线。结果表明,BmKBPP是一个具有很强抑菌功能的抗菌肽,GST、BmKBPP及EGFP3个蛋白一起融合表达可获得少量蛋白的表达,这将为后续的功能研究和应用研究奠定基础。     

草地早熟禾ISSR-PCR反应体系优化

采用正交设计和单因子试验结合的方法,优化适合于草地早熟禾的ISSR体系。对影响ISSR-PCR的多个因素,包括MgCl2、dNTP、Primer、TaqE的浓度和用量进行优化,同时,对DNA模板浓度、引物退火温度进行筛选。确定草地早熟禾的最佳ISSR-PCR反应体系为：94℃预变性5min,94℃变性30 s,Tm值退火45 s,72℃延伸90 s,35个循环,最后72℃延伸10 min,4℃保存;20μL反应体系包括2μL10×Buffer,0.96μL dNTP（2.5×10^-3mol.L^-1）,1μL Primer（1.0×10^-5mol.L^-1）,0.2μL Taq酶（5 U.μL^-1）,1μL Template DNA,14.84μL H2O。     

人类PIF1蛋白质N-末端多肽的表达纯化和生物学活性研究

解螺旋酶参与几乎体内所有的DNA代谢,具有重要的生理功能。为了从分子水平阐述人类PIF1解螺旋酶的生理功能,我们以HeLa细胞的cDNA文库为模版,PCR扩增得到PIF1基因5’端含有1～534核苷酸的cDNA序列一PIFAC。在PIF△C的5’端引入六组氨酸标签后插入pET15b表达载体,得到重组质粒pET15-PIF△C。以此重组质粒转化Rosetta TM2（DE3）感受态细胞,使PIFAC蛋白质在大肠杆菌中得到表达。在4℃通过快速液相色谱纯化系统,通过一系列色谱层析柱纯化了PIFAC蛋白质。以纯化的PIFAC蛋白质免疫家兔制备了抗血清,并检测了纯化的PIFAC的生物化学活性。结果显示不含解旋酶模序的人类PIF1蛋白质的N-末端,具有使单链DNA复性的特性。PIF1解螺旋酶具有解开DNA双链和使双链DNA复性这一矛盾的特性,暗示了人类PIF1解螺旋酶可能参与损伤DNA的修复,包括断裂的双链DNA的修复。     

关于丢番图方程px~4-（p-1）y~2=z~4

对任意的奇素数p,还没有找到给出丢番图方程px4-（p-1）y2=z4的全部正整数解的统一的初等方法,目前只解决了某类特殊的奇素数p的求解问题,例如王洪昌等人完全解决了p-1=Q2;或2Q2;或qQ2,2｜Q,q≡3（mod4）为奇素数,Q为正整数的情形.认为对某类特殊的奇素数p求解丢番图方程px4-（p-1）y2=z4,目的是对任意的奇素数p,寻找给出丢番图方程px4-（p-1）y2=z4的全部正整数解的统一解法.当p=2q＋1,q≡5（mod8）,p,q为奇素数时,利用初等方法把方程px4-（p-1）y2=z4化为方程x2＋my2=z2,从而给出方程px4-（p-1）y2=z4的全部正整数解;当q为任意正整数时,上述解法仍然适用,因此对任意给定的奇素数p,实际上已经给出了丢番图方程px4-（p-1）y2=z4的全部正整数解的统一解法.