扩展青霉碱性脂肪酶的克隆、表达及表达产物的活性分析

以扩展青霉为出发菌株,用Biospin RNA Simply P试剂盒提取其总RNA,反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增出扩展青霉碱性脂肪酶结构基因.构建真核重组表达质粒pEL-pIC9,电转化His4缺陷型巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115,利用MD-MM平板及PCR方法筛选和鉴定出重组子,进行甲醇诱导表达.重组子发酵液经SDS-PAGE分析显示获得了分子量约28ku的1条特异条带,用橄榄油检验板法和NaOH滴定法测其活性,酶活可达225U/mL.结果表明,扩展青霉碱性脂肪酶基因在巴斯德毕赤酵母中能高效表达为有脂肪酶活性的高活力酶.     

扩展青霉FS1884脂肪酶基因的定点诱变及其活性分析

为提高扩展青霉FS1884脂肪酶活性,采用一步突变法对脂肪酶(PEL)的基因进行体外M220V定点诱变,然后将其连接到表达载体pPIC3.5K中, 构建重组表达载体pPIC3.5K-M220V-PEL,电转化毕赤酵母GS115中,经甲醇诱导后脂肪酶成功分泌表达.重组脂肪酶的活性分析表明:突变体在毕赤酵母中得到活性表达,获得脂肪酶表达产物PEL-M220V-GS,在35 ℃下具有最高酶活为3 099 U/mg, 比野生型提高了5%.     

扩展青霉(Penicillium expansum)PF898基因组DNA提取方法的比较

利用CTAB法、SDS改进法和SDS快速法3种DNA提取代表性方法,对扩展青霉(Penicillium expansum)PF898基因组DNA的提取进行比较研究.CTAB法提取的DNA样品纯度最高,SDS裂解法制备的DNA得率最高;CTAB法和SDS改进法所得DNA都可直接应用于限制性酶切分析;3种方法所提取的DNA均能满足扩展青霉PF898脂肪酶基因和18S rRNA的PCR扩增.总体而言,SDS法简便、快速、得率高,是一种理想的扩展青霉基因组DNA提取方法.     

卡门柏青霉-PG3脂肪酶基因的克隆、表达及活性分析

以卡门柏青霉-PG3为出发菌株,提取其总RNA,应用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增出860bp左右的片段,核苷酸序列分析表明其与甘油单-双酰酯脂肪酶(MDGL)基因（mdlA）一致。将此基因克隆到原核表达载体pET-28a中,转化大肠杆菌BL21(DE3),经诱导后,重组的脂肪酶（rMDGL）在宿主菌中得到表达,表达量可达菌体总蛋白量的45.2%。重组蛋白包涵体溶解、复性后用Ni²⁺组氨酸结合树脂螯合层析柱纯化,聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)显示为单一区带,其相对分子质量为41 000。以橄榄油为底物时没有检测到酶活性,以单硬脂酸甘油脂为底物时酶活性达到225nmol/s。该基因在原核系统中表达仍具有酶活性,说明MDGL的糖基化对其生物学活性并不是必不可少的。     

扩展青霉碱性脂肪酶cDNA的克隆和表达

采用TRIzol试剂一步法所抽提的总RNA的D（260）／D（280）值为1.82,甲醛变性电泳呈现真核微生物所特有的28S rRNA和18S rRNA条带。根据扩展青霉所产碱性脂肪酶（Lip PE)N末端20个氨基酸残基序列和真核生物mRNA3‘端具有poly(A)等所提供的生物信息,采用RT－PCR技术和3‘－RACE法扩增了Lip PE成熟肽编码区和3‘非编码区的cDNA,直接将该PCR产物克隆至pUCm-T载体中。序列分析表明,该碱性脂肪酶含有258个氨基酸,其中保守的五肽序列为Gly-His-Ser-Leu-Gly。进一步采用Clot Tech公司的SMART^TM PCR cDNA文库构建试剂盒,扩增、克隆和测定了自转录起始点至编码区的cDNA片段,从而完成了Lip EP完整cDNA的分析测定。最后将编码完整脂肪酶蛋白的cDNA克隆至pGEX-5X-3表达载体中,在大肠杆菌BL21中进行IPTG诱导表达,SDS－PAGE检测结果表明,所表达的GST－Lip EP融合蛋白分子质量约为53ku;免疫印迹（Western Blotting)技术证明了所克隆的cDNA确为编码扩展青霉WMC20718脂肪酶的基因。     

扩展青霉(Penicillium expansum)PF868脂肪酶的纯化及氨基酸序列测定

扩展青霉 (P. expansum) PF868所产脂肪酶通过硫酸铵沉淀、DEAE-纤维素柱层析以及Sephacryl 200柱层析等步骤被纯化了74倍,最终比活力为69.7 u/mg.纯化后的脂肪酶经过SDS-聚丙烯酰胺电泳和微内径高效液相色谱仪检测分别达到了SDS-PAGE纯和微内径高效液相色谱纯.分子量经SDS-PAGE确定为28.44 kD. 脂肪酶N-端氨基酸序列测定的结果是:ATADAAAFPD--这与其他一些真菌产的脂肪酶的序列具有较大的同源性.     

基于蛋白质组学的癸醛抑制扩展青霉机制分析

扩展青霉是果蔬采后病害主要致病菌之一,对果蔬产业具有巨大的危害.植物精油主要抑菌成分癸醛能够显著抑制扩展青霉的生长发育,并对扩展青霉诱导的苹果青霉病具有较好的防治效果.利用iTRAQ技术探讨了外源癸醛对扩展青霉蛋白质组水平的影响,结果表明,基于差异表达蛋白分析,癸醛处理能够破坏扩展青霉胞内氧化还原状态的平衡,抑制胞内氨基酸代谢,影响隔膜蛋白的表达和空间结构,进而抑制扩展青霉的生长发育.研究结果为阐明癸醛的抑菌机制提供了理论基础.     

马尔尼菲青霉环腺苷酸依赖性蛋白激酶基因的功能研究

从本实验室早期建立的马尔尼菲青霉cDNA文库中,筛选到了一个编码环腺苷酸依赖性蛋白激酶(cAMP dependent protein kinase)基因cdpk.为了研究这个基因的功能,构建了相应的RNA干扰表达盒(利用gus基因将cdpk基因313 bp的反向重复序列片段隔开,并由受木糖诱导的xylP启动子来调控RNA干扰),通过根癌农杆菌介导转化到马尔尼菲青霉中.对转化子的研究发现,cdpk基因的沉默对菌体细胞的形态、孢子的萌发过程无明显影响,但是却减弱了菌落的生长速度、降低了红色色素的产量、并使马尔尼菲青霉几乎丧失了产孢功能.这暗示着cdpk基因对该青霉孢子的形成是必需的.     

碱性脂肪酶的发酵及提取工艺

对圆弧青霉ＰＧ３７发酵产酶工艺及脂肪酶提取工艺等进行了系统的研究。实验结果表明,２０ｍ３发酵罐在通风量为０．３～０．８Ｖ／Ｖ／ｍｉｎ、搅拌转速为１８０ｒ／ｍｉｎ、发酵温度为２８℃、培养过程中流加棉籽油以控制发酵醪ｐＨ值为６．５～７．０的条件下,发酵８４ｈ左右,成熟发酵醪酶活为４５２０Ｕ／ｍＬ。发酵液经过滤、超滤浓缩、硫铵沉淀、造粒等过程制得颗粒碱性脂肪酶成品,酶的提取总收率在７０％以上,颗粒酶活力单位为５．０×１０４Ｕ／ｇ。     

扩展青霉脂肪酶的纯化及氨基酸序列测定

扩展青霉（Pen.expansum）WMC20718所产碱性脂肪酶经离心分离、硫酸铵沉淀、疏水层析、阴离子交换层析以及凝胶过滤等步骤,其酶纯化了18.5倍,获得了比活性为4200U/mg的纯碱性脂肪酶,提取得率48.8%。纯化后的脂肪酶经过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和高效反相色谱（RP-HPLC）检测,分别达到了SDS-PAGE电泳纯和RP-HPLC色谱纯。经SDS-PAGE和Sephadex G-150凝胶过滤色谱,分别测得酶的相对分子质量为27500和28200,表明该酶以单体形式存在。N末端20个氨基酸残基序列测定的结果为ATADAAAFPDLHRAAKLSSA。该酶的最适作用温度为30℃,在35℃以下稳定,45℃处理30min仅残留30%酶活性;PH稳定范围在6.5-10.5之间,最适PH值为10.0。阴离子表面活性剂LAS对该酶活性的影响较大,而非离子表面活性剂AEO9对酶活性无影响。洗涤剂蛋白酶在规定的添加量范围内,对脂肪酶的活性影响较小。     

扩展青霉（Penicilliumexpansum）PF868脂肪酶的纯化 …

扩展青霉（Ｐ．ｅｘｐａｎｓｕｍ）ＰＦ８６８所脂肪酶通过硫酸铵沉淀纤维素柱层析以及Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ２００柱层析等步骤被纯化了７４倍。最终比活力为６９．７ｕ／ｍｇ。纯化后的脂肪酶经过ＳＤＳ－ＰＡＧＥ纯和微内径高效液相色谱纯。分子量经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ确定为２８．４４ＫＤ。脂肪酶Ｎ－端氨基酸序列测定的结果是：ＡＴＡＤＡＡＡＡＦＰＤ－这与其他一些真菌产的脂肪酶的序列具有国闫的同源性。     

扩展青霉碱性脂肪酶的纯化及N-端氨基酸序列分析

扩展青霉PF898的发酵液经硫酸铵沉淀、DE52纤维素离子交换柱、Sephadex G100凝胶过滤等步骤，其碱性脂肪酶的活性被纯化了79．3倍，回收率约15％，此活为76．9U／mg。纯化蛋白经SDS－PAGE和HPLC TSK－GEL G3000SW凝胶过滤分析显示其分子量约为28kDa。纯化蛋白经氨基酸序列测定仪分析表明，其N－端12个氨基酸的序列为：A－T－A－D－A－A－A－F－P－D－L－H。     

酸木瓜籽产沼气潜力的实验探究

以污水处理厂活性污泥为接种物,以提油后的酸木瓜籽为发酵原料,按一定比例配制成浓度为6%的发酵液在30℃进行批量发酵,测定原料发酵前后的总固体（TS）含量、挥发性固体（VS）含量、pH值和日产气量.结果表明,以提油后的酸木瓜籽为发酵原料发酵,第1天即开始产气,且产气量达到310mL,但甲烷含量低,不能燃烧,第2~6天出现酸化现象,停止产气,随后体系恢复正常连续产气至结束,发酵至第20天的产气量占总产气量的81%左右.酸木瓜籽的TS利用率为27.26%,VS利用率为19.2%,其产气潜力为178g/mL（TS）和185g/mL（VS）.     

基质微生物比对油菜籽饼粕沼气发酵的影响

研究不同基质微生物在以油菜籽饼粕为原料的沼气发酵中对产气性能的影响.在30℃条件下以油菜籽饼粕为发酵原料,分别选取基质微生物比F/M(VS/VS)为0.20、0.15进行批量式发酵.结果表明,基质微生物比F/M(VS/VS)=0.20的实验组TS、VS产气率、总产气量及达到总产气量80%的发酵时间分别为165mL/g·TS、184mL/g·VS、2 310mL和4d,而F/M(VS/VS)=0.15的实验组分别为95mL/g·TS、106mL/g·VS、1 330mL和17d.因此,基质微生物比对油菜籽饼粕的沼气发酵有着较大影响.     

温度、TS对奶牛废物厌氧发酵产气性能影响

为寻找奶牛废物厌氧发酵产气的最佳温度和TS(总固体),本文分别研究了奶牛废物TS为6%、8%和10%的浓度下,温度为30℃、35℃、40℃、45℃、50℃条件下厌氧发酵过程中的pH变化及产气量。结果表明,随着发酵时间的增长,不同TS值下,温度为30℃、35℃、50℃时,pH值由高变低再升高,当温度为40℃、45℃时,pH值则由高稍有降低,后趋于稳定;在温度一定条件下,不同TS值的奶牛废物随时间的产气趋势基本一致,且随着温度的增高,其达到最佳产气的时间越短。综合考虑产气率和能耗,温度为35℃、TS 8%为牛粪厌氧发酵产气的最佳条件。     

芭蕉叶沼气发酵潜力研究

沼气发酵是一项具有潜力的开发新能源的技术,在化石能源需缺的今天,研究沼气发酵技术是十分必要的.为了探究芭蕉叶厌氧消化产沼气的潜力,让废弃芭蕉叶得到充分的利用,响应国家的号召,推进乡村废弃物的资源化利用,寻找一种新型沼气发酵原料.特以芭蕉叶为原料,采用批量发酵工艺,在30℃恒温条件下进行芭蕉叶沼气发酵实验,发酵周期为32 d.结果表明芭蕉叶的产气潜力为428 mL/g·TS和563 mL/g·VS,是一种较好的纤维素类沼气发酵原料.     

菠萝蜜废弃物沼气发酵的实验研究

实验以菠萝蜜的果皮、软皮、果核三种废弃物为发酵原料,采用中温30℃批量发酵工艺,进行沼气发酵。结果表明,菠萝蜜果皮的产气潜力为239mL/g.TS和257mL/g.VS,菠萝蜜软皮的产气潜力为238mL/g.TS和259mL/g.VS,菠萝蜜果核的产气极低。因此,对菠萝蜜的果皮和软皮这两种废弃物进行沼气能源化利用是可行的。     

重组脂肪酶自诱导发酵培养基优化

【目的】优化自动诱导发酵培养基,提高脂肪酶产量。【方法】通过对构建的一株转座子整合型脂肪酶重组菌株,采用自动诱导发酵表达方法,并结合CCD响应面实验设计方法,对自动诱导培养基中的碳源进行优化,获得了1个二次模型用于描述发酵培养基中碳源对产脂肪酶的影响。【结果】优化后的最适自动诱导培养基(W/V)组成为glycerol 2.596,glucose 0.035,lactose 1.289,tryptone 1.0,yeast extract 0.5,Na_2HPO_4·12H_2O 1.79,KH_2PO_4 0.68,NH_4Cl 0.267 5,Na_2SO_4 0.071,MgSO_4·7H_2O 0.05。【结论】发酵试验表明,最优碳源培养基的比活力为R_1=6.35U/mg,比初始发酵培养基提高近3倍。