嗜麦芽假单胞菌质粒pSH1的限制图谱及km^r标记的克隆

对嗜麦芽假单胞菌Ｐ２菌株的质粒ｐＳＨ１进行了限制酶切分析，确定了Ｂｇ１ Ⅱ，ＥｃｏＲ Ⅰ，Ｐｓｔ Ⅰ，Ｘｂａ Ⅰ，ＢａｍＨ Ⅰ，Ｂｇｌ Ⅰ，及Ｐｖｕ Ⅱ共７种限制性内切酶在ｐＳＨ１，质粒上的切割位点，前４种酶均为单一切点，后３种依次为２，７，５个切点。通过双酶切和部分酶切的方法绘制了ｐＳＨ１质粒的限制酶切图谱。将ｐＧＰ１－２质粒上的卡那霉素抗性基因片段插入ｐＳＨ１，获得了重组质粒ｐＳＨ２．ｐＳＨ２     

重组质粒pPAHD1的限制性内切酶图谱分析

本文对我们构建的含有青霉素酰化酶(Acylace)基因的重组质粒pPAHD1进行了限制性内切酶图谱的测绘。使用了限制酶14种,证明BglⅡ,SalⅠ,SmaⅠ和BamHⅠ在重组质粒上各有切点一个;EcoRⅠ有切点两个:HindlⅡ,AvaⅠ各有切点三个;PvuⅠ有切点四个;EcoRⅤ和XmnⅠ各有切点五个。     

短小芽孢杆菌质粒pCJ3的限制酶切图谱

从短小芽孢杆菌A3菌株分离的具四环素抗性质粒pCJ3,经电泳法及氯化铯密度梯度法纯化后在琼脂糖凝胶电泳上得到2条带,经电镜观察及限制酶切割证实是一种质粒的两种构型——超线团及开环DNA分子。纯化质粒用13种限制酶进行酶切试验,发现其中有BamH I、Ava I、Xba I切点1个,EcoR I、Pst I、Bgl I、Hinc Ⅱ及Xho I切点2个、Hinf I、Sal I及Bel I切点3个,Hha I切点5个,Hind Ⅲ没有切点。用BamH I、EcoR I、Ava I及Xba I进行双酶解,并根据双酶解后的琼脂糖凝胶电泳带估算出各个片段的分子量,作出质粒pCJ3的4种限制酶的酶切图谱。     

获得四环素抗性的温敏同源重组载体质粒pRNT15的构建

苏云金芽孢杆菌工程菌株TnX对蚊幼虫具有高毒力,但红霉素抗性基因的存在限制了其商品化.根据转座子Tn917载体的基因序列,利用重叠延伸PCR法克隆同源重组序列到pRN5101上得到pRN15,根据pBU4载体上的四环素抗性基因序列,对pRN15进行改造,使其失去红霉素抗性,获得四环素抗性,载体命名为pRNT15.重组载体四环素抗性的获得,使之扩大了使用范围,也为工程菌株染色体中红霉素抗性基因的敲除奠定了基础.     

获得四环素抗性的温敏同源重组载体质粒pRNT15的构建

 苏云金芽孢杆菌工程菌株TnX对蚊幼虫具有高毒力,但红霉素抗性基因的存在限制了其商品化。根据转座子Tn917载体的基因序列,利用重叠延伸PCR法克隆同源重组序列到pRN5101上得到pRN15,根据pBU4载体上的四环素抗性基因序列,对pRN15进行改造,使其失去红霉素抗性,获得四环素抗性,载体命名为pRNT15。重组载体四环素抗性的获得,使之扩大了使用范围,也为工程菌株染色体中红霉素抗性基因的敲除奠定了基础。     

穿梭质粒pNBC11的构建及性质研究

质粒 pUB110与 pUC18分别册 EcoRI 酶切,T_4DNA 连接酶进行连接,得到重组质粒 pBC11。琼脂糖凝胶电泳分析,该质粒分子量为4.8×10~6道尔顿。pBC11是一种穿梭质粒,能转化大肠杆菌和枯草杆菌,它对大肠杆菌 C600、JM101的转化率分别为:4×10~5、1.5×10~5转化体/μgDNA.对枯草杆菌 BR151、QB1130的转化率分别为1.5×10~3、2.15×10~3转化体/μgDNA。在基因表达方面,pBC11上的 K_m~r 基因能在大肠杆菌和枯草杆菌中复制和表达,但 pBC11的 Ap~r 基因不能在枯草杆菌中表达。     

氧化亚铁硫杆菌质粒pTf—52限制图谱和嵌合质粒pSDF—1的构建

从一株氧化亚铁硫杆菌(Thiobacillus ferrooxidans)中分离到一个分子量为4.5×10~6Md 的质粒 pTf—52,用 Pst Ⅰ、BglⅡ、Kpn Ⅰ酶切此质粒,进行限制性酶切分析,作出了 pTf—52的限制图谱;并将 pTf—52插入到 pBR325的 Pst Ⅰ位点,体外重组,转化 E.coli HB101,构建成一个能够在 E.coli 中进行复制的嵌合质柱 pSDF—1(Tc~rCm~rAp~s),分子量为8.2×10~6Md。经限制性酶切分析,确证 pSDF—1是由 pBR325和 pTf—52重组成的,并确定了这两种质粒在 pSDF—1中的连接方向。     

氧化亚铁硫杆菌启动子片段的克隆及酶切分析

本文利用DNA体外重组技术,将氧化亚铁硫杆菌染色体DNA的Hind Ⅲ酶切片段插入启动子探测质粒pSDSI(Ap~r,Tc~s,5.65kb)的Hind Ⅲ位点上,获得了一批具有启动子活性的染色体DNA片段.其中抗性最强的一株可在240μg/ml的四环素平板上生长,对此抗性最强的质粒pSDRF12进行了限制性酶切图谱分析,并利用其上的PstI和EcoRI位点分别酶切,得到了两个亚克隆pSDRF121和pSDRF122.新构建的两个亚克隆在其氧化亚铁硫杆菌启动子后只有一个Hind Ⅲ位点,可通过该位点插入外源目的基因,进一步观察其表达情况。     

枯草杆菌启动基因在大肠杆菌中的克隆和表达

以大肠杆菌启动基因选择载体pHE5为载体,枯草杆菌染色体DNA为供体,克隆了一批启动基因功能片段,带克隆片段的重组质粒在大肠杆菌中表现不同的四环素抗性水平,其中50%在100μg/ml以上,12%达到200μg/ml。对其中一个转化子进行质粒检测和分析,获得一个重组质粒pHE273,经酶切分析证明,克隆的强启动基因位于2.2kb的EcoRI-HindⅢ片段上。     

邻氯硝基苯降解菌OCNB-1的分离鉴定与降解质粒

以邻氯硝基苯为唯一碳源、氮源和能源,从某化工厂废水处理站活性污泥中分离出一株细菌OCNB-1, 经微生物自动测定仪WSVTK-R07.02和16S rDNA扩增测序初步鉴定为Pseudomonas putida;在培养基pH值为8.0、培养温度为32 ℃、摇床转速为120 r/min的条件下,考察了该菌株降解邻氯硝基苯的能力,发现菌株42 h内将起始浓度为1.07 mmol/L的该化合物降解了约80%;经质粒检测,在OCNB-1菌株中发现一条质粒条带,选用7种内切酶对质粒pOCNB-1进行单酶切,得出质粒大小约为32 kbp;抗生素抗性实验表明菌株对红霉素、氨苄青霉素、青霉素钠的抗性与质粒无关,对利福平、氯霉素的抗性与质粒有关;通过细菌接合,质粒转移到无降解邻氯硝基苯能力的Pseudomonas.stutzeri受体菌中,接合子Pseudomonas.stutzeri能利用邻氯硝基苯为唯一碳源、氮源和能源,证明质粒为降解质粒.     

乳酸菌表达质粒的构建

粪肠球菌是乳酸菌的一个属．采用生物信息学方法,预测了粪肠球菌AS1．2984基因组中乳酸脱氢酶和三磷酸甘油醛脱氢酶的组成型启动子序列．设计引物通过PCR扩增得到这2段启动子序列,并克隆到乳酸菌一大肠杆菌穿梭质粒pNZ8037上,在启动子下游接上绿色荧光蛋白基因作为标记,构建乳酸菌的组成型蛋白表达质粒．通过电转化将上述改造过的pNZ8037质粒导入粪肠球菌中,在共聚焦显微镜中可以观察到绿色荧光蛋白的表达．在乳酸菌MRS培养基中加入乳酸、盐酸、氢氧化钠等试剂,发现可以调节绿色荧光蛋白的表达量．     

棒状杆菌诱发质粒简报

用溴化乙锭诱发质粒，溴化乙锭不同浓度对棒状杆菌基因组起不同作用，低浓度无作用；高浓度消除质粒，适中浓度能诱发质粒，本试验诱发出４种大小不同质粒，转种５代质粒消失。     

水蛭素基因植物表达载体的构建

在不改变水蛭素原氨基酸序列前提前下,根椐植物基因密码子选择偏向,对水蛭素基因序列进行了改造．在设计和合成的水蛭素基因序列中添加了先导链、poly(A)尾、XbaⅠ和SacⅠ双酶切位点．将所合成序列与双元载体pBI121重组,构建成pBI121-hir植物高效表达载体．经抗性筛选法、琼脂糖凝胶电泳和测序3种方法鉴定,该载体构建成功．     

嗜热脂肪芽孢杆菌质粒的研究

从广西各地的八个温泉的水样中分离到２０株耐药的嗜热脂肪芽孢杆菌，用改良的ＢｉｎｇｈａｍＳＤＳ裂解法，从其中的１５株菌中检测到质粒。再用琼脂糖凝胶电泳法及电子显微镜技术对耐氨苄青霉素（２５μｇ·ｍｌ－１）的１２号菌株的质地作了较深入的研究。发现该质粒为共价闭合坏状ＤＮＡ分子（ＣＣＣＤＮＡ），共分子量为１４．６３×１０６，澳化乙锭（１μｇ·ｍｌ－１）和吖啶橙（２０μｇ·ｍｌ－１）共同作用可将该质粒消除掉。该质粒的功能有待进一步研究。     

双基因重组质粒及其应用

近年来，随着生物工程技术的发展，人们已成功地将两种不同目的蛋白的基因构建于同一表达载体。这种双基因载体的构建克服了单一目的基因表达载体的不足．已在农业、医药和生物工程基础理论研究中得到广泛应用。     

反义蜡质基因质粒pWXAB的构建

蜡质蛋白也叫结合颗粒淀粉合成酶 ( GBSS) ,是直链淀粉合成的关键酶 .谷类作物包括小麦其胚乳直链淀粉含量主要由蜡质蛋白水平决定 .研究表明 ,小麦胚乳直链淀粉含量低 ,此小麦面粉生产出的面条韧性大、不粘、适口性好 .因此构建含有反义蜡质基因的质粒 ,通过转基因的方法导入小麦 ,抑制蜡质基因的表达 ,对于提高面条品质和改良淀粉性质 ,获得新品种 ,具有重要价值 .笔者以 Shimad博士惠赠的质粒p WXA2 3和本实验室已有的质粒 p5 1 0为材料 ,构建了一个含反义蜡质基因同时含有 GUS报告基因及抗除草剂基因的新质粒 [1,2 ] .用此质粒转…     

反胶团法萃取质粒DNA

采用新的TOMAC(甲基三辛基氯化铵)/2-乙基己醇/异辛烷反胶团体系,对该反胶团萃取质粒pUT649进行了研究.考察了表面活性剂浓度、离子浓度等对质粒DNA萃取的影响.当采用1.0%(volume)2-乙基己醇/异辛烷为有机相,TOMAC浓度为40 mmol.L-1,水相初始DNA浓度为25μg.mL-1时,质粒pUT649的萃取率可达90%以上.离子浓度对萃取过程有重要影响,反萃取时通过调节水相中的离子浓度,可以实现DNA和RNA的分离.研究结果表明,TOMAC/2-乙基己醇/异辛烷反胶团体系适合于核酸的萃取和纯化.     

碱裂解法提取质粒DNA方法的改进

对碱裂解法提取质粒DNA的方法进行了一些改进 ,在室温下裂解菌体和变性DNA ;用NH4 Ac和LiCl同步沉淀除去样品中的蛋白质和RNA ,降低了对超螺旋质粒的剪切作用 ,得到高质量的质粒DNA。     

制备12 kb重组质粒载体的方法

利用质粒载体pGEM-7Zf(+)克隆了一个长达9224bp的DNA片段,重组质粒大小达到12003bp.该重组质粒可以转化到JM109受体菌中,并且在随后的继代培养过程中具有较高的产量和相当高的稳定性.对于利用质粒载体来克隆DNA片段来说,设计的方法具有普遍的使用价值,对于较大的DNA片段克隆,该方法具有简便、可靠的特点,不仅能够保证克隆成功,而且极大的减少了筛选或鉴定重组菌的工作量.     

质粒主动分配机制的研究进展

高拷贝数的质粒可以通过其较大的数量来保证它的稳定传代,但是低拷贝数的质粒只能依靠其他的方式。其中有一种被称为主动分配机制,含有分配位点。它由两个反式作用蛋白和一个顺式作用类着丝粒位点组成。其中一个蛋白是ATPase,另外一个蛋白是DNA结合蛋白,能够结合到顺式作用位点,并且与ATPase共同作用,形成分配复合物,来介导分配过程。