扇形游仆虫谷胱甘肽过氧化物酶基因克隆和序列特征分析

采用cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术,对纤毛虫原生动物扇形游仆虫(Euplotes vannus)谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)cDNA特征进行分析.获得扇形游仆虫GPx cDNA全长序列,为672 bp,编码182个氨基酸,属硫氧还蛋白超家族,含有3个催化残基和3个特征性基序.氨基酸序列与其他纤毛虫物种同源性较高,亲缘关系较近.     

八肋游仆虫蛋白激酶A的克隆及原核表达分析

为了研究低等真核生物中蛋白激酶PKA(cAMP-dependent protein kinase A)的生物学功能,以八肋游仆虫(Euplotes octocarinatus)为实验材料,通过生物信息学方法分析八肋游仆虫基因组及转录组数据,发现八肋游仆虫中编码蛋白激酶PKAc(PKA催化亚基)的基因只有一种。通过PCR扩增获得游仆虫PKAc基因(EoPKAc),分析表明EoPKAc基因全长1158bp,不含有内含子,开放阅读框981bp,编码326个氨基酸。序列比对结果显示EoPKAc含有与其它已知蛋白激酶相同的11个亚结构域(subdomain)以及一些重要的保守氨基酸。构建原核表达质粒pGEX-6P-1-PKAc,转化至大肠杆菌BL21中,EoPKAc获得高效表达,经GST柱亲和层析后获得较高纯度的EoPKAc蛋白,表达产物经Western blotting检测为阳性。     

扇形游仆虫对细菌及小球藻摄食的初步探讨

选用大肠杜菌及小球藻投喂海洋腹毛目扇形游仆虫,对其摄食习性、种群自然增长率及其间的能量转化进行了观察和探讨。结果显示：游仆虫摄食细菌和小球藻的种群自然增长率分别为０．６４／ｄ和０．３７／ｄ,其能量转化率分别为４４．２％和２１．６％;在适宜密度的细菌和小球藻存在条件下,游仆虫能韧带形成较高的增长率,而不出现显示的诱发生长期。     

八肋游仆虫组织蛋白酶B-1的克隆、表达和性质分析

为研究八肋游仆虫中组织蛋白酶B(cathepsin B,CTSB)的生物学功能,选用组织蛋白酶B-1(EoCTSB-1)为研究对象,通过PCR扩增获得EoCTSB-1的基因。利用生物信息学软件分析表明八肋游仆虫CTSB-1基因全长为980bp,不含有内含子,开放阅读框为862bp,编码286个氨基酸。氨基酸序列比对分析显示八肋游仆虫中组织蛋白酶B-1具有保守的催化活性位点,但缺少信号肽和封闭环结构。构建重组表达质粒pET30a-EoCTSB-1,并转入原核细胞中表达,经镍柱亲和层析以及变复性处理后获得较高纯度的EoCTSB-1蛋白,表达产物利用His-Tag的抗体进行western印迹检测,结果显示阳性。利用底物Z-Phe-Arg-AMC测得EoCTSB-1的最适温度为35℃,最适pH是5.0。     

八肋游仆虫eRF1a的C端是肽链释放因子eRF3的结合区(英文)

真核生物蛋白质合成终止需要两类肽链释放因子,eRF1和eRF3.研究表明八肋游仆虫的两类肽链释放因子在体内和体外都能形成复合物,且第一类肽链释放因子eRF1a与第二类肽链释放因子eRF3的C端结合.为了确定eRF3在eRF1a上的结合区,本研究以八肋游仆虫第一类肽链释放因子eRF1a基因为模板,用PCR的方法获得了N端分别截短140和206个氨基酸的eRF1a片段,同时在这两个片段的3'端融合了编码6个组氨酸残基的核苷酸序列,将这两个序列分别插入原核表达载体pTWIN1,并构建重组表达质粒pTWIN1-eRF1aC1 his6和pTWIN1-eRF1 aC2his6,转入大肠杆菌BL21( DE3)中获得了可溶性表达,通过一步His60 Ni Superflow柱亲和层析,重组蛋白CBD-intein-eRF1 aC1 his6和CBD-intein-eRF1aC2 his6获得纯化.体外pull down分析显示eRF1aC1和eRF1aC2均能与八肋游仆虫第二类释放因子eRF3相互作用,这表明八肋游仆虫eRF1a的C端是肽链释放因子eRF3的结合区.     

纤毛虫胞质微管及大核的FLUTAX-EB荧光标记方法

以游仆虫、尖毛虫和尾柱虫三种腹毛目纤毛虫为材料,在应用FLUTAX方法显示纤毛虫细胞微管结构的标本制备过程中,增加了EB染色的歩骤,使标记纤毛虫细胞皮层微管的同时也显示了细胞核的结构.并提出了实验中对EB浓度及渗透时间等需注意的方面.     

甘肃博峪河自然保护区土壤纤毛虫群落特征

用活体观察和蛋白银染色法对甘肃博峪河自然保护区11个采样点的土壤纤毛虫群落特征进行了研究.共鉴定到76种纤毛虫,隶属于3纲10目29科42属.广布种为陆生拟裸口虫(Pseudoholophrya terricola)、僧帽肾形虫(Colpoda cucullus)、齿脊拟肾形虫(Paracolpoda steini)、膨胀肾形虫(Colpoda inflata)、土壤肾形虫(Colpodaedaphoni)、有肋薄咽虫(Leptopharynx costatus)、刚毛胃纤虫(Homalogastra setosa)、近亲殖口虫(Gonostomumaffine)、苔藓游仆虫(Euplotes muscicola).下毛目为该保护区土壤纤毛虫群落中的优势类群,肾形目和前口目为次优势类群,管口目和寡毛目属罕见类群.研究区C/P系数为0.615,Jaccard相似性系数在0.184～0.532之间.结果分析表明,博峪河自然保护区的生境适宜于土壤纤毛虫的生长与繁殖,各样点土壤纤毛虫物种分布有明显差异,且与各样点小生境密切相关,物种数的差异和较低的Jaccard相似性系数显示出土壤纤毛虫群落分布的异质性具有区块特征.     

伍氏游仆虫皮层微管类细胞骨架的荧光标记

Flutax直接荧光标记和抗α微管蛋白间接免疫荧光标记显示:伍氏游仆虫皮层细胞骨架是以微管为主要成分组成的各纤毛器骨架和骨架附属微管,以及与非纤毛器骨架相互联系形成的立体骨架.整个皮层骨架包括口围带、波动膜、额腹横棘毛、尾棘毛和背纤毛等纤毛器及其骨架、纤毛器基部附属微管和其他皮层微管骨架.伍氏游仆虫细胞背、腹面存在网格结构;细胞背面存在成列的空洞样结构;毛基体周围的玫瑰花样强荧光标记,呈现更加精细的网格结构.结果揭示:与其他腹毛类纤毛虫相比,游仆虫纤毛器有了明显的功能上的"分工";细胞背腹面存在的网格是游仆虫细胞表面的真实结构,是游仆虫细胞皮层微管类细胞骨架的一部分;细胞背面的空洞样结构及毛基体周围的更精细结构,揭示出毛基体基部存在着更加复杂的微管骨架.所得结果有利于进一步揭示微管类胞器的功能.     

崆峒山风景名胜区土壤纤毛虫群落特征

2007年8月至2008年3月,用活体观察和固定染色方法对甘肃太统-崆峒山国家级自然保护区崆峒山风景名胜区土壤纤毛虫的群落特征进行了研究.共鉴定到土壤纤毛虫83种,隶属3纲9目25科35属,其中包括8个未定名种,2个中国土壤纤毛虫新记录种.在针阔混交林、油松林和辽东栎林土壤中各分布有纤毛虫50,35,39种.第一优势类群为前口目,优势度为25.3%;第二优势类群为肾形目和下毛目,优势度均为24.0%.在农田土壤中分布有29种,第一优势类群为肾形目,优势度为27.6%,第二优势类群为膜口目和异毛目,优势度均为17.3%.优势种有小拟匙口虫、有肋薄咽虫、粘游仆虫、苔藓膜袋虫、大弹跳虫、背沟肾形虫、大口薄咽虫、刚毛胃纤虫和透明赭虫.针阔混交林、油松林、辽东栎林、农田4个样点的多样性指数分别为5.96,4.13,5.00,3.30.农田的多样性指数最低,人类活动的干扰导致了土壤纤毛虫物种多样性降低和群落结构简单化.     

小腔游仆虫(Euplotes aediculatus)皮层微管胞器的荧光标记

应用荧光紫杉醇直接荧光标记和抗a-微管蛋白抗体免疫荧光标记,显示了纤毛虫小腔游仆虫(Euplotes aediculatus)皮层纤毛器微管、纤毛器基部附属微管和背皮层表面微管等结构,以及皮层纤毛器微管的形态发生.结果表明,该游仆虫背皮层表面网在形态上与嗜银网相一致,也是一种微管类细胞骨架;与其他几种游仆虫比较,前仔虫口纤毛器和背皮层纤毛器微管的形态发生存在不同的模式,其形态发生可能具有种的特异性,可以作为种的分类依据之一.此外,与FLUTAX(fluorescence taxoid)标记方法相比较,抗α-微管蛋白抗体免疫荧光标记能较清晰地显示游仆虫背皮层表面微管网及早期发生的额腹横棘毛原基和背触毛原基,推测该游仆虫的细胞背表面微管网与其他微管结构其微管蛋白组分可能存在差异,且形态发生中伴随着皮层纤毛器微管的组装和成熟,其微管蛋白组分同时也在不断发生变化.     

嗜热真菌Thermomyces langinosus编码丝/苏氨酸蛋白激酶部分cDNA的克隆及序列分析

根据几种丝状真菌保守的氨基酸序列,设计了一组简并性的引物,从嗜热真菌Thermomyceslanginosus中提取总RNA,利用RT-PCR的方法,我们得到了一个1243bp的cDNA的片段。片段回收纯化后连接到pGEM-Teasy载体上,PCR扩增重组质粒证实这个长约1200bp片段已经插到载体上。序列分析发现和裂殖酵母的蛋白激酶dis1非常相似,比较两者3'氨基酸序列发现同源性达28%以上。其推断的氨基酸序列上包含有6个丝/苏氨酸蛋白激酶的保守亚区。这些都表明它编码的基因可能是一个新的丝/苏氨酸蛋白激酶。     

石蒜凝集素基因的克隆

用石蒜科植物凝集素基因的保守序列为引物，利用RACE－PCR技术从石蒜幼嫩叶片中克隆出石蒜凝集素的全长cDNA，通过比较石蒜同其他石蒜科植物凝集素基因序列和推测的氨基酸序列，发现石蒜凝集素基因编码一具有信号肽的前体蛋白，石蒜凝集素同其他石蒜科植物凝集素一样为具有3个甘露糖专一结合盒的凝集素。     

大熊猫核糖体蛋白S12亚基基因(rpS12)的cDNA克隆及序列分析

根据已报道的部分哺乳动物核糖体蛋白S12亚基基因(rpS12)的相关信息设计引物,运用RT-PCR技术,从大熊猫的肌肉组织总RNA中成功克隆了核糖体蛋白S12亚基基因的表达序列,对其进行了克隆、测序及分析.结果表明:大熊猫核糖体蛋白S12亚基基因的表达序列全长为422bp,开放阅读框(ORF)为399bp,编码132个氨基酸的蛋白质,该蛋白的相对分子质量为1.45×104,PI为6.81,含有1个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点,3个N-豆蔻酰化位点和一个核糖体蛋白S12 signature位点.该基因的表达序列及其编码的氨基酸序列与已报道的部分哺乳动物有很高的相似性.     

Molecular cloning of a full-length cDNA for ECBP21 from Angelica dahurica

ECBP21 is an extracellular calmodulin-binding protein which was first detected and purified from extracellular extracts of suspension-cultured cells of Angelica dahurica. The purified protein was electroblotted onto PVDF membrane and the amino acid sequences from 1 to 20 were determined. Using degenerate oligonucleotides of the sequence, a full-length cDNA coding for ECBP21 was isolated by a combination of RT-PCR and 5′-RACE cloning. The cDNA contains 947 nucleotides and codes for a precursor protein of 216 amino acids. The N-terminal 1-25 amino acid sequence is a predicted signal peptide and the other 26-216 amino acid sequence is a mature peptide. The 26-45 amino acid sequence shows identity with the N-terminal amino acid sequence of purified ECBP21 from Angelica dahurica. The fragment of encoding the mature protein was cloned into pET-28b(+) and transformed into E. coli BL21(DE3). A protein with relative molecular mass 21 ku was expressed in E. coli. Using a biotinylated-CaM gel overlay technique, the expression protein was tested for its ability to bind CaM. The results indicated that the expression protein is a Ca2+- dependent CaM-binding protein. Thus, these results further defined the cDNA clone for ECBP21. This work laid a foundation for elucidating biological functions of ECBP21 by using molecular biological means.     

费尔干猪毛菜液泡膜氢离子焦磷酸酶基因SfVP的克隆、序列分析及表达

植物液泡膜氢离子焦磷酸酶(Vacuolar H+-PPase,VP)能够酸化液泡并为液泡的次级转运系统提供能量,在植物耐盐性方面发挥着着重要作用。本研究采用RT-PCR结合RACE方法,从费尔干猪毛菜中(Salsola ferganica)克隆得到液泡膜质子焦磷酸酶基因SfVP,该基因的cDNA全长2738 bp,包含1个2301 bp的完整开放读码框(ORF),编码766个氨基酸的多肽。氨基酸序列分析表明其属于H+-转运无机焦磷酸酶超家族成员,具有典型的H+-PPase结构域,其疏水性较强,含有12个跨膜螺旋结构。SfVP序列比对显示具有H+-PPase的3个保守序列CS1、CS2和CS3,其中CS1中含有保守的底物催化位点,与烟草的NtVP氨基酸序列相似性为95.3%。半定量RT-PCR结果表明,SfVP的转录表达丰度随着600 mmol/L NaCl处理时间的增加而升高,处理12 h后显著增加并一直维持在较高水平。     

Primary Structural Characterization of Phospholipid Hydroperoxide Glutathione Peroxidase

IntroductionBoth physico-chemical properties and functions ofproteins are based on their primary structure.Theoretical analysis of the primary structure ofproteins will give the structural characteristics ofthe same kind of proteins and provide ideas forfurther experimental research. More than 2 0native or deduced phospholipid hydroperoxideglutathione peroxidase (PHGPX) proteins werefound;three of which were cloned from rice,momordica and radishes in our laboratory[1 ,2 ] .There is a need to…     

猪色素上皮衍生因子的电子克隆及序列分析

用鼠的色素上皮衍生因子cDNA序列在猪的ESTs库进行BLASTn搜索,得到一系列不同大小的ESTs片段,经拼接得到完整cDNA序列.序列分析显示该cDNA长1 425 bp,有一个1 242 bp的开放阅读框,编码413个氨基酸,5’非编码区长53 bp,3’非编码区长130 bp,有一个加尾序列和多聚腺苷酸尾巴.其核苷酸序列与牛、人和鼠的同源性分别为89%、87%和82%,氨基酸的同源性分别为89%、87%和84%,且有保守的糖基化位点、半胱氨酸位点和serp in基序,说明所克隆的cDNA序列为猪的PEDF全长cDNA.     

Molecular cloning of a fulllength cDNA for ECBP21 from Angelica dahurica

ECBP21 is an extracellular calmodulin-binding protein which was first detected and purified from extracellular extracts of suspension-cultured cells of Angelica dahurica. The purified protein was electroblotted onto PVDF membrane and the amino acid sequences from 1 to 20 were determined. Using degenerate oligonucleotides of the sequence, a full-length cDNA coding for ECBP21 was isolated by a combination of RT-PCR and 5′-RACE cloning. The cDNA contains 947 nucleotides and codes for a precursor protein of 216 amino acids. The N-terminal 1–25 amino acid sequence is a predicted signal peptide and the other 26–216 amino acid sequence is a mature peptide. The 26–45 amino acid sequence shows identity with the N-terminal amino acid sequence of purified ECBP21 from Angelica dahurica. The fragment of encoding the mature protein was cloned into pET-28b(+) and transformed into E. coli BL21(DE3). A protein with relative molecular mass 21 ku was expressed in E. coli. Using a biotinylated-CaM gel overlay technique, the expression protein was tested for its ability to bind CaM. The results indicated that the expression protein is a Ca²⁺-dependent CaM-binding protein. Thus, these results further defined the cDNA clone for ECBP21. This work laid a foundation for elucidating biological functions of ECBP21 by using molecular biological means.     

旱麦草LEA3基因的克隆与序列分析

为了克隆旱麦草LEA3基因,根据小麦的LEA3基因(GenBank登录号为AY148492)cDNA序列设计引物,以干旱胁迫处理的旱麦草幼苗的cDNA为模板,采用RT-PCR克隆了旱麦草LEA3基因,命名为EtLEA3(GenBank登录号为KJ123698),并对基因及其蛋白进行了生物信息学分析。结果表明:EtLEA3基因的ORF全长为600 bp,编码199个氨基酸,推测的蛋白相对分子量为20.38 ku,理论等电点为9.08。其氨基酸序列与小麦、大麦和山羊草LEA3蛋白的相似性分别为83%、82%和81%。信息学分析表明EtLEA3蛋白具有较高的亲水性,没有跨膜结构。蛋白质二级结构和三级结构预测表明α-螺旋结构占主导,与目前已知的多种植物的LEA3蛋白具有相似的结构功能域。该蛋白含有5个完整的11个氨基酸组成的串联重复单元。这些特征均与第3组LEA蛋白的特征相符合。该研究结果为深入了解该基因的功能和旱麦草抗旱的分子机理提供了基础数据。     

元江普通野生稻金属硫蛋白基因的获得和序列分析

对SMARTTM技术构建的元江普通野生稻叶片cDNA文库进行随机测序,获得了元江普通野生稻的金属硫蛋白基因cDNA序列.该序列全长525 bp,开放阅读框长186 bp,编码62个氨基酸,10个半胱氨酸集中分布在肽链的N端和C端,该蛋白的分子量为6.42 kD,理论等电点为5.21.氨基酸序列(Blastp)同源性分析表明该基因属于金属硫蛋白家族.