八肋游仆虫第一类肽链释放因子eRF1a多克隆抗体的制备、纯化及鉴定

将八肋游仆虫第一类肽链释放因子基因eRF1a克隆入表达载体pRSETc,并在大肠杆菌Bl21(DE3)中进行诱导表达.表达形成的包含体经切胶回收,然后免疫大鼠制备抗血清.所获得的抗血清用Amersham Biosciences抗体纯化试剂盒进行纯化,SDS-PAGE电泳分析表明纯化后的抗体纯度很高.Western blotting印迹和ELISA鉴定结果表明抗体特异性好,效价为1∶5000.     

日本赭纤虫第一类肽链释放因子C端结构域分析

eRF1的C结构域与eRF3的C结构域相互作用对于蛋白质翻译终止过程中的快速反应至关重要.通过计算机同源建模对日本赭纤虫第一类肽链释放因子C结构域Bj-eRF1C进行结构模拟,发现在Bj-eRF1C结构域中有些肽段直接参与了eRF1-eRF3相互作用,特别是Bj-eRF1C结构域中V294和D297位点高度保守.通过定点突变与pull-down分析,表明在Bj-eRF1C结构域中V294和D297是eRF1-eRF3相互作用的关键位点.     

赭纤虫eRF1识别终止密码子特异性功能位点分析

蛋白质翻译终止过程中第一类肽链释放因子(eukaryotic polypeptide release factor,eRF1)识别终止密码子,水解肽酰-tRNA酯键,释放新生肽链,但eRF1识别终止密码子的机制尚不清楚。纤毛虫eRF1识别密码子的特异性为研究该机制提供了理想的材料。分析了赭纤虫(Blepharisma japonicum)eRF1的N端结构域中与密码子识别有关的关键的氨基酸。预测发现赭纤虫和酵母eRF1的一些与密码子识别有关的氨基酸被磷酸化修饰的几率很高,且二者磷酸化修饰的氨基酸位点有所差异。利用点突变方法向赭纤虫eRF1的N端引入与酵母eRF1一致的磷酸化位点时(N23S/D25E/A70S/Q115E),其识别终止密码子的特异性发生改变,由UAA/UAG识别特异性转变为UAA/UAG/UGA三个密码子全识别。说明这些位点磷酸化可能参与调节eRF1识别终止密码子的功能。     

八肋游仆虫第一类肽链释放因子eRFla多克隆抗体的制备、纯化及鉴定

将八肋游仆虫第一类肽链释放因子基因eRFla克隆入表达载体pRSETc,并在大肠杆茵B121(DE3)中进行诱导表达.表达形成的包含体经切胶回收,然后免疫大鼠制备抗血清.所获得的抗血清用Amersham Biosciences抗体纯化试剂盒进行纯化,SDS-PAGE电泳分析表明纯化后的抗体纯度很高.Western blotting印迹和ELISA鉴定结果表明抗体特异性好,效价为1 5 000.     

赭纤虫第一类肽链释放因子C端结构域的磷酸化修饰

真核生物中第一类肽链释放因子(eukaryotic polypeptide release factor,eRF1)的C端结构域对终止密码子的识别有重要的作用。为了探讨日本赭纤虫(Blepharisma japonicum)eRF1的C端结构域的磷酸化修饰,本实验将构建好的含有赭纤虫C端基因的重组质粒,在大肠杆菌中可溶性表达,该蛋白用碱性磷酸化酶处理。通过非变性PAGE电泳和Western blotting,实验发现C端蛋白由二条带(低的是磷酸化形式)变成了一条带(去磷酸化形式)。表明该结构域在大肠杆菌细胞中被磷酸化。     

八肋游仆虫ARF1蛋白的表达纯化及其与嘌呤核苷酸的相互作用

ADP核糖基化因子1(ARF1)是Ras超家族的成员,调控细胞内囊泡运输,进而影响细胞的生长发育。为了研究单细胞真核生物八肋游仆虫ARF1的功能,构建了重组表达质粒pET28a-ARF1,在大肠杆菌BL21中进行了表达纯化,获得高纯度的八肋游仆虫腺苷酸核糖基化因子1蛋白EoARF1,随后通过荧光光谱法检测了其与嘌呤核苷酸的相互作用。结果表明,表达纯化的EoARF1蛋白能与嘌呤核苷酸发生相互作用,其结合位点数n约等于1,且与鸟嘌呤核苷酸作用强弱顺序为GTPGDPGMP,与GDP的结合强度明显大于与ADP的结合强度。     

八肋游仆虫组织蛋白酶B-1的克隆、表达和性质分析

为研究八肋游仆虫中组织蛋白酶B(cathepsin B,CTSB)的生物学功能,选用组织蛋白酶B-1(EoCTSB-1)为研究对象,通过PCR扩增获得EoCTSB-1的基因。利用生物信息学软件分析表明八肋游仆虫CTSB-1基因全长为980bp,不含有内含子,开放阅读框为862bp,编码286个氨基酸。氨基酸序列比对分析显示八肋游仆虫中组织蛋白酶B-1具有保守的催化活性位点,但缺少信号肽和封闭环结构。构建重组表达质粒pET30a-EoCTSB-1,并转入原核细胞中表达,经镍柱亲和层析以及变复性处理后获得较高纯度的EoCTSB-1蛋白,表达产物利用His-Tag的抗体进行western印迹检测,结果显示阳性。利用底物Z-Phe-Arg-AMC测得EoCTSB-1的最适温度为35℃,最适pH是5.0。     

八肋游仆虫蛋白激酶A的克隆及原核表达分析

为了研究低等真核生物中蛋白激酶PKA(cAMP-dependent protein kinase A)的生物学功能,以八肋游仆虫(Euplotes octocarinatus)为实验材料,通过生物信息学方法分析八肋游仆虫基因组及转录组数据,发现八肋游仆虫中编码蛋白激酶PKAc(PKA催化亚基)的基因只有一种。通过PCR扩增获得游仆虫PKAc基因(EoPKAc),分析表明EoPKAc基因全长1158bp,不含有内含子,开放阅读框981bp,编码326个氨基酸。序列比对结果显示EoPKAc含有与其它已知蛋白激酶相同的11个亚结构域(subdomain)以及一些重要的保守氨基酸。构建原核表达质粒pGEX-6P-1-PKAc,转化至大肠杆菌BL21中,EoPKAc获得高效表达,经GST柱亲和层析后获得较高纯度的EoPKAc蛋白,表达产物经Western blotting检测为阳性。     

中心蛋白3定位于游仆虫细胞中形成棘毛的基体上

中心蛋白与中心体(或基体)有着密切关系,作为一种细胞骨架蛋白,形成原生动物巨大的细胞骨架网络;为了研究从八肋游仆虫细胞中克隆到的一种中心蛋白基因(EoCen3)的功能,我们构建了八肋游仆虫细胞大核人工染色体pBTub-Tel,定位分析该基因所表达的中心蛋白在细胞中的分布和行为.该人工染色体利用密码子优化的增强型绿色荧光蛋白基因作为标记,在八肋游仆虫细胞中实现高表达,避免用抗生素作为标记对该细胞的喂养产生影响.定位结果显示,该类中心蛋白特异定位于游仆虫形态发生过程中的基体上.在八肋游仆虫无性生殖细胞分裂的起始阶段基体开始发育,首先形成第一个基体,Eo-Cen3定位于新形成的基体中;随后基体开始复制,EoCen3定位于正在复制的基体中.在细胞发育过程中绿色荧光标记的基体成倍增加,说明EoCen3与参与棘毛形成的基体的复制有一定的关系.     

八肋游仆虫信息素在大肠杆菌中的表达

信息素在八肋游仆虫接合生殖过程中起着重要的诱导配对作用，为了进一步研究其诱导机制，根据已知的基因序列，应用PCR技术，扩增信息素G3基因，并将该基因插入表达载体pGEX-6P1中，构建了重组表达质粒pGEX-6P1-G3．重组菌在37℃下，经1．0mmol／L IPTG诱导，12％SDS-PAGE分析，在37kDa处出现明显的特异目的带。     

Glu101对保持中心蛋白正常构象作用的研究——光谱法研究稀土离子与八肋游仆虫中心蛋白作用对蛋白构象的影响

通过位点直接突变法将八肋游仆虫中心蛋白101位保守的Glu突变成Lys,得到突变蛋白E101K.利用疏水性探针TN S研究了突变对Tb^3＋与蛋白作用时蛋白构象变化的影响.结果表明,相对于钙饱和的蛋白,铽的饱和对蛋白构象变化的影响更大.同时,共振光散射研究表明,Glu101对保持蛋白适当的构象变化行为起着至关重要的作用.     

酿酒酵母金属硫蛋白的表达、纯化及活性检测

通过PCR从酿酒酵母基因组DNA上扩增得到酿酒酵母基因CUP1编码的金属硫蛋白序列.将其编码序列克隆到质粒pTWIN1构建重组表达质粒pTWIN1-MT,转化大肠杆菌感受态细胞ER2566.重组融合蛋白CBD-intein1-MT在IPTG的诱导下得到表达,经SDS-PAGE和蛋白质印迹鉴定.用重组菌分别进行铜离子耐受...     

重组人甲状旁腺激素(1-34)在大肠杆菌中的表达与纯化

将化学合成的rhPTH(1-34)基因用PCR扩增后,克隆至表达载体pET-35b( ),使rhPTH(1—34)融合于纤维素结合结构域(CBDdos)的羧基端,并得到高效表达．融合蛋白经纤维素树脂亲和层析纯化后,经Factor Xa裂解释放出rhPTH(1-34),再通过纤维素树脂亲和层析、C4反向高效液相色谱纯化得到rhPTH(1-34)纯品．每升培养液可获取3mg高纯度的rhPTH(1-34)．经质谱测定,所得样品的分子量为4117．0Da,与rhPTH(1—34)理论分子量一致．     

高频等位基因HLA-A*1101重链胞外域-BSP融合蛋白原核表达载体的构建及表达鉴定

目的:构建HLA-A*1101重链胞外域羧基端融合生物素化酶B irA底物肽(BSP)的融合蛋白(HLA-A11-BSP)原核表达载体,并在大肠杆菌中表达该融合蛋白。方法:以RT-PCR法扩增并克隆HLA-A*1101重链基因的cDNA,以PCR方法构建HLA-A11-BSP的表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,并以免疫印迹法进行鉴定。结果:从HLA-A2阴性的供者外周血单个核细胞中克隆到HLA-A*1101重链基因的cDNA,以此cDNA为模板,将编码HLA-A*1101重链胞外域1~276序列与编码BSP的序列融合,构建HLA-A11-BSP融合蛋白表达载体,重组质粒经测序验证。融合蛋白在BL21(DE3)中诱导后获得高效表达,约占菌体总蛋白的20%;其相对分子质量约为35 000,与理论值一致。免疫印迹分析显示表达产物主要存在于包涵体中,上清液中几乎无任何产物存在。结论:成功构建表达HLA-A11-BSP融合蛋白的原核表达载体,该融合蛋白在大肠杆菌中以包涵体形式获得高水平表达。     

人穿孔素羧基端肽段的表达纯化与活性鉴定

穿孔素,即成孔蛋白（pore forming protein,PFP),其溶细胞作用与免疫调节和自身免疫病以及其它多种疾病过程中的免疫性病理损伤相关。为得到足够量的PFP建立与之相关的免疫学研究手段用于基础和临床研究,在已克隆人PFP cDNA的基础上,用基因工程方法表达了人PFP C端124个氨基酸肽段（hPFP-C),并通过谷胱甘肽琼脂糖新和层析获得纯化的GST/hPFP-C融合蛋白,经凝血酶酶切和再次北极和层析去除GST部分,得到了纯化的hPFP-C蛋白。纯化的hPFP-C蛋白与兔红细胞共育,呈现钙依赖的溶血活性。     

Molecular cloning, expression and biochemical property analysis of AtKP1, a kinesin gene from Arabidopsis thaliana

Kinesins are common in a variety of eukaryotic cells with diverse functions. A cDNA encoding a member of the Kinesin-14B subfamily is obtained using 3＇-RACE technology and named AtKP1 （for Arabidopsis kinesin protein 1）. This cDNA has a maximum open reading frame of 3.3 kb encoding a polypeptide of 1087 aa. Protein domain analysis shows that AtKP1 contains the motor domain and the calponin homology domain in the central and amino-terminal regions, respectively. The carboxyl-terminal region with 202 aa residues is diverse from other known kinesins. Northern blot analysis shows that AtKP1 is widely expressed at a higher level in seedlings than in mature plants. 2808 bp of the AtKP1 promoter region is cloned and fused to GUS. GUS expression driven by the AtKP1 promoter region shows that AtKP1 is mainly expressed in vasculature of young organs and young leaf trichomes, indicating that AtKP1 may participate in the differentiation or development of Arabidopsis thaliana vascular bundles and trichomes. A truncated AtKP1 protein containing the putative motor domain is expressed in E. coil and affinity-purified. In vitro characterizations indicate that the polypeptide has nucleotide-dependent microtubule-binding ability and microtubule-stimulated ATPase activity.     

Expression of E1 gene of a hepatitis C virus inE. coli and protein purification

The cDNA containing full encoding region of E1 antigen of HCV was cloned into an expression plasmid pRSETHisB. The recombinant plasmid pRSETE1 was introduced into the BL21 (DE3) strain ofE. coli. The engineering bacteria harbouring the pRSETE1 was cultivated in 2YT medium at 37°C. When the Expression of E1 protein was induced by 1 mmol IPTG, the bacteria was killed and the number of living cell was droped down from 10⁷ to 10³ cell/mL one hour post induction. Suggest that E1 protein is poisoned toE. coli. However, the 26kD polypeptide of E1 fussion protein still synthesized in appropriate condition. The expression level was about 10% of total protein 4 h after inducing. The E1 protin was purified by Ni²⁺-NTA-Agarose column chromatography to homogeneous. The purified E1 protein was sensitive and specific in reaction with anti-HCV antibody in sera. Supported by the Science Committec of Hubei Province Ye Linbai: born in Feb. 1948. Professor     

Cloning,sequencing and structural analysis of a pea cDNA encoding EF-1α

A cDNA library with the capacity of 2.0 × 10⁶ was constructed using mRNA extracted, from gibberellic acid (GA)-treated G2 pea seedlings and a 1.6 kb cDNA with 100 nucleotides of 5′ non-coding region and 223 nucleotides of 3′ non-coding region was obtained by random screening. The DNA fragment contains an open reading frame of 1 344 nucleotides and encodes 447 amino acids. Sequence analysis of DNA and deduced polypeptide demonstrated that it encoded for a pea elongation factor 1-alpha (EF-1α). The functional domains of EF-1α is well conserved and EF-1α can be a good candidate for studying molecular evolution.