超声介导的肿瘤免疫治疗

免疫治疗是一种新兴的肿瘤疗法.与传统的疗法直接杀伤肿瘤不同,免疫治疗是通过激活或增强人体免疫系统,依靠自身免疫功能间接杀灭癌细胞和肿瘤组织的疗法.考虑到肿瘤的异质性和遗传不稳定性,单一的疗法不能达到完全治愈肿瘤的效果.近年来,有研究表明,利用超声可以提高机体对肿瘤的免疫反应强度,加强肿瘤的免疫治疗效果.聚焦超声在破坏肿瘤的同时可以导致机体在原位产生肿瘤碎片和肿瘤相关抗原等物质,增强肿瘤的免疫原性,刺激细胞免疫,诱导机体产生免疫应答.微泡是临床上使用的超声造影剂,微泡的加入可以加强聚焦超声对肿瘤的破坏效果,引发更强的免疫反应.利用超声和微泡的组合还可以打开血脑屏障,促进免疫细胞或免疫治疗药物进入血脑屏障发挥作用.此外,微泡还是一种常用的基因和药物载体,利用超声将负载免疫相关基因或抗原的微泡递送到肿瘤细胞或免疫细胞中,同样可以增强免疫应答反应,提高肿瘤免疫治疗的疗效.     

斯氏假单胞菌Pseudomonas stutzeri A1501氧胁迫下基因表达谱研究

斯氏假单胞菌Pseudomonas stutzeri A1501分离自我国南方水稻田, 在低铵和微好氧条件下能紧密结合在水稻根表, 并侵入根内生长和固氮. 为探讨氧对A1501基因组表达的影响, 利用全基因组芯片技术, 研究不同氧浓度(0.5%, 21%)下A1501基因组表达谱, 结果表明: (ⅰ) 67个基因在高氧浓度下表达上调2倍以上, 其中17个基因的功能未知; (ⅱ) 68个基因在高氧条件下表达, 其中约50%的基因参与固氮或反硝化. 实时定量RT-PCR验证结果表明, 4个编码氧化还原酶的基因和7个编码胞外夹膜多糖和抗原寡糖合成的基因在高氧下表达上调, 其中sodC在高氧下表达上调2.7倍、编码黄素单胺氧化酶相关蛋白的基因PST1610表达上调2.2倍、编码α-酮戊二酸-铁氧化酶族氧化还原酶的基因PST3584表达上调3.2倍、编码NAD依赖型氧化还原酶的基因PST2179表达上调2.9倍. 这些基因及其表达产物可能在A1501氧保护机制中发挥作用.     

棉疫病菌诱导非寄主过敏反应激发子基因的克隆

采用功能筛选策略从以PVX病毒载体建立的棉疫病菌(Phytophthora boehmeriae) cDNA文库中克隆了能诱导烟草产生过敏反应的激发子基因(片段). 以农杆菌Mog101为宿主、利用PVX病毒表达载体构建了含有6800个单克隆的棉疫病菌cDNA文库, 采用牙签接种本氏烟(Nicotiana benthamiana), 从4100个克隆中筛选到12个能引起烟草过敏反应的阳性克隆. 对上述阳性克隆进行序列测定和分析, 结果显示, 其中7个与已知的基因具有较高的同源性, 其中PBC43编码一个特异的elicitin蛋白; PBC163编码一个Rab蛋白, 与大豆疫霉的RAB同源性较高; PBC241编码抗增殖蛋白(prohibitin); PBN62编码一个热激蛋白60 (HSP60). 还有5个克隆在公共数据库中没有同源基因, 提示可能是该病原菌特异的激发子基因. 上述结果表明, 利用病毒表达载体构建cDNA文库, 用功能筛选策略可从棉疫病菌全基因组范围内筛选诱导烟草产生过敏反应的激发子基因, 该方法可望为其他植物病原菌激发子基因的克隆提供技术平台.     

利用分子模拟技术筛选HLA-A2限制性CTL表位肽

以肿瘤抗原MAGE-2为例, 运用分子模拟方法对其4个优势候选HLA-A2限制性CTL表位进行初步鉴定, 再通过多肽结合实验对鉴定结果进行验证. 结果表明, 4个候选肽中有3个与HLA-A2分子有较好的亲和力, 进一步进行体外诱导CTL效应实验显示, 3个高亲和力的表位肽可在体外有效诱导特异性CTL效应. 利用计算机辅助鉴定CTL表位, 克服了以往筛选肽要将肽逐一洗脱下来的繁琐实验过程, 并且可直接观测到多肽复合物的结合模式, 该技术在筛选大量优势CTL表位中具有较大的应用价值.     

利用EST及生物信息学方法挖掘马铃薯中miRNA及其靶基因

microRNA (miRNA)是一类调控真核基因转录后表达的非编码小分子RNA. 大量研究表明, miRNA在调节生物功能方面起着重要的作用. 目前发现miRNA的主要方法有直接克隆法和基于生物信息学的基因搜索和同源搜索. 由于真核生物组织中有些miRNA的丰度较低, 而且其表达具有组织和时序特异性, 采用直接克隆法发现新的miRNA有时较为困难. 采用生物信息学方法寻找未知miRNA是当前发现和鉴定miRNA的重要策略之一. 本研究联合了几种生物信息学方法预测了马铃薯(Solanum tuberosum)中miRNA及其靶基因. 通过把拟南芥、水稻等植物已知的miRNAs与马铃薯EST数据库进行比对搜索, 筛选出候选的miRNA. 之后, 设置一系列严格的筛选标准, 分析候选miRNA序列特征, 包括碱基错配、二级结构、(A+U)含量、能量水平等. 最后, 从上述候选库中筛选出了22个miRNA. 进一步利用新鉴定的miRNA序列, 预测到43个靶基因. 分析结果表明, 上述大多数靶基因编码的产物为转录因子及重要代谢酶类, 它们调控着植物的生长发育, 信号转导及各种胁迫反应.     

CD2胞内区结合蛋白的分子克隆与鉴定

为了探讨ＣＤ２分子的信号传递功能，以编码ＣＤ２胞内区（Ｔｈ４２１１－Ｇｌｎ３３６）肽段的ｃＤＮＡ为“钓饵”，采用酵母双杂交系统从激活的人Ｔ淋巴细胞ｃＤＮＡ文库中筛选与之相互作用蛋白ｃＤＮＡ序列，并采用免疫共沉淀法鉴定该蛋白在体内ＣＤ２胞内区结合的特异性，克隆并鉴定了一个与ＣＤ２胞内区特异性结合的胸内蛋白分子与ｖ－ｆｏｓ转化效应蛋白（Ｆｔｅ－ｌ）同源，Ｆｔｅ－１参与细胞转化、生长、蛋白合成及向线粒体     

重组DNA的研究新进展

本世纪70年代初,美国科学家S. Cohen和H. Boyer等首次在体外成功地组建了具有生物功能的重组质粒,1974年,Morrow等将第一个真核基因即瓜蟾rRNA基因导入大肠杆菌,获得克隆,标志着重组DNA(rDNA)研究的开始。rDNA技术,是在试管内用酶及其他物质使不同物种间的DNA分子彼此结合,然后导入细胞内令其行使功能的技术。它涉及五个方面:1)DNA特异的剪切技术——获取目的基因;2)核酸分子杂交技术——鉴定未知核酸分子;3)DNA的分子克隆——目的基因的扩增;4)DNA顺序测定——确立基因的精细结构和功能的关系;5)目的基因的表达——产     

转座元件介导的苯胺代谢基因簇的筛选和鉴定

利用苯胺不完全降解时中间代谢产物, 如邻苯二酚等的显色反应, 建立了简便快速的苯胺代谢途径相关基因的功能筛选方法. 从苯胺降解菌株AD9的基因组文库中筛选得到3个阳性重组子pDA1, pDB2和pDB11. AD和C23O酶活测定结果表明, pDA1和pDB11分别含有功能完整的苯胺双加氧酶或邻苯二酚双加氧酶编码基因. 经核苷酸序列分析和拼接获得一个大小为24.7 kb, 含25个可读框的苯胺代谢基因簇, 其中含有17个基因与苯胺代谢有关, 包括调控基因tadR, 苯胺双加氧酶基因簇tadQTA1A2B, 邻苯二酚间位裂解途径酶系基因簇tadD1C1D2C2EFGIJKL. 苯胺代谢基因簇两侧含有转座酶和IS1071序列.     

BRCAA1基因克隆、染色体定位与特征性分析

本介绍了一个克隆新的乳腺癌相关抗原基因BRCAAl．它定位于lq^42．1-q^43，它的基因组长度为93．857kb，包含18个外显子与17个内含子．它编码的蛋白由1214个氨基酸组成，相对分子质量为136．8kd，包括10个糖基化位点，含有一个Rb结合蛋白1的抗原表位IKPSLGSKK，潜在的抗原表位可能位于580～620，640-700氨基酸位点之间．它可能是Rb结合蛋白1家族的成员，可能具有调节细胞增殖的功能．     

从灭活病毒诱导的培养细胞中鉴定鱼类抗病毒相关基因

紫外线灭活的草鱼出血病病毒(GCHV)能诱导鲫鱼囊胚培养细胞(CAB)产生高滴度的干扰素并抵抗病毒入侵, 其机制可能是通过诱导一组抗病毒相关基因的表达, 而使寄主细胞建立起抗病毒状态. 利用抑制性差减杂交技术, 构建了灭活病毒诱导鱼类培养细胞基因差异表达的差减cDNA文库. 从差减文库中筛选鉴定出272个差异cDNA片段, 测序分析发现它们为69个基因, 其中46个为已知基因的同源物, 23个为未知的假定基因. 已知基因包括Ⅰ型干扰素信号通路的基因Stat1和Jak1, 抗病毒基因Mx和Viperin, 以及一系列干扰素激活基因或免疫相关基因. 23个未知的假定基因多数具有富含AU成分的序列. 虚拟Northern杂交和RT-PCR进一步证实这些基因在灭活病毒诱导的细胞中差异表达. 意味着灭活GCHV不仅能诱导CAB细胞分泌干扰素, 而且还导致一系列重要抗病毒相关基因或免疫相关基因的表达, 揭示鱼类干扰素系统的信号转导途径和抗病毒机制与哺乳类基本相似.     

人可溶性TRAIL蛋白在衣藻叶绿体中的表达

肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TRAIL)能选择性诱导多种肿瘤细胞凋亡而对正常细胞无毒性. 以衣藻叶绿体基因组的clpP-trnL-petB-chlL-rpl23-rpl2为同源重组片段, 壮观霉素抗性基因为选择标记, 构建了编码TRAIL胞外区可溶性片段(sTRAIL)的cDNA衣藻叶绿体表达载体p64TRAIL, 通过基因枪将其导入衣藻叶绿体中, 经壮观霉素抗性筛选, 获得了3个抗性衣藻转化子. 转化子经过抗性继代筛选后, 经PCR, Southern blot检测分析及暗培养, 证实sTRAIL编码区DNA已整合到衣藻叶绿体基因组中, Western blot检测分析表明, sTRAIL编码区在衣藻叶绿体中获得了表达. Western blot影像摄录分析表明, 表达的sTRAIL蛋白占衣藻细胞可溶性总蛋白的0.43%~0.67%. 实验结果证明, 用衣藻叶绿体作为生物反应器生产医药蛋白是可行的.     

小鼠基因组中犁鼻器受体V2R基因的分布和序列分析

犁鼻器受体1 (V1R)和犁鼻器受体2 (V2R)被认为是哺乳动物犁鼻器中执行信息素感受功能的两个多基因受体超家族, 它们编码7次跨膜的G蛋白偶联受体. 在大鼠和小鼠中已经发现了3个V2R基因家族. 本研究对最近更新的小鼠基因组数据库进行搜索, 获得63个可能的V2R功能基因, 其中新发现了3个V2R基因, 并且这3个基因构成V2R超家族中的一个新家族. 此外, 对这些基因在基因组上的分布以及序列保守性特征进行了分析, 为V2R的功能域研究提供了部分线索, 并将对信息素受体的功能研究和全面揭示信息素感知的分子机制提供一定帮助.     

用酵母双杂交系统筛选与NifA相互作用的蛋白质

利用酵母双杂合系统从巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense)Sp中筛选与NifA有直接相互作用的蛋白质因子. 首先将nifA基因克隆到pGBD-C2载体上, 构建成诱饵质粒pGBD-nifA, 接着将巴西固氮螺菌的染色体DNA构建在pGAD-C1, pGAD-C2和pGAD-C3质粒载体上, 形成3个质粒文库YSPC1, YSPC2和YSPC3. 然后以pGBD-nifA为诱饵, 对YSPC1, YSPC2和YSPC3这3个文库进行了筛选, 得到11个阳性克隆. DNA序列分析表明, 这11个阳性克隆分为4类, 包含4个1~1.3 kb不同的基因片段. 对这4个基因片段进行同源性比较发现, 其中2个编码的蛋白质含有与信号传递有关的PAS结构域, 另外1个基因片段含有与吸收铁有关的fhuE基因, 另一个是未知蛋白. 将这4个基因片段从原来的pGAD载体转移到pGBD载体, 即互换换载体后, 它们仍然与NifA有相互作用; 对这4个基因片段进行移码突变则不再与NifA有相互作用, 说明了它们与NifA相互作用的特异性.     

CD2胞内区结合蛋白的分子克隆与鉴定

为了探讨 ＣＤ２分子的信号传递功能，以编码ＣＤ２胞内区（Ｔｈｒ２１１－Ｇ１ｎ３３６）肽段的ｃＤＮＡ为“钓饵”，采用酵母双杂交系统从激活的人Ｔ淋巴细胞ｃＤＮＡ文库中筛选与之相互作用蛋白的ｃＤＮＡ序列．并采用免疫共沉淀法鉴定该蛋白在体内与ＣＤ２胞内区结合的特异性．克隆并鉴定了一个与ＣＤ２胞内区特异性结合的胞内蛋白分子，与ｖ－ｆｏｓ转化效应蛋白（Ｆｔｅ－１）同源 Ｆｔｅ－１参与细胞转化、生长、蛋白合成及向线粒体转运蛋白质．蛋白数据库检索表明，Ｆｔｅ－１具有蛋白激酶ＰＫＣ的结合与作用位点，提示Ｆｔｅ－１参与ＣＤ２分子介导的信号传递     

人肾癌TIL细胞抗原受体Vβ基因的优势表达

定量聚合酶链反应(qPCR)技术的应用有力地推动了对T细胞抗原受体谱(TCR reper- toire)的研究,已能够以此分析TCR α和β链编码基因V区和J区片段限制性取用(Re-stricted usage)的格局,确定抗原驱动下发生寡克隆扩增的T细胞及其特点,有可能为肿瘤特异性免疫干预开拓新的前景.有关尝试已在人体黑色素瘤、肝细胞癌中获得结果.由于T细胞识别的是抗原肽和MHC分子构成的复合物,以往的研究往往忽略了肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)供者的HLA背景,致使结果不一致.本研究采用qPCR技术分析人体肾细胞癌取用TCR Vβ格局的同时,测定肿瘤细胞表面HLA Ⅰ类抗原表达状况,并作HLA分型.现报告对3例患者的分析结果.     

诱导抗肿瘤反应的肿瘤抗原的鉴定及应用

肿瘤抗原[1](tumor antigen)的存在与发现是肿瘤免疫治疗的基础,在肿瘤免疫反应、免疫耐受、肿瘤标志物检测、肿瘤免疫治疗等方面的作用和应用前景越来越受到人们的关注.本文阐述了近年来肿瘤抗原的研究进展.     

贾第虫4种新的box H/ACA snoRNA的鉴定及其进化意义

通过构建特异性的cDNA文库, 发现并鉴定了4种新的贾第虫box H/ACA snoRNA, 分别命名为GLsR22, GLsR23, GLsR24和GLsR25. 生物信息学分析表明, 这些snoRNA均可形成典型的box H/ACA snoRNA“双茎环”二级结构; GLsR24和GLsR25可能分别指导贾第虫23S rRNA上U1753和U2396的假尿嘧啶化修饰, 而GLsR22和GLsR23属于功能未知的“orphan” snoRNA. 新鉴定的box H/ACA snoRNA均位于蛋白质基因间隔区中, 并且都是由单拷贝基因编码的. 与古细菌及其他原生生物中已发现的同类分子相比, 贾第虫box H/ACA snoRNA具有很多独特特征, 提示snoRNA在从原核生物向真核生物进化的过程中可能有不同的进化路线.     

人肝组织中新的C_2H_2型锌指蛋白编码序列的批量分离与克隆

为了探讨人肝组织中C2 H2 型锌指蛋白基因的分布数目以及克隆新的锌指蛋白基因 ,设计了简并PCR引物 ,扩增基因组DNA ,以其中的 2个扩增片段为探针筛选人肝cDNA文库 ,获得了近百个阳性克隆 .对其中的 2 0个cDNA片段进行了末端测序和同源检索 ,证明 1 5个为新的锌指基因片段 .对其中的 4个cDNA片段进行了组织表达谱分析 ,Northern杂交显示 :L5 5为肝、胰脏高度表达 ;其余为广谱表达 .利用FISH将其中的 2个片段L2_9和L5_5分别定位于 1 9q1 3.3和 1 8q1 2 .1 .     

脱氧核酶在生物检测及基因治疗中的研究进展

脱氧核酶(DNA zyme)是通过体外筛选技术获得的有酶活性的单链DNA分子.随着越来越多的脱氧核酶被筛选出来,科学家对其功能性质的研究也逐渐深入.其中,RNA切割作用作为脱氧核酶最重要的一种特性,是目前研究热点.而脱氧核酶发挥RNA切割作用需要辅因子(金属离子、中性分子、细菌等),因此,基于此特性,DNAzyme不仅被广泛用于金属离子和生物分子检测,而且被应用于特异性切割mRNA阻断蛋白的翻译,从而用于多类临床疾病的治疗.本文系统总结了DNAzyme在金属离子和生物分子检测以及在基因治疗方面的研究进展,并对其在动物体内对目标分子的高灵敏度、低浓度特异性检测及发挥切割活性进而达到疾病治疗做出了展望.     

利用纳米技术提高癌症免疫治疗效果的研究进展

免疫治疗是一种通过增强免疫应答反应,或解除免疫抑制作用来治疗癌症的方法.利用纳米技术能够防止抗原、免疫刺激分子等降解,提高免疫刺激分子等药物在肿瘤部位的富集,改善其生物分布和释放动力学,同时使其靶向作用于肿瘤微环境内的基质细胞、肿瘤细胞和免疫细胞,进行局部免疫调节,从而更有效地治疗癌症和预防全身免疫毒性.本文主要对免疫治疗的现状以及利用纳米技术提高免疫治疗效果的研究进行了总结,并对纳米技术在免疫治疗中应用的挑战进行了分析与展望.